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5 Methoden
5.7.5.3 Agarose-Gelelektrophorese
Zur Analyse der Länge und Qualität der im Light Cycler produzierten DNA-Fragmente wurde
das System der Agarose-Gelelektrophorese verwendet. Zur Herstellung eines Agarosegels
wurde 0,5 x TBE-Puffer mit 1,5 % Agarose in einer Mikrowelle erhitzt, um die Agarose zu
lösen. Nach dem Abkühlen auf ca. 60 °C wurde so viel Ethidiumbromid zu dem noch
flüssigen Agarosegel gegeben, dass eine Endkonzentration von 0,5 µg Ethidiumbromid auf
1 ml Agarosegel erreicht wurde. Danach füllte man dieses Gemisch in ein Gelgießgestell um
und ließ es dort durch Erkalten fest werden. Nach dem Überführen des Gels in eine
Elektrophoresekammer – gefüllt mit 0,5 × TBE-Puffer – wurde das Gel mit den DNA-Proben,
die im Vorfeld zu 1 / 10 mit Probenpuffer versetzt waren, beladen. Zusätzlich wurde auf jedes
Gel 10 µl Längenstandard (100 bp DNA Längenstandard, Invitrogen, D) zur Überprüfung der
Fragmentgröße aufgetragen. Die Agarose-Gelelektrophorese lief mit einer Spannung von
8 V / cm. Die so aufgetrennten DNA-Fragmente wurden mit Hilfe der
Ethidiumbromidfärbung und anschließender UV-Strahlung (322 nm) sichtbar gemacht.
5.7.6 ELISA
Zur Analyse der sezernierten Proteine wurde die Technik des Sandwich-ELISA's (enzyme-
linked immunosorbent assay) angewendet. Dazu wurde ein Antikörper (coating antibody) an
eine feste Oberfläche, hier eine 96-well-Microtiterplatte, gebunden, an den sich das zu
detektierende Antigen heften konnte. An diesen Komplex wurde ein weiterer Antikörper
gebunden, an den Biotin gekoppelt war. Um den hier entstandenen Antikörper-Antigen-
Antikörper-Komplex nachzuweisen, führte man eine enzymgesteuerte Farbreaktion durch.
Dazu wurde zuerst die Meerrettichperoxidase (horseradish peroxidase, HPR) an das Biotin
gebunden. Durch Zugabe des Chromogens Tetramethylbenzidin (TMB) kam es zu einem
Farbumschlag. Die Farbintensität konnte mittels eines ELISA-Readers bestimmt werden.
5.7.6.1 Durchführung nach Biosource
Zur Bestimmung von TNF-α und IL12+p40 wurden fertige ELISA-Kits (Biosource, D)
verwendet. Zuerst wurden je 100 µl des Erstantikörpers (1 µg / ml für IL12+p40, 2 µg / ml für
TNF-α) in eine 96-well-Mikrotiterplatte gegeben und abgedeckt über Nacht bei 4 °C
inkubiert. Diesen Schritt nennt man coaten. Darauf folgte der erste Waschschritt mit je 400 µl
Waschpuffer in einem ELISA-Washer. Mit Hilfe von 300 µl Assay Puffer pro Well wurde die
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