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5 Methoden
5.7.5 Realtime Polymerasekettenreaktion
Zur Quantifizierung von mRNA ist eine funktionierende Analytik notwendig, die Präzision,
Empfindlichkeit und Wiederholbarkeit liefert (Bustin, 2000). Real-time Reverse Transkriptase
Polymerasekettenreaktion (qRT-PCR) ist eine neuartige Methode zur Quantifizierung von
mRNA aus Zellgewebe oder Blut. Der Vorteil gegenüber konventioneller RT-PCR besteht
darin, dass bei dieser Methode die Amplifizierung von Fragmenten und die Analyse in einem
Schritt vollzogen werden. Dies wird durch spezielle fluoreszierende Substanzen
bewerkstelligt, zum Beispiel SYBR Green I (Morrsison et al., 1998), Fluoreszenz-
Resonanzenergietransfer (FRET) (Förster, 1946; Didenko, 2001) oder ABI's TaqMan (Heid et
al., 1996). Die analysierten Gene wurden relativ quantifiziert. Diese Methode basiert auf dem
Vergleich der Expression des Zielgens mit der Expression eines Referenzgens, auch
Housekeeping Gen genannt, das unter den verschiedenen physiologischen Zuständen immer
gleich stark exprimiert wird. Klassische Beispiele sind β-Aktin und Glycerinaldehyd-3-
phosphat Dehydrogenase (GAPDH) (Bustin, 2000). Für die Expressionsbestimmung von
Zytokinen und Rezeptoren primärer Humanzellen eignet sich am besten das Gen humane
δ-Aminolevulinatsynthase (h-Alas), da das Expressionsniveau gleichbleibend und auf der
gleichen Höhe ist wie die analysierten Gene.
5.7.5.1 Durchführung im LightCycler
Im LightCycler (Roche, D) wurde mit Hybridisierungs-Sonden designed von der Firma TIB-
Molbiol gearbeitet. Das FRET-System basierte hier auf der Hybridisierung zweier
fluoreszenz-gebundener Sonden. Dabei waren die Sonden am aufeinander zugerichteten Ende
mit Fluorophoren markiert, die Donor-Sonde mit Fluorescein, die Akzeptor-Sonde mit
LC Red. Da die Intensität der Fluoreszenz stark abhängig vom Abstand der beiden Sonden
war, wurden sie so synthetisiert, dass sie im Abstand von ein bis zwei Basenpaaren an das
PCR Produkt banden. Wurde nun das Fluorescein mittels blauem Licht (470 nm) vom
LightCycler angeregt, gab es die Energie strahlungslos an LC Red weiter. Diese Sonde
emittierte nun rotes Licht (640 nm), welches vom LightCycler gemessen werden konnte. Die
Intensität der Fluoreszenz war abhängig von der Menge an PCR-Produkt.
Die Expressionsstudie wurde mittels QuantiFast TM Probe PCR + ROX Vial Kit durchgeführt.
Der Mastermix bestand aus folgenden Reagenzien:
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