Dokument 1.pdf - OPUS - Universität Würzburg

5 Methoden
Pasteurpipette wurde die Interphase abgenommen und in einem Falcon-Röhrchen gesammelt,
mit HBSS (+ 2 mM EDTA, + 1 % FCS) auf 50 ml aufgefüllt und anschließend bei 300 × g,
10 min und 4 °C zentrifugiert. Dieser Schritt wurde nochmals zum Waschen der Zellen
wiederholt. Daraufhin konnten die Zellen sofort weiterverwendet oder kurz bei 4 °C
aufbewahrt werden.
5.3.2 Einfrieren und Auftauen primärer Zellen
Da für den T-Zellproliferationsassay CD14 + -Zellen und 7 Tage danach CD8 + -T-Lymphozyten
von demselben unbekannten Spender isoliert werden mussten, war es nötig, die PBMCs am
Tag 0 direkt nach der Isolation einzufrieren. Dazu wurden je 1,5 × 10 8 Zellen in 1 ml
Einfriermedium aus humanem Serum mit 8 % DMSO aufgenommen, in gekühlte Kryotubes
umgefüllt und diese in einem Kryoeinfriergerät (Hartenstein, D) sofort zu -80 °C gestellt. Am
nächsten Tag wurden die Zellen in flüssigem Stickstoff gelagert.
Das Auftauen primärer Zellen musste schnell erfolgen. Deshalb wurden die gefrorenen Zellen
in 37 °C warmes HBSS mit 10 % Serum resuspendiert und zu 10 ml frischem HBSS mit 10 %
Serum gegeben. Die Suspension wurde bei 300 × g für 5 min zentrifugiert und im Anschluss
zweimal gewaschen. Nach Bestimmung der Zellzahl wurde mit der Isolation von
CD8 + -T-Lymphozyten begonnen.
5.3.3 Zellzahlbestimmung in der Neubauer-Zählkammer
Die Zellzählung erfolgte mittels einer Lebend-Tot-Färbung durch den Azofarbstoff
Trypanblau, der nur tote Zellen blau anfärbt, da er nicht in lebende Zellen eindringen kann.
Die eigentliche Zellzählung erfolgte mikroskopisch in einer Neubauer-Zählkammer. Auf
dieser Kammer sind zwei 3 × 3 mm große Zählnetze eingraviert, die sich jeweils aus neun
1 × 1 mm großen Quadraten zusammensetzen (Abb. 5.1). Um das Zählen zu erleichtern, sind
diese wiederum in 16 kleinere Quadrate mit 0,25 × 0,25 mm unterteilt. Der Abstand zwischen
Deckglas und Objektträger beträgt 0,1 mm Tiefe. Daraus errechnet sich ein gezähltes
Volumen von 0,1 mm³. Mit Hilfe dieses Volumens, dem Volumen, aus dem das Zellaliquot
für die Zellzählung entnommen worden ist, und der Verdünnung mit HBSS und Trypanblau,
lässt sich die ursprüngliche Zellzahl errechnen:
(Gezählte Zellen / Anzahl Quadrate) × Verdünnungsgrad × Gesamtvolumen / Kammerfaktor
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