Dokument 1.pdf - OPUS - Universität Würzburg

5 Methoden
10 µl 2x QuantiFast Probe PCR Mastermix
1 µl 5 µM forward Primer
1 µl 5 µM reverse Primer
1 µl 3 µM LC-Sonde
1 µl 3µM FL-Sonde
4 µl RNase-freies Wasser
In den Kapillaren wurden zu den 18 µl Mastermix jeweils 2 µl Template oder RNase-freies
Wasser pipettiert. Mit Hilfe eines Adapters konnten die Kapillaren bei 400 × g für 15 sec
zentrifugiert und daraufhin in das Probenkarussell des LightCyclers gesetzt werden. Die
Durchführung der real-time PCR erfolgte unter folgenden Zyklenbedingungen:
Denaturierung: 3:00 min bei 95 °C
Hauptamplifikationsschritt: 45 Zyklen mit je
Kühlung: 0:30 min bei 40 °C
Denaturierung 0:15 min bei 95 °C
Primerannealing 0:10 min bei 55 °C
Elongation 0:05 min bis 0:13 min bei 72 °C
Die Elongation variierte abhängig von der Fragmentlänge des Amplifikats. Sie betrug für
humanes Alas 5 sec, CXCL10 6 sec, TNF-α 7 sec, IL12 p40 und Dectin-1 8 sec, IL10 und
TLR4 13 sec, CCL20 10 sec und TLR2 11 sec.
Für die Messung der SNPs wurde der Mastermix identisch hergestellt und folgende
Zyklusbedingungen angewandt:
Denaturierung: 3:00 min bei 95 °C
Hauptamplifikationsschritt: 45 Zyklen mit je
Schmelzkurve: 1 Zyklus mit
Denaturierung 0:09 min bei 95 °C
Primerannealing 0:15 min bei 55 °C
Elongation 0:20 min bei 72 °C
0:09 min bei 95 °C
0:40 min bei 40 °C
0:00 min bei 85 °C
Kühlung: 0:30 min bei 40 °C
Im letzten Schritt der Schmelzkurve heizt das Gerät mit einem Slope (°C / sec) von 0,1 bei
kontinuierlicher Messung.
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