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5 Methoden
5.8 Konfrontationsuntersuchungen
5.8.1 Analyse der Oberflächenmarker
Zur Analyse der Rezeptoren auf 7-tägigen RAD-DCs im Vergleich zu EtOH-DCs wurden je
1 × 10 6 Zellen für 6 h, 12 h und 24 h mit A. fumigatus Keimschläuchen inkubiert.
Anschließend wurden die Zellen geerntet und wie unter 5.3.11 beschrieben angefärbt. Es
wurden die Einzelfärbung Dectin-1 PE mit Isotypkontrolle IgG2b und die Doppelfärbungen
CD1a FITC / TLR2 PE, CD14 FITC / TLR4 PE und CD14 FITC / HLA-DR-PE mit der
Isotypkontrolle IgG2a FITC / IgG2a PE am Durchflusszytometer vermessen. Zur Analyse der
Reifemarker wurden je 1 × 10 6 Zellen moDCs 36 h mit EtOH-inaktivierten A. fumigatus
Keimschläuchen inkubiert und die Doppelfärbungen CD1a FITC / CD40 PE, CD1a FITC /
CD80 PE, CD14 FITC / CD83 PE, CD14 FITC / CD86 PE und die Isotypkontrolle IgG2a
FITC / IgG1 PE am Durchflusszytometer vermessen.
5.8.2 T-Zell-Proliferations Assay
Serum-Heparin EtOH-DCs bzw. RAD-DCs (5.3.6) wurden generiert und am fünften Tag mit
A. fumigatus (MOI = 1), humanem Cytomegalovirus Antigen pp65 (100 µg / ml, Miltenyi
Biotec, D) oder zur Kontrolle ohne Zusatz für 48 h mit den Zusätzen 10 nM RAD oder EtOH
stimuliert. Anschließend wurden die moDCs geerntet und gewaschen, um bereits
ausgeschüttete lösliche Faktoren und Zytokine zu entfernen, die diesen Assay beeinflussen
könnten, und die Zellzahl wurde bestimmt. Allogenen, frisch isolierten CD8 + -T-Lymphozyten
wurden in AIM-V-Medium mit 0,5 µM CSFE auf 1 × 10 6 Zellen aber mindestens in 3 ml mit
15 µM CSFE 15 min lang bei 37 °C und 5 % CO2 gefärbt. Nach zweimal waschen in AIM-V-
Medium wurden die CD8 + -T-Lymphozyten mit moDCs vermischt. Es wurden jeweils 50 000
moDCs sowie 500 000 CD8 + -T-Lymphozyten (Verhältnis 1 : 10) in einem Gesamtvolumen
von 1 ml AIM-V-Medium (10 % humanes Serum, 10 IU / ml IL2, 75 ng / ml GM-CSF,
15 ng / ml IL-4) aufgenommen und in einer 24-Well Platte ausplattiert. Dazu wurden zwei
Kontrollen ohne moDCs mitgeführt, die erste enthielt nur CD8 + -T-Lymphozyten (negativ),
die zweite CD8 + -T-Lymphozyten, die mit M-Typ Phytohemagglutinin (2,25 % vol / vol,
Invitrogen, D) stimuliert waren (positiv). Nach 2 Tagen wurde zu den Zellen 1 ml AIM-V-
Medium (10 % humanes Serum, 10 IU / ml IL2, 75 ng / ml GM-CSF, 15 ng / ml IL-4)
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