Dokument 1.pdf - OPUS - Universität Würzburg
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5 Methoden<br />
5.3.6 Generierung von Heparin-Serum moDCs<br />
Für den T-Zellproliferationsassay mussten moDCs generiert werden, die nicht mit FCS in<br />
Kontakt gekommen waren, da sie sonst die körperfremden Proteine des FCS an die<br />
T-Lymphozyten präsentieren und diese somit zur Proliferation anregen könnten. Deshalb<br />
wurden CD1a + moDCs in einem serumfreien Medium, dem CellGro (Cell Genix, D),<br />
hergestellt. Zu einer effizienteren Differenzierung wurde dem Medium 120 mg / l Refobacin,<br />
2 % humanes Serum sowie 20 ng / ml IL4, 400 ng / ml GM-CSF und 33 1/3 U / ml Heparin<br />
zugesetzt (Xia, Kao, 2003). Jeden zweiten Tag wurde den Zellen frisches CellGro-Medium<br />
mit Serum und Zytokinen wie am Tag 0 gegeben. Das genaue Vorgehen entsprach dem unter<br />
5.3.5 bereits beschriebenen.<br />
5.3.7 Isolation von myeloiden dendritischen Zellen<br />
In dieser Studie wurden in vitro generierte DCs mit direkt aus dem Blut isolierten myeloiden<br />
dendritischen Zellen (mDCs) verglichen. Die Isolation erfolgte mittels CD1c (BDCA-1) +<br />
Dendritic Cells Isolation Kit (Miltenyi, D) nach optimiertem Protokoll der AG Löffler. Die<br />
Optimierung sah vor, dass alle Reagenzien für die Isolation einzeln und zuerst das FcR-<br />
blocking Reagent dazugegeben wurden, um die Ausbeute und Vitalität zu erhöhen. Der Fc<br />
(= fragment crystallisable) - Rezeptor wird auf Immuneffektorzellen exprimiert. Binden die<br />
Fc-Fragmente eines Antikörpers an dem Rezeptor, setzen natürliche Killerzellen (NK-Zellen),<br />
Eosinophile, Basophile und Mastzellen gespeicherte Mediatoren frei, phagozytieren<br />
Makrophagen und Neutrophile und zuletzt wird das Komplement aktiviert. Durch die<br />
Blockierung des Rezeptors wird verhindert, dass diese akzessorischen Effektorzellen die<br />
mDCs angreifen, nachdem sie den CD1c (BCDA-1) + Antikörper gebunden haben.<br />
Zu je 1,0 × 10 8 der gewonnenen PBMCs (5.3.1) in 400 µl HBSS (+ 2 mM EDTA, + 1 % FCS)<br />
wurden zunächst 100 µl des FcR-blocking Reagent gegeben, gut gemischt und 15 min bei<br />
4 °C inkubiert. Anschließend wurde die Zellsuspension mit HBSS (+ 2 mM EDTA, + 1 %<br />
FCS) auf 20 ml aufgefüllt und bei 300 × g, 10 min und 4 °C zentrifugiert. Das Zellpellet<br />
wurde aufgeschabt, um die Zellen zu vereinzeln, und erneut in 400 µl HBSS (+ 2 mM EDTA,<br />
+ 1 % FCS) resuspendiert. Alle weiteren Wasch- und Resuspensionsschritte erfolgten auf die<br />
gleiche Weise. Zur Depletion der B-Lymphozyten, die wie die mDCs den CD1c Marker<br />
exprimieren, wurden 100 µl CD19 + -MicroBeads zur Zellsuspension gegeben, erneut 15 min<br />
bei 4°C inkubiert, gewaschen und in 1 ml HBSS (+ 2 mM EDTA, + 1 % FCS) resuspendiert.<br />
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