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5 Methoden
5.3.6 Generierung von Heparin-Serum moDCs
Für den T-Zellproliferationsassay mussten moDCs generiert werden, die nicht mit FCS in
Kontakt gekommen waren, da sie sonst die körperfremden Proteine des FCS an die
T-Lymphozyten präsentieren und diese somit zur Proliferation anregen könnten. Deshalb
wurden CD1a + moDCs in einem serumfreien Medium, dem CellGro (Cell Genix, D),
hergestellt. Zu einer effizienteren Differenzierung wurde dem Medium 120 mg / l Refobacin,
2 % humanes Serum sowie 20 ng / ml IL4, 400 ng / ml GM-CSF und 33 1/3 U / ml Heparin
zugesetzt (Xia, Kao, 2003). Jeden zweiten Tag wurde den Zellen frisches CellGro-Medium
mit Serum und Zytokinen wie am Tag 0 gegeben. Das genaue Vorgehen entsprach dem unter
5.3.5 bereits beschriebenen.
5.3.7 Isolation von myeloiden dendritischen Zellen
In dieser Studie wurden in vitro generierte DCs mit direkt aus dem Blut isolierten myeloiden
dendritischen Zellen (mDCs) verglichen. Die Isolation erfolgte mittels CD1c (BDCA-1) +
Dendritic Cells Isolation Kit (Miltenyi, D) nach optimiertem Protokoll der AG Löffler. Die
Optimierung sah vor, dass alle Reagenzien für die Isolation einzeln und zuerst das FcR-
blocking Reagent dazugegeben wurden, um die Ausbeute und Vitalität zu erhöhen. Der Fc
(= fragment crystallisable) - Rezeptor wird auf Immuneffektorzellen exprimiert. Binden die
Fc-Fragmente eines Antikörpers an dem Rezeptor, setzen natürliche Killerzellen (NK-Zellen),
Eosinophile, Basophile und Mastzellen gespeicherte Mediatoren frei, phagozytieren
Makrophagen und Neutrophile und zuletzt wird das Komplement aktiviert. Durch die
Blockierung des Rezeptors wird verhindert, dass diese akzessorischen Effektorzellen die
mDCs angreifen, nachdem sie den CD1c (BCDA-1) + Antikörper gebunden haben.
Zu je 1,0 × 10 8 der gewonnenen PBMCs (5.3.1) in 400 µl HBSS (+ 2 mM EDTA, + 1 % FCS)
wurden zunächst 100 µl des FcR-blocking Reagent gegeben, gut gemischt und 15 min bei
4 °C inkubiert. Anschließend wurde die Zellsuspension mit HBSS (+ 2 mM EDTA, + 1 %
FCS) auf 20 ml aufgefüllt und bei 300 × g, 10 min und 4 °C zentrifugiert. Das Zellpellet
wurde aufgeschabt, um die Zellen zu vereinzeln, und erneut in 400 µl HBSS (+ 2 mM EDTA,
+ 1 % FCS) resuspendiert. Alle weiteren Wasch- und Resuspensionsschritte erfolgten auf die
gleiche Weise. Zur Depletion der B-Lymphozyten, die wie die mDCs den CD1c Marker
exprimieren, wurden 100 µl CD19 + -MicroBeads zur Zellsuspension gegeben, erneut 15 min
bei 4°C inkubiert, gewaschen und in 1 ml HBSS (+ 2 mM EDTA, + 1 % FCS) resuspendiert.
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