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5 Methoden
Die magnetische Auftrennung erfolgte wie unter 5.3.4 erläutert über LS-Säulen, mit dem
Unterschied, dass hier die Negativfraktion, also der Durchfluss, in einem 50 ml Röhrchen
aufgefangen wurde, da die B-Lymphozyten in der Säule haften blieben. Die gewonnene
Suspension wurde erneut gewaschen und in 400 µl HBSS (+ 2 mM EDTA, + 1 % FCS)
resuspendiert. Nach einer Inkubation von 15 min bei 4°C mit 100µl anti-CD1c-Biotin und
einem erneuten Waschschritt wurde zu den Zellen 100 µl anti-Biotin MicroBeads gegeben.
Nachdem die Zellsuspension erneut gewaschen und in 1 ml resuspendiert war, folgte eine
Positivselektion über LS-Säulen (5.3.4). In einem letzten Schritt wurde die Zellzahl bestimmt
(5.3.3). Für Übernachtkultur wurden mDCs in einer Konzentration von 2,0 × 10 6 in 3 ml
RPMI (10% FCS, 120 mg / l Refobacin und 100 ng/ ml GM-CSF) in 6-Well Platten bei 37 °C
und 5 % CO2 inkubiert.
5.3.8 Isolation von CD8 + T-Lymphozyten
Mit dem System der magnetischen MicroBeads (5.3.4) wurden auch CD8 + -T-Lymphozyten
isoliert. Dazu wurde eine Kombination aus dem CD69 MicroBead Kit II und dem CD8 + T
Cell Isolation Kit (Miltenyi, D) verwendet. Das CD8 + T Cell Isolation Kit beruht darauf, alle
Nicht-CD8 + -Zellen magnetisch zu markieren und somit zu depletieren. CD69 ist auf
aktivierten T-Zellen exprimiert und durch die Depletion dieser Zellen wurde sichergestellt,
dass nur ruhende CD8 + -Zellen isoliert wurden.
Dazu wurden pro benötigte LS-Säule 1,0 × 10 8 PBMCs (5.3.1) in 300 µl kaltem HBSS
(+ 2 mM EDTA) aufgenommen und 10 min mit 100 µl CD69 + -Biotin-Cocktail und zugleich
mit 100 µl CD8 + T Cell Biotin-Antibody Cocktail bei 4 °C inkubiert. Anschließend folgte ein
Waschschritt mit 20 ml HBSS (+ 2 mM EDTA) und Zentrifugation bei 300 × g, 10 min und
4 °C. Das Zellpellet wurde aufgeschabt und in 800 µl HBSS (+ 2 mM EDTA) resuspendiert.
Nach Zugabe von 200 µl CD8 + T Cell MicroBead Cocktail folgte eine erneute Inkubation von
15 min bei 4 °C. Darauf wurden die Zellen gewaschen, um die überschüssigen MicroBeads zu
entfernen und in 500 µl resuspendiert. Der Schritt zur Beladung der Säulen wurde, wie unter
5.3.4 beschrieben, durchgeführt, außer dass sich hier die gewünschten Zellen im Durchfluss
befanden, da es sich um eine Negativselektion handelte. Der Durchfluss wurde in 15 ml
Falcon-Röhrchen aufgefangen und die Zellzahl bestimmt (5.3.3).
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