Dokument 1.pdf - OPUS - Universität Würzburg

5 Methoden
Durchführung erfolgte strikt nach dem Protokoll des Herstellers. Zuletzt wurde die
Konzentration der aRNA am NanoDrop (PeqLab, D) vermessen.
5.6.2 Labelling und cDNA Synthese
Um die einzelnen Proben miteinander vergleichen zu können, wurde ein Pool aus allen
verwendeten aRNAs hergestellt. Das Labeln der Proben wurde mittels LabelStar TM Array Kit
(Qiagen, D) nach dem Protokoll Direct Labeling of cDNA with Biotin-dUTP, Cyanine 3-
dUTP, or Cyanine 5-dUTP vorgenommen. Cy3 TM 3dUTP wurde 2 : 5 mit RNase-freiem
Wasser verdünnt, wodurch sich eine Endkonzentration von 8 µM ergab, Cy5 TM 3dUTP wurde
1 : 5 verdünnt, wodurch sich eine Endkonzentration von 4 µM ergab. Für die Synthese
wurden 500 ng aRNA eingesetzt.
5.6.3 Hybridisierung und Analyse
Die vom Labor Dr. Susanne Kneitz bedruckten Epoxy-Slides (Peqlab, D) wurden mit Puffer I
5 min, Puffer II 2 × 2 min und Puffer III 10 min prähybridisiert und 1 min mit Aqua demin.
gewaschen. Danach folgte 15 min Blocken mit 1 × Blocking Solution bei 50 °C und zweimal
Waschen mit je 250 ml Aqua demin. Durch Zentrifugation (130 × g, 5 min) wurden die
Epoxy-Slides getrocknet.
Die aRNA wurde mit 480 µl Hybridisierungspuffer 3 min in kochendem Wasser inkubiert,
bevor sie zum 16-stündigen Hybridisieren bei 42 °C auf die Slides gegeben werden konnte.
Am nächsten Tag wurden die Slides für jeweils 15 min mit Waschpuffer I, Waschpuffer II
und zuletzt Waschpuffer III gewaschen. Danach folgte ein Trockenzentrifugationsschritt
(130 × g, 5 min). Im Anschluss konnten die Slides eingescannt werden (ScanArray 4000,
BioChip Technologies, USA) und die Fluoreszenzintensitäten mit der Software ScanAlyze
(Eisenlab, USA) bestimmt werden.
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