Untersuchungen zum Argininstoffwechsel bei Mycobacterium bovis ...

Aus dem Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin, 

der Tierärztlichen Hochschule Hannover und 

dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und 

Krankenhaushygiene der Medizinischen Hochschule Hannover 

Untersuchungen zum Argininstoffwechsel bei 

Mycobacterium bovis BCG in vitro und im 

Infektionsmodell 

INAUGURAL-DISSERTATION 

Zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin 

(Dr. med. vet.) 

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover 

Vorgelegt von 

Michael Sürken 

aus Leer 

Hannover 2004

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Peter Valentin-Weigand 

Prof. Dr. Franz-Christoph Bange 

1. Gutachter: Prof. Dr. Peter Valentin-Weigand 

2. Gutachter: Prof. Dr. Stefan Schwarz 

Tag der mündlichen Prüfung: 23.11.2004

Inhaltsverzeichnis 

Inhaltsverzeichnis I 

Abkürzungsverzeichnis V 

1. Einleitung 1 

2. Literaturübersicht 3 

2.1. Mykobakterien .............................................................................................................3 

2.1.1. Taxonomie und allgemeine Eigenschaften.............................................................3 

2.1.2. Vorkommen ............................................................................................................5 

2.2. Tuberkulose bei Menschen ........................................................................................5 

2.2.1. Epidemiologie und Bedeutung ...............................................................................5 

2.2.2. Ätiologie und Pathogenese ....................................................................................7 

2.2.3. Klinik.......................................................................................................................8 

2.2.4. Diagnose ................................................................................................................9 

2.2.5. Therapie ...............................................................................................................12 

2.2.6. Impfung ................................................................................................................13 

2.3. Tuberkulose bei Tieren .............................................................................................15 

2.4. Argininstoffwechsel bei Bakterien...........................................................................17 

2.4.1. Der Arginindeiminase-Weg...................................................................................17 

2.4.2. Andere Formen des Argininkatabolismus.............................................................19 

2.5. Zielsetzung der Arbeit...............................................................................................20 

3. Material und Methoden 21 

3.1. Material.......................................................................................................................21 

3.1.1. Bakterien und Plasmide........................................................................................21 

3.1.2. Lösungen und Puffer ............................................................................................22 

3.2. Methoden ...................................................................................................................26 

3.2.1. Anzucht von Bakterien .........................................................................................26 

3.2.2. Präparation von Plasmid-DNA..............................................................................26 

3.2.3. Präparation genomischer DNA aus Mykobakterien..............................................27 

3.2.4. Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen........................................................28 

3.2.5. Agarose-Gel-Elektrophorese................................................................................28 

3.2.6. Transformation von M. bovis BCG und M. tuberculosis .......................................29 

3.2.7. Polymerase-Ketten-Reaktion ...............................................................................29 

3.2.8. Southern Blot-Analyse..........................................................................................30 

3.2.9. Kultivierung der Mykobakterien unter aeroben Bedingungen...............................32 

3.2.9.1. Kultivierung in 7H9-Medium ..........................................................................32 

3.2.9.2. Überprüfung auf Arginin-Assimilation ............................................................32 

3.2.10. Kultivierung der Mykobakterien unter anaeroben Bedingungen.........................32 

3.2.10.1. Überprüfung auf Arginin-Assimilation ..........................................................32 

3.2.10.2. Überprüfung auf Ammoniak-Akkumulation..................................................33 

3.2.10.3. Überprüfung auf Nitratreduktion ..................................................................33 

I

II 

3.2.11. Nitratreduktase-Test...........................................................................................34 

3.2.12. Ammoniaktest.....................................................................................................34 

3.3. Tierexperimente.........................................................................................................36 

3.3.1. Anzucht und Aufbereitung des Infektionsmaterials ..............................................36 

3.3.2. Infektion der Versuchstiere...................................................................................36 

3.3.3. Haltung der Versuchstiere....................................................................................37 

3.3.4. Tötung und Sektion der Versuchstiere .................................................................37 

3.3.5. Aufarbeitung des Sektionsmaterials.....................................................................37 

3.3.6. Bestimmung der Keimdichte in den Organen.......................................................38 

3.3.7. Herstellung von Paraffinschnitten.........................................................................38 

3.3.8. Ziehl-Neelsen-Färbung.........................................................................................39 

4. Ergebnisse 41 

4.1. Untersuchung des Argininstoffwechsels bei M. tuberculosis und BCG .............41 

4.1.1. Aerobe Bedingungen............................................................................................41 

4.1.1.1. Assimilation von Arginin ................................................................................41 

4.1.2. Anaerobe Bedingungen........................................................................................43 


4.1.2.2. Desaminierung von Arginin und Citrullin .......................................................44 

4.2. Untersuchung des Argininstoffwechsels bei ∆arcA M. tuberculosis und ∆arcA 

BCG........................................................................................................................50 


4.2.1.1. Wachstum in Vollmedium ..............................................................................50 




4.3. Komplementation von ∆arcA M. tuberculosis und ∆arcA BCG............................59 





4.4. Vergleich von ∆arcA BCG mit BCG in BALB/c-Mäusen ........................................66 

4.4.1. Quantitative Analyse der Keimdichte von BCG und ∆arcA BCG in den Organen 

von BALB/c-Mäusen ...........................................................................................66 

4.4.1.1. Keimdichte in der Lunge................................................................................66 

4.4.1.2. Keimdichte in der Leber.................................................................................67 

4.4.1.3. Keimdichte in der Milz ...................................................................................68 

4.4.2. Klinische und pathologisch-anatomische Befunde...............................................69 

4.4.3. Pathologisch-histologische Organbefunde...........................................................70 

4.4.3.1. Histologische Beurteilung der Lunge.............................................................70 

4.4.3.2. Histologische Beurteilung der Leber..............................................................74 

4.4.3.3. Histologische Beurteilung der Niere ..............................................................77 

4.5. Erstellung einer ∆narG ∆arcA Doppelmutante in M. tuberculosis .......................79 

4.5.1. Transformation und homologe Rekombination.....................................................80 

4.5.2. Entfernung des Wildtypgens und Überprüfung der Mutanten ..............................82 

4.5.3. Untersuchung der Doppelmutante ∆narG ∆arcA M. tuberculosis ........................84 

4.5.3.1. Anaerobe Bedingungen.................................................................................84 

4.5.3.1.1. Desaminierung von Arginin und Citrullin.................................................84 

4.5.3.1.2. Nitratreduktaseaktivität ...........................................................................86

5. Diskussion 89 

5.1. In-vitro-Charakterisierung der ∆arcA-Mutanten .....................................................90 



5.2. In-vivo-Charakterisierung der ∆arcA-Mutante........................................................94 

5.3. Die ∆narG ∆arcA Doppelmutante ............................................................................96 

6. Zusammenfassung 99 

7. Summary 101 

8. Literaturverzeichnis 103 

Anhang 117 

Abbildungsverzeichnis 125 

Tabellenverzeichnis 127 

Danksagung 129 

III

Abkürzungsverzeichnis 

Abb. Abbildung 

ADI Arginindeiminase 

ADS Albumin Dextrose Natriumchlorid 

AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome 

AS Aminosäure 

ATCC American Type Culture Collection 

BCG Bacille Calmette Guérin 

bidest. zweifach destilliert 

bp Basenpaar 

BSA bovines Serumalbumin 

bzw. beziehungsweise 

ca. circa 

dest. destilliert 

DNA Desoxyribonucleic Acid (Desoxyribonukleinsäure) 

dNTP Desoxynukleotidtriphosphat 

DOTS Directly Observed Treatments Short Course 

E. coli Escherichia coli 

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure 

Fa. Firma 

G.T. gereinigtes Tuberkulin 

h hours (Stunden) 

H. Haemophilus 

HIV Humanes Immundefizienz-Virus 

i.E. internationale Einheiten 

IFN Interferon 

IL Interleukin 

IWGMT International Working Group on Mycobacterial Taxonomy 

LB-Medium Luria-Bertani-Medium 

M. Mycobacterium 

MHC Major histocompatibility complex 

MHH Medizinische Hochschule Hannover 

min minutes (Minuten) 

MOTT Mycobacteria other than tubercle bacilli 

NAD Nicotinamidadenindinukleotid 

NCBI National Center for Biotechnical Information 

NK Natürliche Killerzellen 

NO Stickoxid 

OD optische Dichte 

Ori Origin of Replication 

OTC Ornithin-Carbamoyl-Transferase 

PCR Polymerase Chain Reaction (Polymerase-Kettenreaktion) 

pH potentia hydrogenii 

P. Pseudomonas 

rpm revolutions per minute (Umdrehungen pro Minute) 

RT Raumtemperatur 

s. siehe 

V

VI 

SDS Sodiumdodecylsulfat 

sec seconds (Sekunden) 

SSC Sodiumchlorid/Sodiumcitrat 

ssp. Subspezies 

St. Staphylococcus 

TAE Trisacetat-EDTA 

Taq Thermophilus aquaticus 

tb. tuberculosis 

TB Tuberkulose 

TBC M. tuberculosis-Komplex 

TE Tris-EDTA 

TGF Transforming Growth Factor 

Tm Schmelztemperatur (melting temperature) 

TNF Tumor Necrosis Factor 

U units (Einheiten) 

USA United States of America 

UV ultraviolett 

WHO World Health Organisation (Weltgesundheitsorganisation) 

z.B. zum Beispiel 

ZNS Zentralnervensystem

1. Einleitung 

Nach der Entdeckung des Erregers der Tuberkulose im Jahre 1882 durch Robert 

Koch glaubte man, dem Sieg über diese Krankheit ein gutes Stück näher gekommen 

zu sein. Heute, über 100 Jahre später, ist die Tuberkulose noch immer die häufigste 

tödlich verlaufende bakterielle Infektionskrankheit. 1/3 der Weltbevölkerung trägt den 

Erreger in sich. 2 Millionen Menschen sterben jährlich an den Folgen der 

Erkrankung. Durch die häufige Koinfektion von HIV-Infizierten und das vermehrte 

Auftreten von multiresistenten Erregern ist eine Verschärfung der Situation 

eingetreten. Weltweit steigende Fallzahlen haben die WHO dazu bewogen, 1993 den 

globalen Notstand im Bezug auf die Tuberkulose auszurufen. 

Die Krankheit ist nicht nur auf die ärmeren Weltregionen begrenzt, sondern tritt auch 

vermehrt in den industrialisierten Ländern auf. Durch vermehrten internationalen 

Reiseverkehr und Migration werden auch die multiresistenten Erreger, die so 

genannten MDR-Stämme, aus den „Hot Spots“ wie Südostasien und den Staaten der 

ehemaligen Sowjetunion nach Europa und Amerika importiert. 

Der einzig verfügbare Impfstoff gegen die Tuberkulose ist BCG, ein attenuierter 

Stamm von Mycobacterium bovis, dem Erreger der Rindertuberkulose, mit dem 

mittlerweile mehr als 3 Milliarden Menschen geimpft wurden. Er ist jedoch in die Kritik 

geraten, da in verschiedenen Studien die Schutzwirkung des Impfstoffs in Frage 

gestellt wurde, und er bei immunsupprimierten Personen selbst zu einer schweren 

Erkrankung führen kann. Daher wurden in den letzten Jahren verschiedene Ansätze 

verfolgt, einen neuen Impfstoff zu entwickeln. Dieser sollte eine bessere 

Schutzwirkung als BCG aufweisen, gleichzeitig aber eine höhere Sicherheit 

gewährleisten. 

Die großen Fortschritte in der Gentechnologie in den letzten Jahren und 

insbesondere die Veröffentlichung des kompletten Genoms von Mycobacterium 

tuberculosis führten zu einem besseren Verständnis der Vorgänge bei einer 

Tuberkuloseinfektion. Indem Deletionsmutanten erzeugt werden, denen für die 

Pathogenese wichtige Stoffwechselfunktionen fehlen, versucht man neue Impfstoffe 

zu entwickeln, die die genannten Anforderungen erfüllen. 

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Arginindeiminaseweg (ADI-Weg), 

einem Stoffwechselweg, der dem obligat aeroben Erreger Pseudomonas aeruginosa 

Wachstum unter anaeroben Bedingungen ermöglicht. Dabei wird Arginin als 

1

2 

Energiequelle genutzt. Mycobacterium tuberculosis könnte in der sauerstoffarmen 

Umgebung, in der es im infizierten Organismus vorliegt, einen Nutzen aus diesem 

Stoffwechselweg für seine Persistenz in vivo ziehen. In einer vorangegangenen 

Arbeit wurde eine Deletion in einem Gen von sowohl M. tuberculosis als auch M. 

bovis BCG erstellt. Dieses Gen ist zu 39% homolog zu arcA von P. aeruginosa. Das 

Genprodukt von arcA, die Arginindeiminase, ist das erste von drei Enzymen des ADI- 

Wegs. 

In dieser Arbeit sollen die arcA-Deletionsmutanten zunächst in vitro charakterisiert 

werden. Außerdem soll untersucht werden, ob Mycobacterium tuberculosis und 

Mycobacterium bovis BCG über weitere Enzyme des ADI-Wegs verfügen. Des 

Weiteren soll anhand eines Infektionsmodells überprüft werden, ob der Verlust des 

arcA-Gens einen Einfluss auf die Pathogenität von Mycobacterium bovis BCG in vivo 

hat.

2. Literaturübersicht 

2.1. Mykobakterien 

2.1.1. Taxonomie und allgemeine Eigenschaften 

In der Gattung der Mykobakterien, die zur Familie der Mycobacteriaceae zählt, findet 

man sowohl obligat und fakultativ pathogene Mikroorganismen als auch 

Saprophyten. Sie werden zu den aeroben Bakterien gezählt und unterscheiden sich 

von anderen Bakterien durch ihre Säurefestigkeit, einen G/C-Gehalt der DNA von 61- 

71 mol% und Mykolsäuren, langkettige gesättigte Fettsäuren, die sich durch Pyrolyse 

in 22-26 Kohlenstoffatome große Fettsäuremethylester spalten lassen (LEVY- 

FREBAULT und PORTAELS 1992). 

Die Mykobakterien erscheinen im mikroskopischen Präparat als unbewegliche, leicht 

gekrümmte, sporenlose Stäbchen mit einer Größe von 0,2 – 0,6 x 1 – 10 µm. In 

Kulturpräparaten und Patientenmaterial erscheint Mycobacterium tuberculosis häufig 

in zopfartigen Strängen zusammengelagert, was auf ein Mykosid, den so genannten 

Cord-Faktor, zurückzuführen ist. Für herkömmliche Färbemethoden, wie zum 

Beispiel die Gram-Färbung, sind Mykobakterien aufgrund ihrer Wachshülle 

ungeeignet, und es wird auf Färbungen nach Ziehl-Neelsen und die Auramin- 

Färbung zurückgegriffen. Bei diesen Färbemethoden wird die Säurefestigkeit der 

Mykobakterien ausgenutzt, indem nach der Färbung der Farbstoff aus der 

Umgebung durch eine Säurebehandlung ausgewaschen wird, die Zellwand der 

Bakterien aber angefärbt bleibt. 

Mykobakterien sind nicht nur besonders widerstandsfähig gegen Säure, sondern 

auch gegen zahlreiche andere äußere Einflüsse. Das ist auf den hohen Lipidgehalt in 

ihrer Zellwand zurückzuführen. Die wichtigsten Lipide hierbei sind die Mykolsäuren, 

Mykoside, mykolsäurehaltige Glykolipide und Glykolipid-Peptide. 

So geschützt, weisen die Mykobakterien eine hohe Resistenz gegenüber 

Austrocknung (M. tuberculosis kann monatelang im Staub überleben), extremer Kälte 

und einigen Desinfektionsmitteln auf (HAHN et al. 2001). 

Bei Mykobakterien in Flüssigkulturen kommt es aufgrund der hydrophoben 

Eigenschaften der Wachshülle oft zu einem Wachstum an der Oberfläche, was dann 

zum Eindruck eines schimmelpilzartigen Bewuchses führt. Diese Eigenheit der 

3

4 

Mykobakterien hat ihnen auch zu ihrem Namen verholfen, der vom griechischen 

Wort für Pilz, mykes, abgeleitet wurde (HAHN et al. 2001). 

Die Koloniemorpholgie von Mykobakterien auf festen Nährboden ist variabel. M. 

tuberculosis wächst krümelig, mit gelblich-weißen Kolonien, während M. bovis glatte, 

pigmentlose Kolonien aufweist. 

Das Wachstumsverhalten auf festen Nährboden wurde für eine Einteilung der 

Mykobakterien in zwei Gruppen herangezogen: die der langsam wachsenden und 

die der schnell wachsenden Mykobakterien. Die schnellwachsenden Mykobakterien 

zeigen schon nach 3 bis 7 Tagen unter optimalen Wachstumsbedingungen ein 

makroskopisch erkennbares Koloniewachstum, während die langsam wachsenden 

bis zu 21 Tage inkubiert werden müssen, um ein vergleichbares Koloniewachstum zu 

erreichen. Eine Ausnahme von dieser Unterteilung bildet M. leprae, dessen 

Kultivierung in vitro bisher nicht gelungen ist. 

RUNYON und TIMPE unterteilten die Mykobakterien 1959 aufgrund ihrer 

Wachstumsgeschwindigkeit und Pigmentierung in 4 Gruppen: langsam wachsende, 

photochromogene Spezies (Gruppe1); langsam wachsende, scotochromogene 

Spezies (Gruppe 2); langsam wachsende, pigmentlose Spezies (Gruppe 3) und die 

schnellwachsenden Mykobakterien (Gruppe 4). Es zeigte sich aber, dass nicht alle 

Mykobakterien zweifelsfrei einer dieser Gruppen zuzuordnen waren. Mit 

molekularbiologischen Methoden wurde später nachgewiesen, dass diese Einteilung 

auch einer phylogenetischen Analyse nicht standhielt (ROGALL et al. 1990). 

Heute ist es üblich, verschiedenen Mykobakterienspezies anhand ihrer Pathogenität 

zu gruppieren. Die obligat pathogenen Erreger des M. tuberculosis-Komplex, zu 

denen M. tuberculosis, M. bovis (sowie der attenuierte Impfstamm M. bovis BCG), M. 

africanum, M. microti und M. canettii zählen, stehen dabei der Gruppe der NTM 

(„non-tuberculous mycobacteria“) oder MOTT („mycobacteria other than 

tuberculosis“) gegenüber, zu denen die fakultativ pathogenen Spezies wie zum 

Beispiel M. avium, M. intracellulare (zusammengefasst als M. avium-intracellulare- 

Komplex), M. xenopi, M. marinum und apathogene Spezies wie M. vaccae zählen. 

Unter klinischen Gesichtspunkten lassen sich folgende Risikogruppen unterscheiden 

(BÖTTGER 1991): 

• Risikogruppe I: Apathogene, saprophytäre Mykobakterien, deren Nachweis 

nur in Ausnahmefällen klinische Relevanz hat.

• Risikogruppe II: Fakultativ pathogene Erreger mit Bedeutung bei Patienten mit 

geschwächtem Immunsystem. 

• Risikogruppe III: Obligat pathogene Mykobakterien wie z.B. M. tuberculosis, 

deren Nachweis immer mit einer Erkrankung einhergeht. 

2.1.2. Vorkommen 

Die saprophytär lebenden Umweltkeime stellen die größte Gruppe unter den 

Mykobakterien. Sie wurden schon in Staub (M. fortuitum, M. avium), Acker- und 

Waldböden, Oberflächenwasser von Sümpfen, Klärschlamm, in Schwimmbädern (M. 

marinum führt zum so genannten Schwimmbadgranulom), Aquarien und anderen 

natürlichen und künstlichen Gewässern nachgewiesen. Auch aus Trinkwasser 

wurden Mykobakterien isoliert, zum Beispiel M. gordonae und M. kansasii 

(FISCHEDER et al. 1991). Staub ist zwar nicht als Vermehrungsort der 

Mykobakterien anzusehen, aber trägt sicherlich zu ihrer Verbreitung durch die Luft 

bei (SCHULZE-RÖBBECKE 1993). 

Die obligat pathogenen Erreger wie M. tuberculosis und M. bovis sind aufgrund ihrer 

parasitären Lebensweise auf die belebte Umwelt angewiesen. Das Rind wird als 

Hauptwirt von M. bovis angesehen, aber sowohl viele andere Säugetiere, vor allem 

Wiederkäuer und Schweine, als auch einige Vogelarten und der Mensch sind 

empfänglich (SELBITZ 2002). M. tuberculosis löst in der Regel nur bei Menschen 

und bei Primaten Tuberkulose-Erkrankungen aus, wurde aber auch bei anderen 

Säugetieren nachgewiesen, wie zum Beispiel bei Rindern, Katzen und Hunden. 

Das Erregerreservoir für M. leprae ist der leprakranke Mensch. Bei Tieren ist eine 

echte Lepra nicht bekannt, aber das neunbändige Gürteltier (Armadillo) sowie 

immunsupprimierte Mäuse lassen sich experimentell infizieren (SELBITZ 2002). 

2.2. Tuberkulose bei Menschen 

2.2.1. Epidemiologie und Bedeutung 

Auch heute noch, über hundert Jahre nach der Entdeckung des Erregers der 

Tuberkulose durch Robert Koch, sterben jährlich über 2 Millionen Menschen an 

dieser Erkrankung. 1/3 der Weltbevölkerung ist mit dem Erreger infiziert, 5-10% 

dieser Menschen werden im Laufe ihres Lebens daran erkranken. Jeder Erkrankte 

5

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mit einer unbehandelten Tuberkulose infiziert jährlich 10-15 weitere Menschen. So 

wird jede Sekunde ein Mensch auf der Welt infiziert (WHO 2004). 

In den letzten 15 Jahren sind die Inzidenz und die Prävalenz dieser Erkrankung stark 

gestiegen (STOKSTAD 2000). Dafür werden zum einen verstärkter internationaler 

Reiseverkehr und Migration, zum anderen die HIV-Epidemie, besonders in den 

Entwicklungsländern, verantwortlich gemacht (RAVIGLIONE et al. 1995). In der 

Dritten Welt ist die hohe Zahl der Tuberkulosefälle offensichtlich auch die Folge von 

schlechter medizinischer Versorgung und schlechten Lebensbedingungen 

(GODFREY-FAUSSETT et al. 2000). Nicht nur in den Entwicklungsländern, sondern 

auch in den ehemaligen Ostblockstaaten und den Industriestaaten ist die 

Tuberkulose auf dem Vormarsch. Auch in Japan zum Beispiel wurde seit 1997 ein 

stärkerer Anstieg der Tuberkulosefälle registriert (NAKATANI et al. 2002). In den 

Industriestaaten tritt die Tuberkulose häufig in sozial schwachen 

Bevölkerungsschichten auf, wie dies zum Beispiel auch in den USA der Fall ist. 

Ein bedeutsamer Zusammenhang für die Epidemiologie der Tuberkulose in den 

Entwicklungsländern ist die hohe Zahl der HIV-Patienten, die gleichzeitig mit 

Tuberkuloseerregern infiziert sind. Eine HIV-Infektion stellt in diesen Ländern das 

größte Risiko für die Reaktivierung einer latenten Tuberkulose dar, und Tuberkulose 

ist die Haupt-Todesursache bei HIV-positiven Erwachsenen (CORBETT et al. 2003). 

Erregerstämme, die gegen mindestens ein Tuberkulosemedikament resistent sind, 

wurden mittlerweile in vielen Ländern gefunden. Die WHO geht davon aus, das jedes 

Jahr etwa 300.000 Tuberkulosefälle auftreten, in denen der Erreger multiresistent, 

das heißt, mindestens gegen Isoniazid und Rifampizin unempfindlich ist. In über 79% 

dieser Fälle sind sogar drei oder vier Medikamente unwirksam. Die meisten dieser 

Fälle treten in den so genannten „Hot Spots“ auf. Die Gefahr einer Infektion mit der 

MDR-TB (Multi-drug-resistant TB) ist in manchen Gebieten der ehemaligen 

Sowjetunion und Zentralasiens zehnmal so hoch wie in anderen Ländern. Bis zu 

14% der registrierten Neuerkrankungen in diesen Regionen waren MDR-Fälle (WHO 

2004). Ein besonderer Brennpunkt in diesem Zusammenhang sind die 

osteuropäischen Gefängnisse, wo teilweise Inzidenzen von 7000 Erkrankungen auf 

100.000 Insassen beobachtet wurden (CONINX et al. 2000). 

In Deutschland wurden im Jahr 2002 insgesamt 7684 Tuberkulose-Neuerkrankungen 

vom Robert-Koch-Institut erfasst, was 9,3 Erkrankungen auf 100.000 Einwohner 

entspricht. Damit sind die Tuberkulosefallzahlen in den letzten zehn Jahren

kontinuierlich gesunken. 31,8% der Erkrankungsfälle traten bei ausländischen 

Staatsbürgern auf, von denen 42% im Ausland geboren waren. Von diesen 

wiederum stammten 25% aus den Staaten der ehemaligen Sowjetunion. Diese 

Zahlen zeigen die Bedeutung der Migration für die Ausbreitung der Tuberkulose auch 

in den Industrieländern. Der Anteil der MDR-Erkrankungen in Deutschland lag 2002 

bei 2% und war damit gegenüber dem Vorjahr mit 2,3% leicht rückläufig (RKI 2004). 

2.2.2. Ätiologie und Pathogenese 

Die Tuberkulose des Menschen wird durch M. tuberculosis hervorgerufen, wobei die 

Infektionsquelle erkrankte bzw. infizierte Menschen sind. Infektionen durch M. bovis 

kommen in Deutschland wesentlich seltener vor, was auf die Erfolge in der 

Bekämpfung der Rindertuberkulose und das Pasteurisieren der Milch zurückzuführen 

ist. (HAHN et al. 2001). M. africanum wird hauptsächlich in Westafrika nachgewiesen 

(MATTHIESSEN et al. 1992). 

Die Tuberkulose ist eine chronische, in Zyklen verlaufende Allgemeininfektion (HAHN 

et al. 2001). Die Infektion erfolgt meist durch erregerhaltige Sputum-Tröpfchen oder 

Staub-Partikel, die aerogen in die Lunge gelangen und dort zu einem Primäraffekt 

führen. Dieser Entzündungsherd entsteht innerhalb von 10-14 Tagen nach der 

Infektion aufgrund von entzündungsfördernden Substanzen aus zerfallenen 

Makrophagen. Die Makrophagen nehmen die Mykobakterien in Phagosomen auf, 

aber durch die Schutzmechanismen der Erreger ist eine vollständige Elimination 

nicht möglich. Durch die zelluläre Immunantwort kommt es zu einem Tropismus für 

Makrophagen und Lymphozyten, die sich wie ein Abwehrwall um die Mykobakterien 

legen (FRIEDLAND 1999). Einige Erreger werden in Makrophagen lymphogen in den 

regionären Lymphknoten transportiert, wo sie eine T-Zellreaktion auslösen. Dieser 

bildet dann zusammen mit dem Primäraffekt den Ghon- oder Primärkomplex. In 90% 

der Fälle stagniert die so genannte primäre Tuberkulose in diesem Stadium. Es 

kommt zur Resorption, Vernarbung und Verkalkung des Primärkomplexes. Es 

können jedoch über Jahrzehnte virulente Tuberkulose-Erreger in diesen Herden 

persistieren, die im Falle einer Resistenzminderung zum Ausbruch einer klinisch 

manifesten post-primären Tuberkulose führen (HAHN et al. 2001). 

Bei Kleinkindern und immunsupprimierten Menschen kann es nach einer Infektion zu 

verschiedenen, klinischen Ausprägungen der primären Tuberkulose kommen. Die 

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8 

progressive Primär-Tuberkulose der Lunge entsteht bei einer schlecht ausgebildeten 

zellulären Immunität. Dabei kommt es ohne Bildung des Primärkomplexes zu 

nekrotischen Veränderungen des Lungengewebes. Eine weitere, gelegentlich bei 

HIV-Patienten auftretende Form ist die akut verlaufende Landouzy-Sepsis, bei der 

keine Granulombildung beobachtet wird (HAHN et al. 2001). Eine primäre 

Miliartuberkulose entsteht durch massive lymphogen-hämatogene Streuung der 

Erreger, es kommt zu zahlreichen, hirsekorngroßen Herden in mehreren Organen. 

Meist sind die Meningen, die Leber und das Knochenmark befallen (HAHN et al. 

2001). Auch diese Form tritt bei HIV-Patienten und bei Kindern mit angeborenen 

Immundefekten auf (MATTHIESSEN et al. 1992) und endet unbehandelt tödlich. 

Die post-primäre Tuberkulose oder Reaktivierungskrankheit nimmt ihren Ausgang 

vom Primärkomplex oder von so genannten primären Streuherden, die von Erregern, 

die sich bereits im Stadium des Primäraffektes in anderen Organen ablagern 

konnten, gebildet wurden. Zahlreiche Faktoren können zu einer Reaktivierung dieser 

Herde führen: Stress, Unterernährung, starke körperliche Belastungen, 

Strahlenbelastung, Kortisonbehandlung, Drogenabusus und andere 

Infektionserkrankungen, zum Beispiel Masern oder HIV-Infektion (HAHN et al. 2001). 

Auch bei einer Tuberkulose-Superinfektion kann es zu einer post-primären 

Tuberkulose kommen. 

Eine reaktivierte Tuberkulose beginnt mit einer käsigen Nekrotisierung der 

Granulomzentren, die sich im weiteren Verlauf verflüssigen können. Diese 

Verflüssigung bedeutet einerseits eine gute Vermehrungsmöglichkeit für die 

Mykobakterien und ist andererseits, bei Anschluss der Kaverne an das 

Bronchialsystem, ein Vorteil für die Verbreitung der Erreger in Aerosolen, die 

ausgehustet werden. Man spricht hierbei von der offenen Lungen-Tuberkulose. 

Wenn der Prozess ein Blutgefäß erreicht, kommt es zur hämatogenen Streuung. 

Erreger können sich dabei in verschiedenen Organen ansiedeln und 

Organtuberkulosen verursachen (HAHN et al. 2001). 

2.2.3. Klinik 

Die Infektion mit M. tuberculosis verläuft häufig zunächst symptomlos. Nach einer 

Inkubationszeit, die bei Erwachsenen mehrere Jahre betragen kann, treten 

unspezifische Symptome wie Inappetenz, Nachtschweiß, gestörtes

Allgemeinbefinden, Gewichtsverlust sowie mäßiges Fieber auf. Auch Husten, zum 

Teil blutig, und Hals- und Thoraxschmerzen kommen mit fortschreitender Erkrankung 

vor (DEDIÉ 1993). Bei den pulmonalen Formen der Tuberkulose lassen sich 

röntgenologisch die exsudative, fibrotische und käsig-nekrotisierende 

Lungentuberkulose unterscheiden (MATTHYS 2000). 

Bei den extrapulmonalen Lokalisationen treten organspezifische Beschwerden auf. 

Bei Knochen- und Gelenkstuberkulose kommt es zu Schmerzen und eventuell 

Deformationen des Bewegungsapparats. Häufig sind die Wirbelkörper befallen 

(Spondylitis tuberculosa), ihre Zerstörung kann zur Kompression des Rückenmarks 

führen (DEDIÉ 1993). 

Durch das Abschlucken erregerhaltigen Sputums kann sich eine Darmtuberkulose 

entwickeln. Häufig ist der Ileocaecalbereich befallen, es treten abdominale 

Schmerzen, Durchfall, Meläna und Absorptionsstörungen auf (DIERICH et al. 2000). 

Die tuberkulöse Meningitis äußert sich durch Kopfschmerzen, Nackensteifigkeit und 

Beeinträchtung diverser Hirnnerven. Neurologische Symptome sind oft die Folge. 

Urogenitale Tuberkulosen verursachen eine rezidivierende Pyelonephritis, eventuell 

auch Hämaturie. Die harnableitenden Wege können mit betroffen sein. 

Sehr selten treten auch Hautformen der Tuberkulose auf. Zum einen ist dies der 

Lupus vulgaris mit papulösen Entzündungen, in deren Zentrum abheilende, aber 

auch ulzerierende oder atrophische Bezirke bilden. Eine weitere Form ist die 

Tuberculosa verrucosa cutis mit granulomatösen, warzenähnlichen Läsionen 

(DIERICH et al. 2000). 

2.2.4. Diagnose 

Eine gebräuchliche Methode, um eine stattgefundene Tuberkuloseinfektion 

festzustellen, ist der Tuberkulintest. Robert Koch entwickelte bei seiner Suche nach 

einem Impfstoff gegen die Tuberkulose das „Alt-Tuberkulin“, den durch Kochen 

eingedickten, gefilterten, proteinhaltigen Überstand aus Flüssigkulturen von 

Tuberkulose-Erregern. Die hieraus mit Ammoniumsulfat ausgefällte Proteinfraktion 

wird als gereinigtes Tuberkulin bezeichnet (HAHN et al. 2001). Wird dieses 

gereinigte Tuberkulin bei Personen mit entwickeltem Primärkomplex intrakutan 

injiziert, entsteht innerhalb von 48-72 Stunden eine Hautschwellung durch das 

Einwandern von mononukleären Phagozyten und T-Lymphozyten (HAHN et al. 

9

10 

2001). Diese ist der Ausdruck einer zellvermittelten Überempfindlichkeitsreaktion 

vom verzögerten Typ (Allergie-Typ IV). Gebräuchlich sind heute der Tine-Test und 

der Mendel-Mantoux-Test, die sich in der Applikationsform unterscheiden. Nachteil 

dieses Verfahrens ist, das eine Impfung mit BCG oder eine Infektion mit nichttuberkulösen 

Mykobakterien eine falsch positive Reaktion bewirken kann. Ebenso 

besteht die Möglichkeit eines falsch-negativen Testresultats bei immunsupprimierten 

Personen, zum Beispiel bei HIV-Patienten (HAAS 2000). 

Eine sichere Diagnose ist daher nur mit einem Erregernachweis zu stellen. Dieser 

kann durch radiologische, sonographische und labordiagnostische Verfahren gestützt 

werden. Der mikroskopische Nachweis säurefester Stäbchen kann in Sputum, 

Pleurapunktaten, Liquor, Biopsien, Urin, Stuhl und Magensaft erfolgen. Hierbei wird 

das Direktpräparat einer lichtmikroskopischen Untersuchung mit Färbung nach Ziehl- 

Neelsen oder einer fluoreszenzmikroskopische Untersuchung mit Auramin-Färbung 

unterzogen (HAHN et al. 2001). 

Aus Bioptaten können nach Fixierung mit Formalin histologische Präparate 

hergestellt werden, die pathologisch-anatomisch untersucht werden. Der Nachweis 

einer epitheloidzelligen Granulomatose kann dann die Diagnose der 

Tuberkuloseinfektion stützen. 

Der kulturelle Erregernachweis muss bei Verdacht auf Tuberkulose stets 

durchgeführt werden. Die oben erwähnten Patientenmaterialien finden hier ebenfalls 

Verwendung. Sie werden durch Anwendung von N-Acetyl-L-Cystein und NaOH oder 

Natriumlaurylsulfat (SDS) und NaOH dekontaminiert (METCHOCK et al. 1999). 

Danach erfolgt eine Anreicherung durch Zentrifugation. Die kulturelle Anzucht sollte 

mit mindestens drei verschiedenen Medien, zwei Festmedien und ein 

Flüssigmedium, durchgeführt werden. Dafür stehen Eiernährböden, wie Löwenstein- 

Jensen-Medium, Petragnani-Medium, Gottsacker- und Stonebrinkmedium, aber auch 

Agar-basierte Nährböden wie Middlebrook 7H10 und 7H11 (METCHOCK et al. 1999) 

zur Verfügung. Für die Anzucht der Mykobakterien werden die Medien bei 37°C und 

einem CO2-Gehalt von 5-10% inkubiert. Bei der Kultivierung auf Festnährböden ist 

nach frühestens 2-3 Wochen mit einem makroskopisch erkennbaren 

Koloniewachstum zu rechnen. Ein negativer Befund darf jedoch erst nach 6-8 

Wochen der Bebrütung erhoben werden. Ein Vorteil der Anzucht auf soliden Medien 

ist die Möglichkeit zur morphologischen Beurteilung der Kolonien.

Flüssignährmedien wie Kirchner-Medium und Middlebrook 7H9 finden ebenfalls 

Verwendung. Durch automatisierte Kultursysteme ist eine Diagnose schon nach 

weniger als zwei Wochen möglich. Die BACTEC ® -Systeme der Firma Becton- 

Dickinson verwenden verschiedene Technologien. Dabei wird zum Beispiel 

radioaktiv markiert Palmitinsäure als alleinige Kohlenstoffquelle verwendet. 

Stoffwechselaktive Mykobakterien produzieren daraus 14 CO2, das sich radiometrisch 

quantifizieren lässt. (HAHN et al. 2001). Eine andere Technik nutzt das MGIT ® - 

Verfahren (engl.: mycobacterial growth indicator tube). Bei diesem System wird ein 

Metallkomplex von UV-Licht mit einer Wellenlänge von 365nm zur Fluoreszenz 

angeregt. Es handelt es sich einen Ruthenium-Komplex, dessen Fluoreszenz in 

Verbindung mit Sauerstoff sinkt. Bei Wachstum von Mykobakterien nimmt die 

Sauerstoffkonzentration des Mediums ab und die steigende Fluoreszenz kann vom 

Gerät gemessen werden. Weitere Verfahren messen die Druckveränderungen bei 

Gasproduktion durch die wachsenden Bakterien oder verwenden einen 

kolorimetrischen CO2-Sensor. Die Nachteile dieser Verfahren sind die hohen Kosten, 

mögliche Kontaminationen und, beim radiometrischen Verfahren, der Anfall von 

radioaktivem Abfall. Außerdem ist es nicht möglich, Mischinfektionen zu erkennen 

oder Koloniemorphologien zu beurteilen. 

Ist der Nachweis von säurefesten Stäbchen gelungen, sollte sich eine 

Speziesdifferenzierung anschließen. Sie erfolgt durch biochemische und 

molekularbiologische Verfahren. Bei der biochemischen Differenzierung werden 

Unterschiede in spezifischen Stoffwechselleistungen der verschiedenen Spezies 

ausgenutzt. Wichtige Beispiele hierfür sind die Nitratreduktaseaktivität und der 

Niacin-Test. 

Die Fähigkeit von M. tuberculosis, unter aeroben Bedingungen Nitrat zu Nitrit zu 

reduzieren (VIRTANEN 1960), bietet die Möglichkeit der Unterscheidung von den 

anderen Erregern des M. tuberculosis-Komplexes, bei denen nur eine schwache 

oder gar keine Nitratreduktaseaktivität vorhanden ist. Beim Nitratreduktase-Test wird 

über einen Farbstoff im Medium akkumuliertes Nitrit nachgewiesen (SALFINGER u. 

KAFADER 1992). 

Niacin (Nicotinsäure) ist eine Vorstufe der Coenzyme NAD (Nicotinamid-Adenin- 

Dinukleotid) und NADP (Nicotinamid-Adinenin-Dinukleotid-Phosphat). Alle 

Mykobakterien produzieren Niacin, jedoch sind M. tuberculosis, einige M. bovis BCG- 

Stämme und manche Mykobakterien der MOTT-Gruppe nicht in der Lage, dieses 

11

12 

Niacin zu Nicotinsäuremononukleotid umzusetzen. Daraus resultiert eine 

Akkumulation des Niacins im Medium. Dieses erzeugt mit Bromcyanid und Anilin 

einen gelben Farbkomplex, der als Indikator genutzt wird (HAHN et al. 2001). Dieser 

Test allein ist jedoch nicht ausreichend zur Speziesdiagnostik und sollte immer 

kombiniert mit anderen Tests verwendet werden, wie zum Beispiel dem Nitrat- 

Reduktase-Test oder dem Katalase-Test (METCHOCK et al. 1999). 

Die molekularbiologische Technik hat in den letzten Jahren auch im Bereich der 

Mykobakterien an Bedeutung gewonnen. Diese erlaubt nicht nur eine wesentlich 

schnellere Differenzierung, sondern liefert zusätzlich Material für phylogenetische 

Untersuchungen. Zur Anwendung kommen hier Amplifikationstechniken wie die 

Polymerase-Kettenreaktion (engl.: polymerase chain reaction, PCR). Sie wird zum 

Beispiel genutzt, um eine Sequenzierung der spezies-spezifischen DNA-Abschnitte 

der 16S rRNA zu ermöglichen, oder für eine Direkt-PCR mit anschließender Sonden- 

Hybridisierung. Eine häufig gewählte Zielsequenz ist IS6110, ein Bereich, der in 

Verbindung mit einer RFLP-Analyse (Restriktions-Fragment-Längen- 

Polymorphismus) zur Typisierung von M. tuberculosis-Isolaten (METCHOCK et al. 

1999) und für die Differenzierung innerhalb des M. tuberculosis-Komplexes (VAN 

SOOLINGEN 2001) genutzt wird. 

2.2.5. Therapie 

Bei der Therapie der Tuberkulose wird zwischen chemotherapeutischer 

(konservativer) und chirurgischer Therapie unterschieden. Die chemotherapeutische 

Behandlung sollte nach folgenden Grundsätzen erfolgen (SHAH 2001): 

Am Anfang der Therapie wird versucht, durch eine intensive Behandlung mit 3 oder 4 

Antituberkulotika zur gleichen Zeit die Keimzahl möglichst schnell zu reduzieren und 

außerdem einer Selektion resistenter Keime vorzubeugen. Für eine erfolgreiche 

Behandlung sollte nach kurzer Zeit eine kulturelle Sputumkonversion erreicht werden 

(MATTHYS 2000). Es schließt sich eine längere Stabilisierungsphase an, die 

Rezidive verhindern und die persistierenden Erreger abtöten soll. Die Auswahl der 

Medikamente richtet sich nach einer eventuellen Vorbehandlung, und daraus 

möglicherweise resultierenden sekundären Resistenzen, sowie den 

Organmanifestationen der Tuberkulose. Die Kooperation der Patienten spielt eine

wichtige Rolle, da sich die Behandlung über Monate erstreckt und zum Teil 

erhebliche Nebenwirkungen auftreten. 

Mittel der ersten Wahl bei der Behandlung der Tuberkulose sind Isoniazid, 

Rifampizin, Pyrazinamid, Ethambutol und Streptomycin (GRANGE u. ZUMLA 1999). 

Isoniazid ist bei akuten Lebererkrankungen kontraindiziert, da es hepatotoxisch wirkt. 

Weitere gelegentlich auftretende Nebenwirkungen sind Neuropathien, Nausea, 

Erbrechen, Gelenkschmerzen, epileptiforme Krämpfe oder allergische Reaktionen 

(GRANGE u. ZUMLA 1999; SHAH 2001). 

Rifampizin (oder Rifampin) ist ein Antituberkulotikum, das sehr oft in Kombination mit 

Isoniazid verwendet wird. Eine Eigenschaft des Rifampizins ist es, die Körpersekrete 

orange einzufärben, was die Überwachung der Patientendisziplin bezüglich der 

Medikamenteneinnahme erleichtert. Auch bei diesem Medikament treten 

Nebenwirkungen auf, die sich als Hepatitiden, Gewichtsabnahme, Diarrhoe, Übelkeit 

und Erbrechen darstellen können. 

Die Medikamente zweiter Wahl sollten nur bei multiresistenten Erregern verwendet 

werden. Hierzu zählen das Ethionamid, Imipenem, Clofazamin und Thiazetazon 

(GRANGE u. ZUMLA 1999). 

Die chirurgische Therapie wird heute selten durchgeführt. Sie kann bei 

Lungenblutungen und spondylitischen Lähmungen sowie Gelenk- und 

Knochentuberkulose indiziert sein. 

Eine offene Tuberkulose gilt als geschlossen, wenn in drei sukzessive gewonnenen 

Sputumproben mikroskopisch und durch Kultur keine Erreger mehr nachweisbar sind 

(HAHN et al. 2001). 

2.2.6. Impfung 

Der bisher einzige Impfstoff gegen die Tuberkulose ist BCG („Bacille Calmette- 

Guérin“). Er wurde im frühen 20. Jahrhundert von Albert Calmette und Camille 

Guérin im Institute Pasteur in Lille, Frankreich, entwickelt. Sie verwendeten dabei 

einen Stamm des M. tuberculosis-Komplexes (Stamm Lait Nocard), der von einer 

Kuh mit einer tuberkulösen Mastitis isoliert worden war. Nach einer von 1908 bis 

1919 währenden Subkultivierung mit 230 Passagen in einem Medium mit 

Ochsengalle-Zusatz hatte der Stamm eine weitgehende Attenuierung erfahren. Der 

neu entstandene Impfstoff wurde an zahlreichen Versuchstieren auf seine Sicherheit 

13

14 

überprüft, bis er schließlich 1921 das erste Mal als Schluckimpfung für Kinder 

eingesetzt wurde (WILLIAMS 1995). Später wurde er subkutan angewendet, damit 

durch die Tuberkulinreaktion eine Impfbestätigung erfolgen konnte. 

Inzwischen wurde dieser Impfstoff bei über einer Milliarde Menschen weltweit 

angewendet und ist damit der am meisten eingesetzte Lebendimpfstoff überhaupt 

(MCKINNEY et al. 1998). Die Vorteile bei der Verwendung des BCG-Impfstoffs sind, 

dass er in den heißen Regionen der dritten Welt (weil eine Kühlkette nicht unbedingt 

erforderlich ist) verwendbar ist, dass er kostengünstig herzustellen ist, und dass 

Nebenwirkungen relativ selten auftreten (STOVER et al. 1991). Die häufigsten 

bekannten Nebenwirkungen bestehen in lokalen Abszessen oder chronischen 

Lymphadenitiden. Andererseits wurde schon vermehrt darüber berichtet, dass der 

durch BCG induzierte Impfschutz stark variiert. Er betrug für die pulmonale Form der 

Tuberkulose bei Erwachsenen, je nach Studie, zwischen 80% und 0% (BLOOM u. 

FINE 1994). Besonders in Regionen wie Indien, wo die Exposition der Bevölkerung 

mit nicht-tuberkulösen Mykobakterien besonders hoch ist, erzielte die Impfung mit 

BCG keinen erkennbaren Vorteil gegenüber nicht-geimpften Kontrollgruppen 

(WILSON et al. 1995). Nach einer Analyse der bisherigen Veröffentlichungen in 

diesem Zusammenhang scheint der BCG-vermittelte Schutz gegen die schweren 

Erkrankungen im Kindesalter, wie die tuberkulöse Meningitis und die 

Miliartuberkulose, höher zu sein (mindestens 80%) als der Schutz gegen die 

pulmonale Erkrankung der Erwachsenen (unter 50%) (COLDITZ et al. 1994). 

Bei Patienten mit einer erworbenen oder angeborenen Immundefizienz kann es nach 

Impfung mit BCG zu einer BCGitis, einer generalisierten Infektion mit oft tödlichem 

Ausgang kommen (WILLIAMS 1995). 

In Ländern mit einer hohen Tuberkuloseprävalenz wird aber von der WHO derzeit 

noch die Impfung mit BCG empfohlen. HIV-infizierte Kinder sollten allerdings von der 

Impfung ausgenommen werden. In Deutschland wird die Impfung mit BCG-Impfstoff 

von der ständigen Impfkommision (STIKO) des Robert-Koch-Instituts gegenwärtig 

nicht empfohlen. 

Um einen effektiveren Impfschutz zu erreichen und die negativen Auswirkung der 

Impfung zu minimieren, werden derzeit verschiedene Ansätze in der 

Impfstoffentwicklung verfolgt. Dazu gehören einerseits die Spaltvakzinen, die aus 

DNA-Konstrukten oder mykobakteriellen Proteinen bestehen und in Verbindung mit 

Adjuvantien die T-Zellpopulationen des Impflings stimulieren sollen. Hierzu werden

auch rekombinante, nicht-mykobakterielle Antigen-Träger, wie zum Beispiel 

attenuierte Salmonella-Stämme oder Vaccinia-Viren, gezählt. Andererseits sind die 

mykobakteriellen Lebendvakzinen zu nennen, die aufgrund einer Vielzahl 

immunogener Komponenten eine starke Immunreaktion erwarten lassen. Attenuierte 

Deletionsmutanten von M. tuberculosis und rekombinante M. bovis BCG-Stämme 

stellen hierbei vielversprechende Ansätze dar (KAUFMANN 2000). 

2.3. Tuberkulose bei Tieren 

Mykobakterien gehören auch bei Tieren zu den wichtigsten bakteriellen 

Krankheitserregern. Insbesondere für M. bovis, den Erreger der Rindertuberkulose, 

sind auch viele andere Säugetierarten empfänglich. Nachdem Robert Koch nach 

seiner Entdeckung der Tuberkulosebakterien die Erkrankungen bei Menschen und 

Rindern zunächst auf einen einheitlichen Erreger zurückführte, gelang ihm 1901 der 

Nachweis der Verschiedenheit von M. bovis und M. tuberculosis. Daraufhin wurde 

fälschlicherweise angenommen, dass die Rindertuberkulose keine Gefahr für den 

Menschen darstellt. Heute weiß man, dass eine Infektion mit M. bovis und in 

geringerem Maße auch M. tuberculosis vom Tier auf den Menschen übergehen kann 

und umgekehrt. Tatsächlich stellen Menschen mit offener M. bovis-Tuberkulose in 

Gebieten, die als Rindertuberkulose-frei gelten, eine wichtige Ansteckungsquelle für 

Rinder dar (SELBITZ 2002; TRAUTWEIN 2002). 

Die Infektion mit M. bovis erfolgt bevorzugt aerogen, kann jedoch auch über die Milch 

erkrankter Kühe enterogene Infektionen der Kälber verursachen. Ein weiterer 

Übertragungsweg ist die intrauterine, omphalogene Infektion. Wesentlich seltener 

treten genitale oder galaktogene Infektionen infolge Gebärmutter-, Scheiden-, Penis-, 

Hoden- oder Nebenhodentuberkulose sowie Eindringen des Erregers in den 

Strichkanal auf (TRAUTWEIN 2002). 

Analog zu der Pathogenese bei der humanen Tuberkulose tritt auch bei der bovinen 

Form ein Primäraffekt, beziehungsweise bei Miterkrankung des regionalen 

Lymphknotens ein Primärkomplex, an der Infektionspforte auf. Im Falle einer 

Frühgeneralisation kann es zur Miliartuberkulose oder protrahierten Generalisation 

kommen. Häufiger ist jedoch eine Vernarbung und Verkalkung des Primärkomplexes 

mit Ausheilung oder post-primärer Exazerbation. Eine kanalikuläre Ausbreitung des 

Erregers führt zur chronischen Organtuberkulose, beispielsweise Lungen- oder 

15

16 

Eutertuberkulose. Unter zusätzlichen Belastungen kann es postprimär auch zu einer 

Niederbruchsphase und infolgedessen zur Spätgeneralisation kommen. Hierbei 

entstehen in den befallenen Organen miliare Tuberkel, die sich in Lunge und Euter 

zu nekrotischen Prozessen und verkäsender Pneumonie beziehungsweise Mastitis 

entwickeln können (TRAUTWEIN 2002). 

Die chronische Lungentuberkulose manifestiert sich mit fortschreitendem Husten, 

verschlechtertem Allgemeinbefinden, Fieberschüben und Leistungsabfall. Die 

tuberkulöse Vergrößerung der mediastinalen Lymphknoten kann zu Kompressionen 

des Schlundes und rezidivierender Tympanie führen. Die verschiedenen 

Organmanifestationen äußern sich symptomatisch entsprechend ihrer Lokalisation, 

so zeigt sich zum Beispiel die Tuberkulose des weiblichen Genitale durch Umrindern, 

Ausfluss, Ausbleiben der Brunst und Verkalben (TRAUTWEIN 2002). 

Die Rindertuberkulose ist in zahlreichen Staaten Europas sowie vielen 

Bundesstaaten der USA und Kanada getilgt. Deutschland wird seit 1962 als praktisch 

frei von Rindertuberkulose angesehen. Dieses Ziel wurde durch regelmäßige 

Tuberkulinisierungen gesamter Bestände mit nachfolgender Abtrennung und 

allmählicher Merzung positiver Reagenten erreicht. Die tuberkulose-freien Bestände 

wurden regelmäßig durch Tuberkulintest überprüft, nach Tilgung der Erkrankung in 

Deutschland wurden sie jedoch eingestellt. Allerdings treten auch hierzulande immer 

wieder vereinzelte Fälle der Rindertuberkulose auf, die vor allem bei 

Schlachtkörperuntersuchungen diagnostiziert werden (SELBITZ 2002). 

Andere Wiederkäuer wie Schaf und Ziege sind ebenfalls für Infektionen mit M. bovis 

empfänglich. Das Krankheitsbild ähnelt weitestgehend der Erkrankung des Rindes. 

Es dominieren exsudative Veränderungen der Lunge, aber auch Eutertuberkulosen 

bei Ziegen sind bekannt. 

Schweine infizieren sich hauptsächlich alimentär, pathologische Veränderungen 

dominieren daher im Bereich des lymphatischen Rachenrings und im Intestinaltrakt. 

Postprimäre Prozesse kommen aufgrund der kurzen Lebensdauer der meisten 

Schweine kaum vor. 

Pferde zeigen nach enteraler Infektion häufiger eine Besiedelung der Lunge infolge 

hämatogener Streuung. Aerogene Infektionen der Lunge sind nicht bekannt. 

Betroffen sind oft auch Tonsillen, Kehlgangs- und Retropharyngeal-Lymphknoten. 

Bei Hund und Katze sind Tuberkulose-Erkrankungen durch die Eindämmung der 

Rindertuberkulose ebenfalls stark zurückgegangen. Vor dieser Zeit wurde bei Katzen

als Hauptinfektionsquelle die Milch eutertuberkulöser Kühe ausgemacht. Für die 

Infektion mit M. tuberculosis sind Katzen relativ wenig empfänglich. Sie können 

jedoch zu temporären Mykobakterienträgern werden und die Erreger ausscheiden, 

ohne selbst zu erkranken. Beim Hund erfolgt die Ansteckung mit M. tuberculosis 

heutzutage meist durch den Besitzer, die Erkrankung ähnelt der beim Menschen 

(SELBITZ 2002). 

Da sich der Erreger M. bovis durch ein großes Wirtsspektrum auszeichnet, sind auch 

Wildtiere häufig Überträger der Erkrankung. Die Dachspopulationen in 

Großbritannien und der Schweiz wurden als Erregerreservoire für die 

Rindertuberkulose in diesen Gebieten ausgemacht. In Neuseeland zählen 

Fuchskusus (Trichosurus vulpecula), kleine Beuteltiere, zu den Überträgern für 

Weidevieh. Des Weiteren sind Infektionen bei Cerviden (wildlebend und in 

Gefangenschaft gehalten), Büffeln, Bisons, Wild- und Warzenschweinen, Affen und 

Feliden bekannt. M. tuberculosis ist bei Affen, Elefanten und Papageien 

nachgewiesen worden (SELBITZ 2002). 

Die Geflügeltuberkulose wird durch M. avium hervorgerufen. Die Empfänglichkeit 

für den Erreger ist bei Hühnervögeln am ausgeprägtesten, Tauben und 

Wassergeflügel werden seltener infiziert. Die Infektion erfolgt überwiegend oral über 

kontaminiertes Tränkewasser oder Futter. Die primäre Lokalisation der Erkrankung 

ist daher meist der Intestinaltrakt, von dem aus sich der Erreger hämatogen 

ausbreitet. Bei einer Sektion eines erkrankten Tieres lassen sich tuberkulöse 

Granulome in Darm, Leber, Milz und Knochenmark darstellen. Die 

Geflügeltuberkulose spielt für die moderne Geflügelproduktion keine wesentliche 

Rolle mehr, betroffen sind hauptsächlich kleinere Bestände und ökologische 

Haltungsformen (SELBITZ 2002). 

2.4. Argininstoffwechsel bei Bakterien 

2.4.1. Der Arginindeiminase-Weg 

Mykobakterien gelten als obligat aerobe Bakterien. Im Wirt befinden sie sich 

intrazellulär in den Phagosomen der Makrophagen, die wiederum in Granulomen 

vorliegen. In den Granulomen herrscht ein mikroaerobes bis anaerobes Milieu 

(BARCLAY u. WHEELER 1989). Die Mykobakterien können unter diesen 

Bedingungen persistieren und sich sogar vermehren (MANABE und BISHAI 2000). 

17

18 

So können sie noch Jahre nach der Infektion zu einer klinischen Erkrankung führen. 

Daher stellt sich die Frage, wie der Erreger es schafft, ohne Sauerstoff als terminalen 

Elektronenakzeptor die Energieversorgung der Zelle aufrechtzuerhalten. 

Es gibt andere Bakterienspezies, die ebenfalls als obligate Aerobier beschrieben 

werden, aber in vivo unter anaeroben Bedingungen vorliegen. Pseudomonas 

aeruginosa wird häufig aus dem Respirationstrakt von Patienten, die an Cystischer 

Fibrose leiden, isoliert (VOGT et al. 2001). Bei dieser Erkrankung führen 

Schleimansammlungen in der Lunge zu einem anaeroben oder zumindest 

mikroaeroben Milieu. Es konnte gezeigt werden, das P. aeruginosa unter anaeroben 

Bedingungen durch den so genannten Arginindeiminaseweg (ADI-Weg) in der Lage 

ist, aus Arginin ATP zu generieren und dieses für sein Wachstum zu verwenden 

(VANDER WAUVEN et al. 1984). Dabei entstehen aus einem Molekül Arginin ein 

Molekül Ornithin, zwei Moleküle Ammoniak, ein Molekül CO2 und ein Molekül ATP. 

Die dafür notwendigen Enzyme sind Arginin-Deiminase (ADI), Ornithin- 

Transcarbamoylase (OTC) und Carbamat-Kinase (CK). Sie werden durch das 

Operon arcDABC kodiert. Dabei steht das arcA-Gen für die Arginin-Deiminase, arcB 

für die Ornithin-Transcarbamoylase und arcC für die Carbamatkinase. Mit diesen 

Genen assoziiert ist arcD, das für einen membranständigen Arginin-Ornithin- 

Antiporter kodiert (BOURDINEAUD et al. 1993). Unter mikroaerophilen und 

anaeroben Bedingungen werden diese Gene verstärkt exprimiert, ebenso bei 

Depletion von Stickstoff- oder Kohlenstoffquellen (MERCENIER et al. 1980). 

Abbildung 1: Arginindeiminaseweg bei Pseudomonas aeruginosa 

(abgewandelt nach Zuniga et al. 2002)

Der Arginindeiminaseweg ist bei vielen Bakterien, zumindest teilweise, vorhanden. 

Das erste Enzym, die Arginindeiminase, die die Umsetzung von Arginin zu Citrullin 

katalysiert, wurde auch beim anaeroben Protozoen Giardia intestinalis gefunden 

(KNODLER et al. 1998). Bei höheren Eukaryoten wurden jedoch noch keine Arginin- 

Deiminase-Gene oder eine Arginin-Deiminase-Aktivität festgestellt. Sie fehlt ebenfalls 

bei Haemophilus influenzae, Lactobacillus lactis und Staphylococcus aureus. 

Anderen Bakterien wiederum besitzen das arcA-Gen, aber kein arcC, wie zum 

Beispiel Borrelia burgdorferi (ZUNIGA et al. 2002). Die Ornithin-Carbamoyl- 

Transferase ist bei vielen eukaryoten und prokaryoten Organismen bekannt. Sie 

kann als kataboles Enzym Teil des Arginindeiminasewegs sein, aber auch in einer 

anabolen Funktion für die Argininsynthese zuständig sein. Manche Bakterien, wie 

zum Beispiel P. aeruginosa, bilden spezielle Ornithin-Carbamoyltransferasen für 

jeden dieser Zwecke aus (ZUNIGA et al. 2002). Carbamat-Kinasen wurden ebenfalls 

in Bakterien und eukaryoten Organismen gefunden, aber sie scheinen nicht immer 

eine Aufgabe im Arginindeiminaseweg zu erfüllen (ZUNIGA et al. 2002). 

Bei der Sequenzierung des Genoms von M. tuberculosis (COLE et al. 1998) wurde 

ein Gen gefunden, das zu 39% homolog zu arcA von P. aeruginosa ist. Es wurde 

ebenfalls als arcA (Rv1001) bezeichnet. Homologien zu anderen Genen des ADI- 

Wegs wurden nicht gefunden. 

2.4.2. Andere Formen des Argininkatabolismus 

Neben dem Arginindeiminaseweg gibt es noch andere Möglichkeiten für Bakterien, 

Arginin abzubauen, von denen die wichtigsten hier erwähnt werden sollen. 

Im Arginase-Weg wird Arginin zu Glutamat umgesetzt. Dieser Weg ist bei vielen 

prokaryoten und eukaryoten Organismen untersucht, wie zum Beispiel bei Bacillus 

subtilis und Bacillus licheniformis (CUNIN et al. 1986). Hier wird die Expression der 

Enzyme des Arginase-Wegs durch Arginin, Citrullin und Ornithin induziert. 

Der Arginin-Succinyl-Transferase-Weg wurde zuerst in Aeromonas formicans und in 

Pseudomonas-Spezies untersucht. Durch ihn wird Arginin zu Glutamat und Succinat 

abgebaut. 

Der Arginin-Decarboxylaseweg ist ein weiterer wichtiger Abbauweg für Arginin. Durch 

ihn wird Putreszin bereitgestellt, das von Bakterien als Stickstoff- und 

Kohlenstoffquelle verwendet werden kann. Arginin-Decarboxylase-Aktivität wurde 

19

20 

berichtet von Pseudomonas spp., Aeromonas und Mykobakterien (CUNIN et al. 

1986). 

Diese Enzyme werden hauptsächlich unter aeroben Bedingungen exprimiert (CUNIN 

et al. 1986). 

Bei der Sequenzierung von M. tuberculosis wurden zu mehreren Enzymen dieser 

Stoffwechselwege Homologien aufgezeigt. Es fanden sich homologe Regionen zur 

Arginin-Decarboxylase (Rv2531c) und zum Arginase-Weg (Rv2321c, Rv2322c, 

Rv1187). Es konnte außerdem Homologien zu einem L-Arginin-Transporter-Gen von 

Bacillus subtilis (rocE) in den Genen Rv0522 und Rv2320c von M. tuberculosis 

gefunden werden (PETEROY-KELLY et al. 2003). 

2.5. Zielsetzung der Arbeit 

Vor diesem Hintergrund stellten sich folgende Aufgaben: 

• Charakterisierung der ∆arcA-Mutanten von M. tuberculosis und M. bovis BCG. 

• Untersuchung von M. bovis BCG und M. tuberculosis auf die Aktivität weiterer 

Enzyme des Arginindeiminasewegs. 

• Untersuchung der Bedeutung der Arginindeiminase für die Pathogenese einer 

Infektion mit Mycobacterium bovis BCG in immunkompetenten Mäusen.

3. Material und Methoden 

3.1. Material 

3.1.1. Bakterien und Plasmide 

Tabelle 1: Verwendete Plasmide. 

Plasmid repliziert 

in E. coli 

repliziert in 

Mykobakterien 

integriert in 

Mykobakterien 

Selektionsmarker 

Herkunft 

pMV306 + - + Kanamycin Labor W. R. Jacobs, 

Albert Einstein College of 

Medicine, New York 

pYUB412 + - + Ampicillin, 

Hygromycin 

pSR14 + - - Ampicillin, 

Hygromycin 

21 

Labor W. R. Jacobs, 

Albert Einstein College of 

Medicine, New York 

AG Bange, Institut für 

medizinische 

Mikrobiologie und 

Krankenhaushygiene, 

Medizinische Hochschule 

Hannover 

pCR5 + - + Kanamycin AG Bange, Institut für 

medizinische 

Mikrobiologie und 

Krankenhaushygiene, 


Hannover

22 

Tabelle 2: Verwendete Bakterienstämme. 

Gattung Spezies Stamm Mutation Herkunft 

Mycobacterium 

tuberculosis H37Rv 

bovis BCG Pasteur 

- American Type Culture 

Collection (ATCC) 25618 

∆arcA AG Bange, Institut für 

medizinische Mikrobiologie 

und Krankenhaushygiene, 


Hannover 

- Statens Serum Institut, 

Kopenhagen, Dänemark 

∆arcA AG Bange, Institut für 




Hannover 

∆narG AG Bange, Institut für 




Hannover 

Escherichia coli HB101 - Fa. Promega GmbH, 

Mannheim 

3.1.2. Lösungen und Puffer 

50x TRIS-Acetat-EDTA (TAE)-Puffer 

242 g TRIS-puffer, 57 ml Eisessig und 100 ml 0,5 M EDTA (pH8) wurden 

mit dest. H2O auf 1000 ml aufgefüllt und autoklaviert. 

10 % Glycerinlösung 

100 ml Glycerin wurden in 900 ml dest. H2O gelöst und autoklaviert. 

50 % Glycerinlösung 

500 ml Glycerin wurden in 500 ml dest. H2O gelöst und sterilfiltriert.

1M KNO3-Lösung 

101,11 g KNO3 wurden in 1000 ml dest. H2O gelöst und sterilfiltriert. 

0,5 M L-Arginin-Lösung 

87,1 g L-Arginin wurden in 1000 ml dest. H2O gelöst und sterilfiltriert. 

0,5 M L-Arginin-HCl-Lösung 

105,33 g L-Arginin-HCl wurden in 1000 ml dest. H2O gelöst und sterilfiltriert. 

0,5 M L-Citrullin-Lösung 

87,59 g L-Citrullin wurden in 1000 ml dest. H2O gelöst und sterilfiltriert. 

Cetrimid-Salzlösung 

4,1 g NaCl wurden in 90 ml dest. H2O gelöst, und unter Rühren wurde 10 g Cetrimid 

hinzugegeben und auf 65 °C erwärmt. Es wurde nicht autoklaviert oder sterilfiltriert. 

Bakterienlysepuffer 

10 ml 1 M TRIS-HCl (pH 9,5), 8 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) und 3,6 g D-Glucose 

wurden in 382 ml dest. H O gelöst. Der Puffer wurde sterilfiltriert. 

2 

20 % Tween80-Lösung 

21,6 g Tween80 wurden in 80 ml dest. H O gelöst. Nach der Lösung des Tweens 

2 

wurde der Ansatz sterilfiltriert. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur und im 

Dunkeln gelagert. 

1 mol/l Magnesiumchlorid-Lösung (1000 ml) 

95,2 g MgCl2 wurden in 1000 ml dest. H2O gelöst und sterilfiltriert. 

1 mol/l Calciumchlorid-Lösung (1000 ml) 

111,0 g CaCl2 wurden in 1000 ml dest. H2O gelöst und sterilfiltriert. 

23

24 

2M TRIS-HCl pH7,5 

242,28 g TRIS(hydroxymethyl)-aminomethan wurden in ca. 800 ml dest. H O gelöst 

2 

und mit HCl auf pH 7,5 eingestellt. Anschließend wurde auf 1000 ml dest. H 2 O 

aufgefüllt und der pH-Wert erneut kontrolliert. 

DNA I -Lösung 

40 ml 5 M NaOH 

300 ml 5 M NaCl 

ad 1000 ml dest. H O 2 

Die Lösung wurde autoklaviert. 

DNA II -Lösung 

500 ml 2 M TRIS-HCl pH 7,5 

300 ml 5 M NaCl 

ad 1000 ml dest. H O 2 

Die Lösung wurde autoklaviert. 

20 x SSC-Puffer pH 7,4 

175,3 g NaCl und 88,3 g Tri-Natriumcitrat-Dihydrat wurden auf 1000 ml mit dest. H O 2 

aufgefüllt und der pH-Wert wurde auf 7, 4 eingestellt. Der Puffer wurde autoklaviert. 

Hybridisierungslösung 

1 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0), 500 ml 0,5 M Na2HPO4 (pH 7,2) und 350 ml 20 % SDS- 

Lösung wurden mit dest. H O auf 1000 ml aufgefüllt. 

2 

Wash I 

1 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0), 80 ml 0,5 M Na HPO (pH 7,2) und 250 ml 20 % SDS- 

2 4 

Lösung wurden mit dest. H 2 O auf 1000 ml aufgefüllt. 

Wash II 

1 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0), 80 ml 0,5 M Na2HPO4 (pH 7,2) und 50 ml 20 % SDS- 

Lösung wurden mit dest. H O auf 1000 ml aufgefüllt. 

2

Puffer 1 

11,6 g Maleinsäure und 8,8 g NaCl wurden mit dest. H O auf 1000 ml aufgefüllt. Der 

2 

Puffer wurde mit NaOH auf den pH-Wert 7,5 eingestellt und autoklaviert. 

10 x Blocking Lösung 

1 g Blocking Reagenz wurde mit 10 ml Puffer 1 aufgefüllt und autoklaviert. 

Puffer 2 

10 x Blocking Lösung wurde 1:10 verdünnt in Puffer 1 aufgenommen. 

Puffer 3 

12,1 g TRIS und 5,8 g NaCl wurden mit dest. H O auf 1000 ml aufgefüllt. Der pH- 

2 

Wert wurde mit HCl auf 9,5 eingestellt. Der Puffer wurde autoklaviert. 

Waschpuffer 

3 ml Tween 20 wurden mit Puffer 1 auf 1000 ml aufgefüllt. 

Phosphatpuffer 

37 ml 1 M KH PO , 63 ml 1 M Na HPO und 1 ml NaNO wurden mit HCl auf einen 

2 4 2 4 3 

pH-Wert von 7,0 eingestellt. 

10x PBS-Puffer (Phosphate Buffered Saline) 

80 g NaCl, 2 g KCl, 11,5 g Na2HPO4 x 7H2O und 2 g KH2PO4 wurden in 1000 ml 

dest. H2O gelöst und autoklaviert. Die Gebrauchslösung wurde 1:10 verdünnt mit 

dest. H2O und enthält einen Zusatz von 0,05 % Tween 80. 

Alle weiteren Geräte, Chemikalien, Enzyme und Gebrauchsmaterialien sind im 

Anhang aufgeführt. 

25

26 

3.2. Methoden 

3.2.1. Anzucht von Bakterien 

Die Anzucht der Bakterien richtete sich nach der Spezies, der gewünschten Menge 

an Kulturmaterial und eventuell erforderlicher Antibiotikazusätze. 

E. coli wurde in 5 ml LBB-Flüssignährmedium angezüchtet. Dazu wurden 5 µl einer 

auf Eis aufgetauten Kultur in das Medium (bei Bedarf mit entsprechendem 

Antibiotikazusatz) überimpft und über Nacht bei 37 °C in einem Schüttelinkubator 

inkubiert. 

Langsam wachsende Mykobakterien wurden in 7H9-Medium angezüchtet. 250µl 

einer tiefgekühlten Kultur wurden auf Eis aufgetaut und in 50 ml 7H9-Medium (bei 

Bedarf mit Antibiotikazusatz) angeimpft. In 1000 ml-Rollflaschen wurden die Kulturen 

7 Tage bei 37 °C auf einer Roll-Einheit mit 2 Umdrehungen pro Minute inkubiert. 

Von allen verwendeten Mykobakterienstämmen wurden Tiefgefrierstammkulturen 

angelegt. 

Zur Konservierung der Bakterien wurde eine flüssige Bakterienkultur, die sich in der 

Wachstumsphase befand, zentrifugiert (2.500 U./min., 10 min, 37 °C), der Überstand 

verworfen und das Bakterienpellet in 7H9-Nährmedium resuspendiert. Nach einer 

weiteren Zentrifugation mit Verwerfen des Überstandes wurden die Bakterien in 7H9- 

Nährmedium mit 15 % Glycerinzusatz resuspendiert, in je 1 ml Portionen in 

Mikroschraubröhren abgefüllt und bei -70 °C eingefroren. 

3.2.2. Präparation von Plasmid-DNA 

Die Minipräparation von Plasmiden wurde mit Hilfe eines Kits der Firma Qiagen 

durchgeführt. Die Methode basiert auf alkalischer Denaturierung hochmolekularer, 

chromosomaler DNA in Einzelstränge, während niedermolekulare Plasmid-DNA nicht 

denaturiert wird. Auf diese Weise ist es möglich, Plasmid-DNA aus Zellen zu 

gewinnen und sie gleichzeitig von chromosomaler DNA zu bereinigen. 

1,5 ml einer Übernacht-Kultur von E. coli wurden in einem Eppendorfgefäß bei 13000 

U/min zentrifugiert. Das Bakterienpellet wurde in 100 µl Resuspensionspuffer P1 

gelöst. Anschließend wurde 100 µl Lysepuffer P2 hinzupipettiert und für 5 min bei 

Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe von 100 µl Neutralisationspuffer wurde das 

Gefäß für 15 min. auf Eis inkubiert. Zellreste wurden mit 13000 U/min. abzentrifugiert

und der Überstand in ein neues Gefäß überführt. Jetzt wurden 300µl Phenol- 

Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1) hinzugefügt und erneut bei 10000 U/min 5 min. 

zentrifugiert. Der plasmidhaltige Überstand wurde in ein neues Eppendorfgefäß 

überführt (die untere Phenolphase wurde verworfen) und mit 800 µl 96 % Ethanol 15 

min auf Eis gekühlt. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt bei 13.000 U/min. 

und 5 min, wurde das entstandene Pellet mit 1 ml 70 %igem Ethanol gewaschen und 

3 min 13000 U/min. zentrifugiert. Der Überstand wurde mit der Pipette abgenommen, 

das Pellet an der Luft getrocknet und in 30-40 µl autoklaviertem Aqua dest. 

aufgenommen. Die Lagerung erfolgte bei 4°C. 

3.2.3. Präparation genomischer DNA aus Mykobakterien 

Der entsprechende Stamm M. bovis BCG oder M. tuberculosis wurde in Ink square 

bottles mit 13 ml 7H9-Medium bis zu einer OD600 von ca. 1,0 bei 37°C im 

Schüttelinkubator inkubiert. Unter S3-Bedingungen wurde eine Inaktivierung der 

Bakterien durch 30 min Kochen in Aqua dest. durchgeführt. 10 ml der Kultur wurden 

20 min bei 2500 U/min. und Raumtemperatur abzentrifugiert. Der Überstand wurde 

verworfen. Das Pellet wurde in 1 ml Bakterienlysepuffer resuspendiert und in ein 1,5ml-Eppendorfgefäß 

überführt. In diesem wurde es 10 min bei 13000 U/min 

abzentrifugiert. Der Überstand wurde wiederum verworfen und das Pellet in 450 µl 

Bakterienlysepuffer resuspendiert. Dann wurden 50 µl einer 10-mg/ml- 

Lysozymlösung dazupipettiert und der Ansatz über Nacht bei 37°C bebrütet. Nach 12 

Stunden wurde der Ansatz mit 100 µl 10 % SDS gemischt, es wurden 50 µl 10mg/ml-Proteinase-K-Lösung 

dazugegeben und 30 min bei 55°C inkubiert. Nach einer 

Zugabe von 200 µl 5 M NaCl und 160 µl auf 65°C vorgewärmter Cetrimid-Lösung 

wurde der Ansatz für 10 min im 65°C-Wasserbad inkubiert. Daraufhin wurden 500 µl 

Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) dazupipettiert und nach vorsichtigem Schwenken 5 

min bei 13.000 U/min abzentrifugiert. Der DNA-haltige Überstand wurde 

abgenommen und wiederum mit 500 µl Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) versetzt. 

Nach einem erneuten Zentrifugationsschritt (5 min bei 13000 U/min) wurden 800 µl 

des gereinigten, DNA-haltigen Überstandes mit 560 µl Isopropanol vorsichtig 

gemischt und zwei Stunden bei -20°C gekühlt, bis die DNA präzipitierte. Dann wurde 

die DNA 15 min bei 14000 U/min. in einer Kühlzentrifuge (4°C) abzentrifugiert. Der 

Überstand wurde verworfen und das Pellet mit 1 ml 70 % Ethanol gewaschen. Nach 

27

28 

einem weiteren Zentrifugationsschritt (5 min 13000 U/min) wurde der Überstand 

verworfen, das Pellet 15 min an der Luft getrocknet und mit 35 µl Aqua bidest. 

bedeckt. Bei 4°C wurde das Pellet über Nacht im Aqua bidest. gelöst und gelagert. 

3.2.4. Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen 

Restriktionsenzyme oder –endonucleasen sind in der Lage, doppelsträngige DNA zu 

spalten. Die DNA muss dazu eine bestimmte Nucleotidsequenz von 4 - 10 

aufeinander folgenden Basen aufweisen. Die Enzyme schneiden in dem Bereich der 

Nucleotidsequenz entweder mit (sticky ends) oder ohne (blunt ends) überstehende 

Enden. Für ihre Aktivität benötigen Restriktionsendonucleasen ein spezielles Milieu, 

das durch Zugabe von Puffern erreicht wird. Einige Enzyme benötigen außerdem 

bovines Serumalbumin (BSA) zur Aktivitätssteigerung. 

Per Definition schneidet eine Einheit Enzym 1 µg DNA in einer Stunde. Das 

standardisierte Gesamtvolumen des Reaktionsansatzes betrug 10 µl. Die Ansätze 

wurden 1-2 Stunden bei 37 °C inkubiert. 

3.2.5. Agarose-Gel-Elektrophorese 

Mit Hilfe der Agarose-Gel-Elektrophorese lassen sich durch Restriktionsenzyme 

gespaltene DNA-Fragmente von ca. 200 bis 20.000 bp Größe trennen. Jede DNA 

enthält negativ geladene Phosphatreste, die einem elektrischen Gradienten folgen. 

Je nach Größe der DNA-Stücke wandern diese unterschiedlich schnell in einem 

entsprechenden Transportmilieu. Dieses Transportmilieu ist ein Agarosegel, das in 

Konzentrationen von 0,7 – 1,5 % aus einem Agarosepulver mit 50 x TAE und Wasser 

angesetzt wurde. Durch Aufkochen löst sich das Pulver, so dass eine klare 

Flüssigkeit entsteht. Diese wurde in einen Gelschlitten gegossen, in dem die 

Flüssigkeit aushärtet und in eine Gelphase übergeht. Das Gel wurde in eine mit 

Ladepuffer versehene Elektrophoresekammer eingesetzt. Die DNA wurde in 

Taschen, die beim Gießen des Geles ausgespart wurden, einpipettiert. An der 

Elektrophoresekammer wurde nun für 60 min. eine Spannung von 120V angelegt. 

Anschließend wurde das Gel in einem Ethidiumbromidbad für 10-20 min. gefärbt. 

Dabei interkalierte die DNA mit dem Ethidiumbromid und wurde so, nach einer 10 

min. Entfärbung in dest. H2O, unter UV-Licht sichtbar.

3.2.6. Transformation von M. bovis BCG und M. tuberculosis 

Von den Mykobakterien wurden 100ml einer Vorkultur in 7H9-Medium bis zu einer 

OD600 von 0,8 bis 1,0 angezüchtet. Diese wurde dann abzentrifugiert (3000 U/min, 

20°C, 10 min.), in 10 % Glycerol resuspendiert und erneut abzentrifugiert. Dieser 

Waschschritt wurde noch zweimal wiederholt. Nach dem letzten Waschschritt wurde 

das Pellet in 1/10 des Ursprungsvolumen in 10 % Glycerol aufgenommen und die auf 

diese Weise elektrokompetent gemachten Zellen für die Transformation verwendet. 

400 µl der Bakteriensuspension wurden mit 1 µl DNA (entspricht 0,1-1 µg DNA) 

vermischt und in eine auf 50 °C vorgewärmte Elektroporationsküvette überführt. 

Dann wurde die gefüllte Küvette nochmals 1 min. im Heizblock auf 50 °C angewärmt. 

Anschließend erfolgte die Elektroporation mit einem Gene-Pulser der Firma Bio-Rad. 

Die Geräte-Einstellungen waren: 2,5 kV, 25 µF und 1000 Ω. Nach der Transformation 

wurde die Bakteriensuspension in 1 ml 7H9 überführt und über Nacht bei 37°C 

inkubiert. Nach spätestens 24 Stunden wurde der Ansatz zu je 700 µl auf 7H10- 

OADC-Festnährmedien mit entsprechendem Antibiotikumzusatz ausgestrichen und 

für drei Wochen bei 37 °C inkubiert. 

3.2.7. Polymerase-Ketten-Reaktion 

Mit Hilfe einer PCR lassen sich spezifische DNA-Abschnitte exponentiell 

vervielfältigen (amplifizieren). Hierbei werden bestimmte Oligonukleotide (Primer) 

verwendet, die zu spezifischen DNA-Sequenzen komplementär sind. 

Zuerst wird die doppelsträngige DNA durch eine Temperaturerhöhung auf 92-95 °C 

denaturiert, wobei Einzelstränge entstehen. Bei Temperaturabsenkung lagern sich 

die Primer an die Einzelstrang-DNA an (Annealing) und grenzen so den zu 

amplifizierenden Bereich (Template-DNA) ein. Dabei ist die Annealing-Temperatur 

abhängig von den verwendeten Primern. 

Eine temperaturbeständige DNA-Polymerase nutzt die Primer, um sich nach einer 

Temperaturerhöhung an die Template-DNA anzulagern und diese als Matrize für 

eine neue DNA-Synthese zu verwenden (Extension). Jede Polymerase arbeitet in 

einem bestimmten Temperaturbereich am effektivsten. 

Durch die Wiederholung der Schritte Denaturierung, Annealing und Extension wird 

der gewünscht DNA-Bereich exponentiell vermehrt, weil bei jedem Durchlauf mehr 

Template-DNA zur Verfügung steht. 

29

30 

Das in dieser Arbeit verwendete PCR-Gerät Techne Touchgene wurde mit folgenden 

Einstellungen betrieben: 

Tabelle 3: Einstellungen für das PCR-Gerät 

Schritt Temperatur Dauer Anzahl 

1. Denaturierung 94 °C 120 sec. 1x 

2. Annealing 

Extension 

Denaturierung 

53,5 °C 

72 °C 

94 °C 

120 sec. 

120 sec. 

20 sec. 

3. Extension 72 °C 10 min. 1x 

Der hierbei verwendete Ansatz setzt sich aus folgenden Komponenten zusammen: 

Template-DNA 5,0 µl 

Primer SR3 0,5 µl 

Primer SR4 0,5 µl 

Taq-Polymerase 0,25 µl 

10x Puffer 5,0 µl 

4 mM dNTP´s 2,5 µl 

Aqua bidest. 36,25 µl 

Gesamtansatz 50,0 µl 

3.2.8. Southern Blot-Analyse 

Die zu überprüfende genomische DNA wurde nach einer Spaltung mit 

Restriktionsenzymen in einem Agarosegel ihrer Größe nach aufgetrennt und auf eine 

Nylonmembran übertragen (Blotting). 

Dazu wurde das in Ethidiumbromid gefärbte Agarosegel mit einem UV-Lineal, das 

als Größenstandard diente, fotografiert. 

Dann wurde das Gel 2 x 30 min in einer Schale mit Denaturierungslösung (DNA-I) 

und weitere 2 x 30 min. in Neutralisationspuffer (DNA-II) gewaschen. 

Der Transfer der DNA auf eine Nylonmembran erfolgte über Nacht. Dazu wurde eine 

Lage Whatman-Papier auf einen umgedrehten Gelschlitten gelegt, der in einer 

Schale mit 20 x SSC stand. Das Saugpapier reichte an den längsseitigen Enden 

35x

über den Gelschlitten hinaus bis auf den Boden der Schale. Das Saugpapier wurde 

mit 20 x SSC angefeuchtet. Das Agarosegel wurde umgedreht luftblasenfrei auf das 

Saugpapier gelegt und mit einer Nylonmembran ohne Luftblasenbildung bündig 

bedeckt. Auf die Nylonmembran wurden zwei Lagen Whatman-Papier der 

entsprechenden Größe gelegt. Auf diese Schichten folgte ein ca. 15 cm hoher Stapel 

aus Zellstoff. Die Konstruktion wurde mit einem Gewicht von ca. 600 g beschwert. 

Über einen Zeitraum von ca. 12 Stunden wurden nun durch Kapillarkräfte die DNA- 

Fragmente mit der Transferlösung auf die Nylonmembran übertragen. Nach dem 

Transfer wurde die Nylonmembran zur Fixierung der DNA mit UV-Licht behandelt. 

Nachfolgend wurde die Membran für 1 Stunde bei 65 °C mit 20 ml 

Hybridisierungspuffer / 100 cm 2 Membranfläche prähybridisiert. Durch diesen Schritt 

werden unspezifische Bindungen der DNA-Sonde minimiert. Die 

Prähybridisierungslösung wurde verworfen und durch 2,5 ml Hybridisierungslösung / 

100 cm 2 Membranfläche mit 5-8 µl Dig-DNA-Sonden-Lösung ersetzt. Die 

Hybridisierung erfolgte im Hybridisierungsofen bei 65 °C über Nacht. 

Am nächsten Tag wurde die Membran für 2 x 30 min in Waschlösung I (Wash-I) und 

2 x 30 min in Waschlösung II (Wash-II) bei 65 °C gewaschen. 

Anschließend wurde durch eine 2-Stufen-Detektion mittels Antikörperkonjugat und 

dem Chemilumineszenzsubstrat CSPD eine Hybridisierung nachgewiesen. CSPD 

wird unter alkalischen Bedingungen zu einem instabilen Zwischenprodukt 

dephosphoryliert, das unter Lichtemission zu einem stabilen Endprodukt zerfällt. 

Daher wurden die Membranen 5 min in Waschpuffer gewaschen, 30 min mit 100 ml/ 

100 cm 2 Puffer 2 behandelt und 30 min in 50 ml/ 100 cm 2 Puffer 2 mit 5 µl 1:10.000 

verdünntem Anti-Dig-AP-Konjugat inkubiert. Nach drei Waschschritten in je 50 ml 

Waschpuffer/ 100 cm 2 Membran wurden die Membranen 5 min in je 20 ml Puffer 3 

äquilibriert. Dann wurden sie in eine Schale mit 1:100 in Puffer 3 verdünntem CSPD 

gelegt und 5 min im Dunkeln gehalten. Überschüssiges CSPD wurde daraufhin 

abgenommen, die Membranen in handelsübliche Klarsichtfolie eingeschweißt und 15 

min bei 37°C inkubiert. Dann wurden die eingeschweißten Membranen auf einen 

Röntgenfilm aufgelegt. Nach 20 min. Exposition wurden die Röntgenfilme entwickelt. 

Anhand der Größenmarkierung ließ sich die Größe blotpositiver Fragmente 

bestimmen. 

31

32 

3.2.9. Kultivierung der Mykobakterien unter aeroben Bedingungen 

3.2.9.1. Kultivierung in 7H9-Medium 

Nach Anzucht einer Vorkultur bis zu einer OD600 von ca. 0,8-1,0 wurde diese für 10 

min. bei 3000 U./min. und Raumtemperatur abzentrifugiert. Der Überstand wurde 

verworfen, das Bakterienpellet in 7H9-Medium resuspendiert und wiederum 

zentrifugiert. Dieser Waschschritt wurde noch zweimal wiederholt, um 

sicherzustellen, dass keine eventuell toxischen Stoffwechselprodukte der Bakterien 

im Medium verbleiben. Anschließend wurde das Pellet in 1/10 des 

Ausgangsvolumens resuspendiert. In Rollflaschen, die zuvor mit 50 ml 7H9-Medium 

gefüllt worden waren, wurde nun eine optische Dichte bei 600 nm von ca. 0,02-0,03 

eingestellt. Dann wurden sie über einen Zeitraum von 8 Tagen auf Rolleinheiten bei 

37 °C inkubiert. Die Bestimmung der Keimdichte erfolgte über die Messung der 

OD600 und, je nach Versuchsansatz, über Erstellung einer Verdünnungsreihe und 

Kultivierung derselben auf einem Festnährmedium. 

3.2.9.2. Überprüfung auf Arginin-Assimilation 

Die Kultivierung in Minimalnährmedium mit Arginin erfolgte analog der Kultivierung in 

7H9-Medium. Hier wurde jedoch für die Waschschritte MB-Medium verwendet, 

ebenso für das Resuspendieren. Die Rollflaschen wurden mit 50 ml MB-Medium mit 

ADS gefüllt, die OD600 mit Bakteriensuspension auf 0,03 eingestellt und Arginin in der 

gewünschten Konzentration (10 mmol/l) hinzugefügt. Dann folgte eine Inkubation 

über 8 Tage bei 37 °C auf einer Rolleinheit. Die Bestimmung der Keimdichte erfolgte 

analog zum Verfahren bei der Kultivierung in 7H9-Medium. 

3.2.10. Kultivierung der Mykobakterien unter anaeroben Bedingungen 

3.2.10.1. Überprüfung auf Arginin-Assimilation 

Für die Kultivierung der Mykobakterien unter anaeroben Bedingungen zur 

Überprüfung auf Arginin-Assimilation wurde weitestgehend verfahren wie bei der 

Kultivierung unter aeroben Bedingungen. Allerdings wurden an Stelle der 

Rollflaschen Zellkulturflaschen mit Filterdeckeln verwendet, die einen Gasaustausch 

mit der Umgebung ermöglichen. In den Zellkulturflaschen wurde ein Volumen von 20

ml MB-Medium mit ADS vorgelegt. Die Flaschen wurden in einen Anaerobiertopf der 

Firma Merck eingesetzt, in dem mit dem AnaeroGen System der Firma Oxoid eine 

anaerobe Atmosphäre erzeugt wurde. Zur Überprüfung der anaeroben Verhältnisse 

wurde ein Indikatorpapier der Firma Oxoid verwendet. Die Anaerobiertöpfe wurden 

bei 37 °C in einem Schüttelinkubator inkubiert. 

3.2.10.2. Überprüfung auf Ammoniak-Akkumulation 

Nach Anzucht von 50 ml einer Vorkultur in 7H9-Medium bis zu einer OD600 von ca. 

1,0 wurde diese bei 3000 U./min. und 20°C für 10 min zentrifugiert. Das 

Bakterienpellet wurde in MB-Medium (ohne ADS) resuspendiert und erneut 

zentrifugiert. Dieser Waschschritt wurde noch zweimal wiederholt, bevor das Pellet in 

1/10 des Ausgangsvolumens MB-Medium resuspendiert wurde. Mit dieser 

Bakteriensuspension wurde in Kunststoffröhrchen (Greiner PP 14ml), in denen 12 ml 

MB-Medium vorgelegt wurde, eine Bakteriendichte, deren OD600 ca. 0,4 entsprach, 

eingestellt. Daraufhin wurde die gewünschte Menge an Arginin-Stammlösung bzw. 

Citrullin-Stammlösung hinzugefügt. Die Leerwerte wurden entsprechend ohne 

Bakterien präpariert. Die Röhrchen wurden einem Ständer aufrecht stehend in einen 

Anaerobiertopf eingesetzt, in dem mit dem AnaeroGen System der Firma Oxoid eine 

anaerobe Atmosphäre geschaffen wurde. Diese wurde mit einem Indikator überprüft, 

der sich in Verbindung mit Sauerstoff rot färbt. Die Töpfe wurden in einem 

Brutschrank bei 37 °C inkubiert. 

3.2.10.3. Überprüfung auf Nitratreduktion 

Eine Vorkultur mit einer OD600 von 0,8 - 1,0 wurde zentrifugiert bei 3000 U/min und 

Raumtemperatur für 10 min. Es folgten drei Waschschritte mit MB-Medium mit ADS- 

Zusatz. Nach dem Waschen wurden die Bakterien, abhängig von der OD600 der 

Vorkultur, in 1 – 2 ml MB-Medium resuspendiert. Danach wurden die Zellen in 

Kunststoffröhrchen (Greiner PP) in 10 ml MB-Medium mit 10 % ADS-Zusatz und 0,01 

mol/l KNO3 inokuliert, wobei die OD600 der Bakterien zwischen 0,2 und 0,3 eingestellt 

wurde. Die Bebrütung erfolgte bei 37 °C in einem Anaerobentopf, in dem die 

anaeroben Bedingungen mit dem AnaeroGen System erreicht wurden. Zur 

Überprüfung der anaeroben Bedingungen wurde ein Anaerobenindikator verwendet. 

33

34 

3.2.11. Nitratreduktase-Test 

Die Fähigkeit einiger Bakterien, durch eine Nitratreduktase Nitrat zu Nitrit zu 

reduzieren, wurde mittels einer Diazotierungsreaktion nachgewiesen. Durch 

salpetrige Säure, die aus Nitrit und Essig entsteht, werden primäre Amine in 

Diazoniumsalze umgewandelt. Bei der Diazotierungsreaktion von Sulphanilamid (NIT 

1) und N-N-Dimethyl-1-Naphtylamin (NIT 2) entsteht bei Anwesenheit von Nitrit bzw. 

salpetriger Säure ein Diazoniumsalz von roter Farbe. Diese Farbstoffentwicklung gilt 

als Nachweis des Nitratreduktionsvermögens bei Mikroorganismen. 

Zur Durchführung dieses Tests wurden in ein Eppendorfgefäß mit 1 ml 

Bakteriensuspension jeweils 50 µl NIT 1 und 50 µl NIT 2 gegeben. Das Gefäß wurde 

dann für 7 min. bei 13000 U/min zentrifugiert. Die OD440 des Überstandes wurde 

anschließend gemessen, woraus sich mit Hilfe einer Formel der Nitritgehalt 

berechnen ließ. Diese Formel wurde anhand einer zuvor erstellten Eichkurve 

ermittelt. 

3.2.12. Ammoniaktest 

Absorption 440 

(OD ) + 0,01663 

= Nitritmenge 

( µ mol/l) 

0,00956 

Mit dem Ammoniak-Test der Firma Roche wurde Ammoniak in den verwendeten 

Medien nachgewiesen und quantifiziert. 

Der Test basiert auf einer Reaktion, bei der 2-Oxoglutarat, NADH und Ammoniak von 

einer Glutamatdehydrogenase zu L-Glutamat umgesetzt werden. Bei dieser Reaktion 

wird NADH verbraucht. Die Abnahme der NADH-Menge ist äquivalent zur 

vorhandenen Menge an Ammoniak und kann photometrisch bei einer Wellenlänge 

von 340 nm nachgewiesen werden. 

2-Oxoglutarat + NADH + NH4 + → L-Glutamat + NAD + + H2O

Zur Durchführung dieses Tests wurde in einem Reagenzglas 1 ml Triethanolamin- 

Puffer/2-Oxoglutarat (Lösung 1) vorgelegt und auf Raumtemperatur gebracht. 

Danach wurde eine NADH-Tablette in diesem Medium durch Schütteln gelöst. 

Die Probe wurde aus dem Versuchsansatz entnommen und 5 min. bei 

Raumtemperatur und 13000 U./min. zentrifugiert. Das hierbei abgenommene 

Volumen (0,2-2 ml) richtete sich nach der erwarteten Ammoniakkonzentration in der 

Probe. Wenn sich Bakterien am Boden des Kunststoffröhrchens angesammelt 

hatten, wurde diese durch Aufziehen mit der Pipettenspitze vorsichtig resuspendiert. 

Dadurch wurde eine Erhöhung der Bakteriendichte in dem Ansatz vermieden. Das 

maximale Probevolumen betrug 2 ml. Wurde weniger Probeflüssigkeit eingesetzt, so 

wurde mit dest. H2O auf ein Gesamtvolumen von 2 ml aufgefüllt. 

Die Probe wurde in das Reagenzglas gegeben und durch Schütteln mit der 

Pufferlösung vermischt. Nach 5 min. wurde 1 ml der Lösung in eine Küvette überführt 

und die Extinktion bei einer Wellenlänge von 340 nm photometrisch bestimmt. Zur 

Nullwertbestimmung diente hierbei eine leere Küvette. Die Lösung wurde zurück in 

das Reagenzglas gegeben. Jetzt wurde die Reaktion mit der Zugabe von 20 µl 

GLDH-Lösung (Lösung 2) gestartet und wiederum geschüttelt. 

Nach 30 min. Inkubation bei Raumtemperatur wurde erneut 1 ml der Lösung 

abgenommen und die Extinktion bei 340 nm Wellenlänge bestimmt. Diese Messung 

wurde solange wiederholt, bis sich der Wert nicht mehr änderte. 

Jetzt konnte der Extinktionskoeffizient wie folgt berechnet werden: 

ExtinktionStart – ExtinktionEnde = Extinktionskoeffizient 

Der Extinktionskoeffizient des Leerwertes (Probe ohne Bakterien) wurde nun vom 

Extinktionskoeffizient jeder Probe abgezogen. Daraus ergab sich der so genannte 

bereinigte Extinktionskoeffizient, mit dessen Hilfe sich durch eine Formel der 

Ammoniakgehalt der Probe berechnen ließ: 

35

36 

17,03 x ber. Extinktionskoeffizient 

2100 x Probevolumen 

= 

Ammoniakgehalt 

in g/l 

Ammoniakgehalt in g/l x 0,001 = Ammoniakgehalt in mg/l 

Ammoniakgehalt in mg/l ÷ 0,01703 mg/mmol = Ammoniakgehalt in mmol/l 

3.3. Tierexperimente 

3.3.1. Anzucht und Aufbereitung des Infektionsmaterials 

Das Infektionsmaterial (M. bovis BCG, ∆arcA M. bovis BCG) wurde in 50 ml 7H9- 

Medium in Rollflaschen bei einer Temperatur von 37 °C bis zu einer OD600 von 1,0 

inkubiert. In Portionen zu je 1 ml wurde die Kultur in Eppendorf-Gefäße gegeben und 

für 2 Tage bei -70 °C eingefroren. Nach Ablauf dieser Zeit wurden die Kulturen auf 

Eis aufgetaut und für 3 x 45 Sekunden in einem Ultraschallbad behandelt, wobei 

zwischen den einzelnen Schritten 1 min Pause gelassen wurde. Dieser Schritt führt 

zu einer Trennung eventuell aggregierter Bakterien. Nun konnte eine 

Keimdichtenbestimmung mit Hilfe von Verdünnungsreihen erfolgen, die auf 7H10- 

Platten ausgestrichen wurden. 

Die Einstellung der Lebendkeimzahl des portionierten Infektionsmaterials auf 1 x 10 6 

koloniebildende Einheiten erfolgt durch PBS-Gebrauchslösung. 

3.3.2. Infektion der Versuchstiere 

Die Infektion der Versuchstiere erfolgte durch eine Injektion von 200 µl 

Bakteriensuspension (entspricht 1 x10 6 KBE) in die Schwanzvene. Die Tiere wurden 

5- 10 min. mit einer Rotlichtlampe bestrahlt, damit sich die Schwanzvene besser 

darstellt. Sie wurden in einen Metalltrichter gelegt, durch den der Schwanz fixiert 

werden konnte, um die Injektion zu erleichtern.

3.3.3. Haltung der Versuchstiere 

Die Versuchstiere wurden in den S2-Räumen des Zentralen Tierlabors der 

Medizinischen Hochschule Hannover gehalten. Der Zutritt erfolgte ausschließlich 

über eine Hygieneschleuse. Bei Betreten des Bereichs wurde von den 

Experimentatoren und den Tierpflegern spezielle Schutzkleidung angelegt. Die 

verwendeten immunkompetenten BALB/c-Mäuse stammen aus der Zucht des 

Zentralen Tierlabors. Sie wurden in Kunststoffkäfigen mit Abdeckgitter und 

Filterhaube in Gruppen zu jeweils maximal 8 Tieren gehalten. Die Käfige wurden nur 

zur Infektion, zur Gesundheitskontrolle, zur Tierentnahme für die Sektion und zur 

Fütterung und Säuberung geöffnet. Gefüttert wurde ad libitum mit einem pelletierten 

Alleinfutter für Mäuse und Ratten. Trinkwasser stand ad libitum aus Plastik- 

Tränkflaschen zur Verfügung. Die Weichholzgranulat-Einstreu wurde wöchentlich 

ausgetauscht. 

3.3.4. Tötung und Sektion der Versuchstiere 

Die Tiere wurden durch Diethylether in einem Glasgefäß betäubt. Anschließend 

erfolgten eine Gewichtsbestimmung und die Tötung durch Halswirbeldislokation. 

Durch einen Paramedianschnitt wurde nun das Abdomen eröffnet und die Milz, die 

Leber und die Nieren entnommen. Dann erfolgten die Eröffnung des Thorax und die 

Entnahme der Lunge. Nach Dekapitation wurde von Foramen magnum ausgehend 

die Schädelkalotte eröffnet und das Gehirn entnommen. 

3.3.5. Aufarbeitung des Sektionsmaterials 

Die entnommenen Organe (Leber, Milz, Niere, Lunge, Gehirn) wurden in 1 ml PBS- 

Lösung aufgenommen und auf Eis gekühlt. Sie wurden dann mit einem 

Homogenisator (Ultra-Turrax T8; Ika-Werke) zerkleinert und bis zur weiteren 

Verarbeitung weiter gekühlt. Nach jedem Organ wurde die Homogenisatorspitze in 

70 % Ethanol gereinigt und mit autoklaviertem Aqua dest. gespült. 

Für die histopathologischen Untersuchungen wurden eine Niere und Teile der 

Organe Leber, Lunge, Milz und Gehirn unverzüglich für mindestens 24 Stunden in 

10%igem gepufferten Formalin fixiert. 

37

38 

3.3.6. Bestimmung der Keimdichte in den Organen 

Die Bestimmung der Keimdichte in den Organen erfolgte über abgestufte 

Verdünnungsreihen. Dabei reichten die Verdünnungsstufen von 10 0 – 10 7 . In 

Eppendorf-Gefäßen wurden 900µl 7H9-Medium vorgelegt, 100 µl der 

vorausgegangenen Verdünnungsstufe dazupipettiert und kräftig durchmischt. 50 µl 

jeder Verdünnungsstufe wurden schließlich auf je eine Hälfte einer 7H10-OADC- 

Agarplatte aufgetropft und mit Kunststoff-Impfschlingen ausgestrichen. Die 

Agarplatten wurden zum Schutz gegen Austrocknung in Aluminiumfolie eingewickelt 

und für mindestens drei Wochen im Brutschrank bei 37 °C inkubiert. 

Das Volumen der Organhomogenisate betrug für die Organe: 

• Milz 1,2 ml 

• Leber 1,5 ml 

• Niere 1,2 ml 

• Lunge 1,2 ml 

• Gehirn 1,2 ml 

Die Zahl der koloniebildenden Einheiten in den Organen ließ sich also auf folgende 

Weise berechnen: 

gezählte Kolonien 

x Organvolumen 

Verdünnungsstufe 

x ausgestrichenes 

Volumen 

3.3.7. Herstellung von Paraffinschnitten 

= KBE/Organ 

Die formalin-fixierten Organe wurden auf Kapseln verteilt. Im Institut für Pathologie 

der Medizinischen Hochschule Hannover wurden die Organe weiterbehandelt und 

Paraffinschnitte hergestellt. Die Kapseln wurden in ein Gewebeeinbettungsgerät 

eingehängt und in einem automatisierten Verfahren behandelt.

Tabelle 4: Programm zur Gewebeeinbettung. 

Substanz Dauer (min.) Temperatur (°C) 

Formalin 10% 120 40 

Ethanol 70% 150 40 

Ethanol 90% 60 40 

Ethanol 100% 45 40 

Ethanol 100% 60 40 

Ethanol 100% 60 40 

Ethanol 100% 60 40 

Xylol 45 40 

Xylol 60 40 

Xylol 60 40 

Paraffin 60 60 



Nach Beendigung des Programms wurde das überschüssige Paraffin abgepumpt 

und die Kapseln aus dem Gerät entnommen. Auf einer Ausgießstation wurden die 

Organe in flüssigem Paraffin eingebettet. Nach Abkühlen und Aushärten der 

Paraffinblöcke wurden sie in ein Schlittenmicrotom eingehängt. Es wurde pro Organ 

ein 2 µm dicker Schnitt angefertigt, in ein 50 °C warmes Wasserbad gelegt und auf 

einen Objektträger aufgezogen. Nach dem Trocknen wurden die Präparate in einen 

Heizofen mit 70 °C überführt, um überschüssiges Paraffin ablaufen zu lassen. 

Danach erfolgte die Färbung der Präparate. 

3.3.8. Ziehl-Neelsen-Färbung 

Die Ziehl-Neelsen-Färbung nutzt die den Mykobakterien eigene Säurefestigkeit aus, 

indem durch Erhitzung die Lipidschicht der Bakterienhülle aufgelockert wird und der 

Farbstoff eindringen kann. Nach dem Erkalten wird der Farbstoff in der Lipidschicht 

gehalten, so dass eine Behandlung mit Salzsäure-Alkohol nicht zu einer Entfärbung 

39

40 

führt. Nach einer Gegenfärbung mit Hämalaun stellen sich die Mykobakterien im 

umgebenden Gewebe daher immer noch rot dar. Im Folgenden wird die verwendete 

Ziehl-Neelsen-Färbung für Paraffinschnitte dargestellt: 

• Präparate ca. 20 min bei 60 °C erwärmen, um überschüssiges Paraffin 

ablaufen zu lassen 

• 10 min Xylol 

• absteigende Alkoholreihe (100%, 90%, 70%, 50% Ethanol) 

• entmineralisiertes Wasser 

• 20 min vorgewärmte Ziehl-Neelsen-Lösung (60 °C) 

• kurz an der Luft abkühlen lassen 

• kurz abspülen mit Wasser 

• entfärben in 1% HCl-Alkohol 

• 10 min fließendes Leitungswasser 

• 2 min Hämalaun 

• 10 min fließendes Leitungswasser 

• aufsteigende Alkoholreihe (50%, 70%, 90%, 100%, 100% Ethanol) 

• Xylol 

Anschließend wurden die Präparate mit Corbit eingedeckt.

4. Ergebnisse 

Bei der Sequenzierung des Genoms von M. tuberculosis wurde ein Gen mit 

Homologie zur Arginindeiminase (arcA) von Pseudomonas aeruginosa gefunden. 

Dieses Enzym vermittelt bei Pseudomonaden die anaerobe Desaminierung von 

Arginin, die zur Akkumulation von Ammoniak führt. Es ist bei P. aeruginosa Teil eines 

Genclusters (arcABCD), der für die Enzyme des sog. Arginindeiminasewegs kodiert. 

Dieser ermöglicht es P. aeruginosa unter anaeroben Bedingungen zu wachsen und 

aus Arginin ATP zu generieren (VANDER WAUVEN et al. 1984). Dabei entstehen 

aus 1 mol Arginin 1 mol ATP, 2 mol NH3, 1 mol Ornithin und 1 mol CO2. 

Ein Ziel dieser Arbeit ist es, zu klären, ob bei M. tuberculosis respektive BCG ein 

Analogon zum Arginindeiminaseweg von P. aeruginosa existiert. 

Obwohl der Arginindeiminase-Stoffwechselweg bei anderen Bakterien ausschließlich 

unter anaeroben Bedingungen genutzt wird, kann Arginin auch unter aeroben 

Bedingungen zu Citrullin und Ammoniak abgebaut werden. Dabei dient Ammoniak 

als Stickstoffquelle für den Substratstoffwechsel. Jedoch sind für diese 

Argininassimilation andere Argininabbauwege wie zum Beispiel der Arginase-Weg 

und der Arginin-Decarboxylase-Weg verantwortlich. Um den Argininstoffwechsel als 

Ganzes zu betrachten beziehungsweise zu klären, ob das arcA-Gen unter aeroben, 

unter anaeroben oder unter beiden Bedingungen eine Rolle spielt, wurde 

grundsätzlich in dieser Arbeit die Argininassimilation unter aeroben Bedingungen und 

die Arginindesaminierung unter anaeroben Bedingungen untersucht. 

4.1. Untersuchung des Argininstoffwechsels bei M. tuberculosis 

und BCG 

4.1.1. Aerobe Bedingungen 

4.1.1.1. Assimilation von Arginin 

Um zu überprüfen, ob M. tuberculosis und BCG unter aeroben Bedingungen 

Stickstoff aus Arginin assimilieren können, wurden die Wildtypen in einem Minimal- 

Medium mit 10 mM Arginin bei einer OD600 von ca. 0,03 angeimpft und über 10 Tage 

bei 37°C inkubiert. Außerdem wurde der Ammoniakgehalt im Medium bestimmt. 

41

42 

Wachstum (OD 600 ) 

1,4 

1,2 

1,0 

0,8 

0,6 

0,4 

0,2 

0,0 

Wachstum BCG mit Arginin 10 mM 

Wachstum BCG ohne Zusatz 

Ammoniakgehalt BCG mit Arginin 10mM 

Ammoniakgehalt BCG ohne Zusatz 

0 2 4 6 8 

Zeit (Tage) 

Abbildung 2: Arginin-Assimilation von BCG 

Die Bakterien wurden in MB-Medium mit ADS in Rollflaschen unter aeroben Bedingungen 

bei 37°C inkubiert. Die Start-OD600 betrug 0,03. Die Argininkonzentration betrug 10 mM. 

Der Ammoniakgehalt wurde an den Tagen 0, 2, 4, 6, 8 nach Versuchsbeginn bestimmt. 

1,4 

1,2 

1,0 

0,8 

0,6 

0,4 

0,2 

0,0 

Ammoniakgehalt (mmol/l)


1,4 

1,2 

1,0 

0,8 

0,6 

0,4 

0,2 

0,0 

Wachstum M. tuberculosis mit Arginin 10 mM 

Wachstum M. tuberculosis ohne Zusatz 

Ammoniakgehalt M. tuberculosis mit Arginin 10 mM 

Ammoniakgehalt M. tuberculosis ohne Zusatz 

0 2 4 6 8 

Zeit (Tage) 

Abbildung 3: Arginin-Assimilation von M. tuberculosis 



Der Ammoniakgehalt wurde an den Tagen 0, 2, 4, 6, 8 nach Versuchsbeginn bestimmt. 

Beide Spezies zeigen Wachstum in Form eines Anstiegs der OD600. Parallel dazu 

wurden Verdünnungsreihen zu Beginn und am Ende des Versuchs angefertigt und 

auf 7H10-ADS, einem kommerziell erhältlichen Mykobakterien-Nährboden, 

ausgestrichen. Hierbei zeigte sich ein Anstieg der Bakteriendichte in KBE/ml um ca. 

eine Zehnerpotenz über den Versuchszeitraum von 8 Tagen (Daten nicht gezeigt). 

Da also der Anstieg der OD600 zum Wachstum der Bakterien proportional ist, beziehe 

ich mich im Folgenden nur auf die optische Dichte als Indikator für Wachstum. 

4.1.2. Anaerobe Bedingungen 


Da der obligat aerobe Erreger P. aeruginosa unter anaeroben Bedingungen Arginin 

nicht nur abbaut, sondern auch das gebildete ATP zum Wachstum verwenden kann, 

untersuchten wir, ob diese Fähigkeit vielleicht auch bei M. tuberculosis bzw. BCG 

vorhanden ist. Zu diesem Zweck wurden die Wildtypen in Minimal-Medium mit Zusatz 

1,4 

1,2 

1,0 

0,8 

0,6 

0,4 

0,2 

0,0 

43 

Ammoniakgehalt in mmol/l

44 

von 10 mM Arginin mit einer Start-OD600 von 0,03 angeimpft und über mehrere Tage 

bei 37°C anaerob bebrütet. 


1,4 

1,2 

1,0 

0,8 

0,6 

0,4 

0,2 

0,0 

M. tuberculosis mit Arginin 10 mM 

M. tuberculosis ohne Zusatz 

0 2 4 6 8 10 

Zeit (Tage) 

Abbildung 4: Arginin-Assimilation von M. tuberculosis unter anaeroben Bedingungen 

Die Bakterien wurden in MB-Medium mit ADS in Zellkulturflaschen unter anaeroben 

Bedingungen bei 37°C inkubiert. Die Start-OD600 betrug 0,03. Die Argininkonzentration 

betrug 10 mM. 

Es konnte kein Anstieg der optischen Dichte des Mediums und somit kein Wachstum 

festgestellt werden. 

4.1.2.2. Desaminierung von Arginin und Citrullin 

Beim Arginindeiminaseweg entsteht im ersten Schritt aus Arginin Ammoniak und 

Citrullin. Daher wurde die Ammoniakkonzentration gemessen, die bei Gabe von 

Arginin als einziger Stickstoffquelle unter anaeroben Bedingungen von M. 

tuberculosis und BCG erzeugt wird.

Ammoniakgehalt in mmol/l 

1,4 

1,2 

1,0 

0,8 

0,6 

0,4 

0,2 

0,0 

BCG mit Arginin 10 mM 

BCG ohne Zusatz 

0 2 4 6 8 10 

Zeit (Tage) 

Abbildung 5: Akkumulation von Ammoniak aus Arginin bei BCG 

Die Bakterien wurden in MB-Medium ohne ADS unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C 

inkubiert. Die Start-OD600 betrug 0,4. Die Argininkonzentration betrug 10 mM. Der 

Ammoniakgehalt wurde an den Tagen 0, 1, 5, 7, 9 nach Versuchsbeginn bestimmt. 

45

46 


1,4 

1,2 

1,0 

0,8 

0,6 

0,4 

0,2 

0,0 



0 2 4 6 8 10 

Zeit (Tage) 

Abbildung 6: Akkumulation von Ammoniak aus Arginin bei M. tuberculosis 



Ammoniakgehalt wurde an den Tagen 0, 2, 4, 6, 8, 10 nach Versuchsbeginn bestimmt. 

M. tuberculosis und BCG spalten über den gesamten Versuchszeitraum Ammoniak 

aus Arginin ab und akkumulieren das Ammoniak im Medium. 

Arginin in einer Konzentration von 10 mmol/l führt in MB-Medium ohne ADS zu 

einem pH-Wert von 10,1. Um zu überprüfen, ob dieser hohe pH-Wert einen Einfluss 

auf die Abspaltung von Ammoniak aus Arginin unter anaeroben Bedingungen hat, 

wurde der Versuch auch mit Arginin-HCl durchgeführt. Diese Form des Arginin führt 

zu einem geringeren pH-Wert-Anstieg auf 8,5 in MB-Medium.

Ammoniakgehalt (mmol/l) 

1,4 

1,2 

1,0 

0,8 

0,6 

0,4 

0,2 

0,0 


M. tuberculosis mit Arginin-HCl 10 mM 

M. tuberculosis abgekocht mit Arginin 10 mM 

M. tuberculosis abgekocht mit Arginin-HCl 10 mM 

0 2 4 6 8 10 

Zeit (Tage) 

Abbildung 7: Akkumulation von Ammoniak aus Arginin bzw. Arginin-HCl bei M. 

tuberculosis 


inkubiert. Die Start-OD600 betrug 0,4. Die Konzentration des Arginins bzw. Arginin-HCl 

betrug 10 mM. Der Ammoniakgehalt wurde an den Tagen 0, 2, 4, 6, 8, 10 nach 

Versuchsbeginn bestimmt. 

Es konnte kein Unterschied festgestellt werden. 

Neben Ammoniak entsteht Citrullin bei der ersten Desaminierung im 

Arginindeiminaseweg. Um zu testen, ob der Arginindeiminaseweg bei M. tuberculosis 

und BCG vollständig vorhanden ist, wurde als nächstes Citrullin als Substrat 

verwendet und erneut die Ammoniakbildung gemessen. 

47

48 


0,30 

0,25 

0,20 

0,15 

0,10 

0,05 

0,00 

BCG mit Citrullin 10 mM 

BCG ohne Zusatz 

0 2 4 6 8 10 

Zeit (Tage) 

Abbildung 8: Akkumulation von Ammoniak aus Citrullin bei BCG 


inkubiert. Die Start-OD600 betrug 0,4. Die Citrullinkonzentration betrug 10 mM. Der 

Ammoniakgehalt wurde an den Tagen 0, 2, 4, 5, 7, 9 nach Versuchsbeginn bestimmt.


0,30 

0,25 

0,20 

0,15 

0,10 

0,05 

0,00 

M. tuberculosis mit Citrullin 10 mM 


0 2 4 6 8 10 

Zeit (Tage) 

Abbildung 9: Akkumulation von Ammoniak aus Citrullin bei M. tuberculosis 




Über den gesamten Versuchszeitraum wurde Ammoniak aus Citrullin abgespalten 

und der Metabolit im Medium akkumuliert. Die Ammoniakkonzentration war jedoch 

wesentlich geringer als bei der Desaminierung von Arginin. 

Zusammenfassung: 

• Unter aeroben Bedingungen können sowohl BCG als auch M. tuberculosis 

Arginin assimilieren beziehungsweise als alleinige Stickstoffquelle zum 

Wachstum verwenden. 

• Unter anaeroben Bedingungen spalten beide Spezies Ammoniak aus Arginin 

ab und akkumulieren den Metabolit im Medium. 

• Unter anaeroben Bedingungen wird von beiden Spezies aus Citrullin ebenfalls 

Ammoniak abgespalten, aber in wesentlich geringerem Maße als von Arginin. 

49

50 

4.2. Untersuchung des Argininstoffwechsels bei ∆arcA M. 

tuberculosis und ∆arcA BCG 

Um die potentielle Rolle des arcA-Gens von M. tuberculosis und BCG im 

Argininstoffwechsel näher zu untersuchen, wurden die Wildtypen in Funktionsassays 

phänotypisch mit Deletionsmutanten verglichen. 

Hierzu wurden die in einer vorangegangen Arbeit (RÖHKER 2003) erstellten 

Mutanten ∆arcA M. tuberculosis H37Rv und ∆arcA BCG verwendet. 


4.2.1.1. Wachstum in Vollmedium 

Um auszuschließen, dass ein unspezifischer Wachstumsdefekt bei den 

Deletionsmutanten vorliegt, wurde das Wachstum unter aeroben Bedingungen in 

7H9-Medium, einem kommerziell erhältlichen Mykobakterien-Flüssignährmedium, 

untersucht. Als Stickstoffquellen dienen Ammoniumsulfat und L-Glutamat, das 

zusammen mit Glycerin auch die wichtigste Kohlenstoffquelle darstellt. In diesem 

Medium sollten sich die Bakterien unabhängig von der gesetzten ∆arcA-Mutation 

vermehren können.


2,0 

1,5 

1,0 

0,5 

0,0 

BCG 

∆arcA BCG 

0 2 4 6 8 

Zeit (Tage) 

Abbildung 10: Wachstum von BCG und ∆arcA BCG 

Die Bakterien wurden in 7H9-Medium mit ADS in Rollflaschen unter aeroben Bedingungen 

bei 37°C inkubiert. Die Start-OD600 betrug 0,03. 

51

52 


2,0 

1,5 

1,0 

0,5 

0,0 

M. tuberculosis 

∆arcA M. tuberculosis 

0 2 4 6 8 

Zeit (Tage) 

Abbildung 11: Wachstum von M. tuberculosis und ∆arcA M. tuberculosis 

Die Bakterien wurden in 7H9-Medium mit ADS in Rollflaschen unter aeroben Bedingungen 

bei 37°C inkubiert. Die Start-OD600 betrug 0,03. 

Bei M. tuberculosis und BCG zeigen sowohl die Wildtypen als auch die ∆arcA- 

Mutanten exponentielles Wachstum bis zu einer OD600 von ca. 1,5. Die 

Bakteriendichte wurde auch durch Ausstreichen von Verdünnungsreihen auf 7H10- 

Agar bestimmt. Hierbei ergab sich ein Anstieg der koloniebildenden Einheiten pro ml 

Medium um ca. eine Zehnerpotenz über den Versuchszeitraum (Daten nicht gezeigt). 


Daraufhin wurde der spezifische Einfluß der ∆arcA-Mutation auf den 

Argininstoffwechsel von BCG beziehungsweise M. tuberculosis untersucht. 

Es wurde überprüft, ob eine Deletion des arcA-Gens einen Einfluss auf die Fähigkeit 

von M. tuberculosis und BCG hat, unter aeroben Bedingungen Arginin als alleinige 

Stickstoffquelle für ihr Wachstum zu nutzen.


1,2 

1,0 

0,8 

0,6 

0,4 

0,2 

0,0 


∆arcA BCG mit Arginin 10 mM 

Bakterien ohne Zusatz 

0 2 4 6 8 

Zeit (Tage) 

Abbildung 12: Arginin-Assimilation von BCG und ∆arcA BCG 



53

54 


1,2 

1,0 

0,8 

0,6 

0,4 

0,2 

0,0 


∆arcA M. tuberculosis mit Arginin 10 mM 


0 2 4 6 8 

Zeit (Tage) 

Abbildung 13: Arginin-Assimilation von M. tuberculosis und ∆arcA M. tuberculosis 



Zwischen Wildtypen und Mutanten ist kein phänotypischer Unterschied im Wachstum 

unter aeroben Bedingungen mit Arginin als alleiniger Stickstoffquelle festzustellen. 



Hierbei wurde untersucht, ob eine Deletion des arcA-Gens bei M. tuberculosis und 

BCG die Abspaltung von Ammoniak aus Arginin unter anaeroben Bedingungen 

verändert.

Ammoniakgehalt (mmol/l) 

1,4 

1,2 

1,0 

0,8 

0,6 

0,4 

0,2 

0,0 




0 2 4 6 8 10 

Zeit (Tage) 

Abbildung 14: Akkumulation von Ammoniak aus Arginin bei BCG und ∆arcA BCG 




55

56 


1,4 

1,2 

1,0 

0,8 

0,6 

0,4 

0,2 

0,0 




0 2 4 6 8 10 

Zeit (Tage) 

Abbildung 15: Akkumulation von Ammoniak aus Arginin bei M. tuberculosis und ∆arcA 

M. tuberculosis 




Die ∆arcA-Mutanten von BCG und M. tuberculosis produzieren unter anaeroben 

Bedingungen keinen Ammoniak aus Arginin mehr. 

Die Deletion des arcA-Gens sollte keinen Einfluss auf den weiteren Abbau von 

Citrullin, dem Produkt der ersten Desaminierung, haben. Daher wurde die 

Abspaltung von Ammoniak aus Citrullin bei Wildtypen und Mutanten vergleichend 

untersucht.


0,30 

0,25 

0,20 

0,15 

0,10 

0,05 

0,00 


∆arcA BCG mit Citrullin 10 mM 


0 2 4 6 8 10 

Zeit (Tage) 

Abbildung 16: Akkumulation von Ammoniak aus Citrullin bei BCG und ∆arcA BCG 




57

58 


0,30 

0,25 

0,20 

0,15 

0,10 

0,05 

0,00 


∆arcA M. tuberculosis mit Citrullin 10 mM 


0 2 4 6 8 10 

Zeit (Tage) 

Abbildung 17: Akkumulation von Ammoniak aus Citrullin bei M. tuberculosis und 

∆arcA M. tuberculosis 




Beide Spezies spalten als Wildtypen bzw. als ∆arcA-Mutanten unter anaeroben 

Bedingungen Ammoniak aus Citrullin ab. 


• Die ∆arcA-Mutanten von BCG und M. tuberculosis wachsen unter aeroben 

Bedingungen in Vollmedium in einer mit den Wildtypen vergleichbaren 

Geschwindigkeit. 

• Die ∆arcA-Mutanten von BCG und M. tuberculosis können unter aeroben 

Bedingungen Arginin assimilieren und für ihr Wachstum verwenden. 

• Die ∆arcA-Mutanten von BCG und M. tuberculosis spalten unter anaeroben 

Bedingungen kein Ammoniak aus Arginin ab. 

• Aus Citrullin spalten die ∆arcA-Mutanten unter anaeroben Bedingungen 

Ammoniak ab.

4.3. Komplementation von ∆arcA M. tuberculosis und ∆arcA BCG 

Als nächstes sollte überprüft werden, ob eine Wiederherstellung des Phänotyps von 

BCG und M. tuberculosis bei den ∆arcA-Mutanten mittels Komplementation mit dem 

arcA-Gen erreicht werden konnte. Hierzu wurde das Plasmid pCR5 verwendet, das 

aus einer vorangegangenen Arbeit stammt (RÖHKER 2003). Es trägt als integrativer 

Vektor ein vollständiges arcA-Gen aus M. tuberculosis und eine Kanamycin- 

Resistenzkassette (Abb. 18). 

-1 

-2 

ArcA 

6000 

7000 

5000 

pCR5 

7998 bps 

Abbildung 18: Konstrukt pCR5 zur Komplementation der ∆arcA-Mutanten 

'+1 

Dieses Konstrukt wurde in ∆arcA M. tuberculosis und ∆arcA BCG transformiert. Um 

zu gewährleisten, dass das Plasmid nicht aus den Mutanten eliminiert wird, wurden 

sie danach mit dem entsprechenden Kanamycin-Zusatz inkubiert. 

4000 

1000 

3000 

2000 

oriE 

int 

aph 

59

60 



Um zu überprüfen, ob ein Effekt des komplementierten arcA-Gens auf die 

Assimilation von Arginin unter aeroben Bedingungen besteht, wurden die 

komplementierten ∆arcA-Mutanten von BCG und M. tuberculosis in Minimalmedium 

mit Arginin als alleiniger Stickstoffquelle inkubiert. 


1,2 

1,0 

0,8 

0,6 

0,4 

0,2 

0,0 



∆arcA BCG::arcA + 


Bakterien ohne Arginin 

0 2 4 6 8 

Zeit (Tage) 

Abbildung 19: Arginin-Assimilation von BCG, ∆arcA BCG und ∆arcA BCG::arcA + M. 

tuberculosis 


bei 37°C inkubiert. Die Start-OD600 betrug 0,03. Die Argininkonzentration betrug 10 mM.


1,0 

0,8 

0,6 

0,4 

0,2 

0,0 



∆arcA M. tuberculosis::arcA + 

M. tuberculosis mit Arginin 10mM 

Bakterien ohne Arginin 

0 2 4 6 8 

Zeit (Tage) 

Abbildung 20: Assimilation von Arginin in M. tuberculosis, ∆arcA M. tuberculosis und 

∆arcA M. tuberculosis::arcA + M. tuberculosis 



Die Wildtypen, ∆arcA-Mutanten und komplementierten Mutanten wachsen mit 

Arginin als alleiniger Stickstoffquelle. 



Unter anaeroben Bedingungen sollte der Phänotyp der Wildtypen durch die 

Komplementation der ∆arcA-Mutanten mit dem Wildtypgen wieder zum Ausdruck 

kommen. Hierzu wurde, wie in den vorangegangenen Versuchen, die Akkumulation 

von Ammoniak aus Arginin unter anaeroben Bedingungen gemessen. 

61

62 


1,4 

1,2 

1,0 

0,8 

0,6 

0,4 

0,2 

0,0 






0 2 4 6 8 10 

Zeit (Tage) 

Abbildung 21: Akkumulation von Ammoniak aus Arginin bei BCG, ∆arcA BCG und 

∆arcA BCG::arcA + M. tuberculosis 





1,4 

1,2 

1,0 

0,8 

0,6 

0,4 

0,2 

0,0 






0 2 4 6 8 10 

Zeit (Tage) 

Abbildung 22: Akkumulation von Ammoniak aus Arginin bei M. tuberculosis, ∆arcA M. 

tuberculosis und ∆arcA M. tuberculosis::arcA + M. tuberculosis 




Im Verlauf der Versuche konnte festgestellt werden, dass die Komplementation der 

∆arcA-Mutanten den Phänotyp des Wildtyps wiederherstellte. Es fand also wieder 

eine Desaminierung von Arginin statt, wobei das Ammoniak im Medium akkumuliert 

wurde. 

Jetzt sollte überprüft werden, ob die Desaminierung von Citrullin, also die zweite 

Desaminierung des Arginindeiminasewegs, durch die Komplementation beeinflusst 

wird. 

63

64 


0,30 

0,25 

0,20 

0,15 

0,10 

0,05 

0,00 


∆arcA BCG mit Citrullin 10 mM 




0 2 4 6 8 10 

Zeit (Tage) 

Abbildung 23: Akkumulation von Ammoniak aus Citrullin bei BCG, ∆arcA BCG und 

∆arcA BCG::arcA + M. tuberculosis 





0,30 

0,25 

0,20 

0,15 

0,10 

0,05 

0,00 






0 2 4 6 8 10 

Zeit (Tage) 

Abbildung 24: Akkumulation von Ammoniak aus Citrullin bei M. tuberculosis, ∆arcA 

M. tuberculosis und ∆arcA M. tuberculosis::arcA + M. tuberculosis 




Es wurde von allen Stämmen Ammoniak aus Citrullin abgespalten. 


• Die komplementierten Mutanten ∆arcA BCG::arcA + M. tuberculosis und ∆arcA M. 

tuberculosis::arcA + M. tuberculosis wachsen unter aeroben Bedingungen mit Arginin 

als alleiniger Stickstoffquelle. 

• Die Komplementation mit dem arcA-Gen aus M. tuberculosis führt bei ∆arcA 

BCG und ∆arcA M. tuberculosis wieder zur Akkumulation von Ammoniak aus 

Arginin unter anaeroben Bedingungen. 

• Die komplementierten Mutanten ∆arcA BCG::arcA + M. tuberculosis und ∆arcA M. 

tuberculosis::arcA + M. tuberculosis akkumulieren Ammoniak aus Citrullin unter 

anaeroben Bedingungen. 

65

66 

4.4. Vergleich von ∆arcA BCG mit BCG in BALB/c-Mäusen 

4.4.1. Quantitative Analyse der Keimdichte von BCG und ∆arcA BCG in 

den Organen von BALB/c-Mäusen 

In früheren Arbeiten (Weber 2000, Fritz 2002) wurde gezeigt, dass 

Deletionsmutanten mit Defekten im Stickstoffstoffwechsel in vivo attenuiert sein 

können. Im folgenden Experiment sollte untersucht werden, ob ein solcher Effekt in 

vivo auch bei einer Deletion des arcA-Gens auftritt. Dazu wurde eine Gruppe von 

immunkompetenten BALB/c-Mäusen mit BCG, eine andere mit ∆arcA BCG infiziert. 

Den Tieren wurde in die Schwanzvene eine Bakterienzahl von 1x10 6 KBE inokuliert. 

Im weiteren Verlauf des Versuchs wurden in definierten zeitlichen Abständen Mäuse 

getötet, um ihre Organe bezüglich Bakterienlast und auf histopathologische 

Veränderungen hin zu untersuchen. 

4.4.1.1. Keimdichte in der Lunge 

Bei den Mäusen, die mit dem BCG-Wildtyp infiziert waren, war über den gesamten 

Versuchszeitraum von 290 Tagen eine Bakteriendichte im Bereich von 1x10 2 - 1x10 3 

KBE in der Lunge festzustellen. 

Auf diesem Niveau befand sich bis Tag 120 nach Versuchsbeginn auch die 

Bakterienlast in den Lungen der mit ∆arcA BCG infizierten Mäuse. Allerdings war ab 

Tag 170 post infectionem ein Rückgang der Keimzahl zu verzeichnen, der bis zum 

Tag 290 zu einer vollständigen Eliminierung der Bakterien führte. 

In Abbildung 25 werden die Mittelwerte und deren Standardabweichungen der 

Keimdichte aus den Lungen von jeweils drei Mäusen dargestellt.

KBE/Organ Leber 

10 7 

10 6 

10 5 

10 4 

10 3 

10 2 

10 1 

10 0 

10 -1 

BCG 

∆arcA BCG 

0 50 100 150 200 250 300 

Tage 

Abbildung 25: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Lunge von BALB/c-Mäusen 

Die Tiere wurden mit 1 x 10 6 KBE von ∆arcA BCG bzw. des BCG-Wildtyps infiziert. 

4.4.1.2. Keimdichte in der Leber 

In den Lebern der Versuchstiere wurde von Versuchsbeginn an ein kontinuierlicher 

Rückgang der Keimzahlen in beiden Gruppen beobachtet, aber die Gruppe der mit 

dem BCG-Wildtyp infizierten Mäuse zeigte nach Tag 90 des Versuchszeitraumes 

eine Persistenz im Bereich von 1x10 2 - 1x10 3 KBE. 

Jedoch wurde in den Lebern der mit ∆arcA BCG infizierten Tiere ab Tag 170 ein 

Rückgang der Keimzahlen beobachtet, bis schließlich an Tag 200 post infectionem 

keine Mykobakterien mehr nachgewiesen werden konnten (Abb. 26). 

67

68 


10 7 

10 6 

10 5 

10 4 

10 3 

10 2 

10 1 

10 0 

10 -1 

BCG 

∆arcA BCG 

0 50 100 150 200 250 300 

Tage 

Abbildung 26: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Leber von BALB/c-Mäusen 


4.4.1.3. Keimdichte in der Milz 

Die Keimdichte in der Milz war bei den Tieren der BCG-Wildtypgruppe und der mit 

∆arcA BCG infizierten Mäuse über den gesamten Versuchszeitraum nahezu gleich. 

Nach einem leichten Abfall der Bakterienlast bis zum Tag 60 post infectionem ließ 

sich bei beiden Gruppen eine konstante Keimzahl im Bereich von 1x10 3 KBE in der 

Milz nachweisen (Abb. 27).


10 7 

10 6 

10 5 

10 4 

10 3 

10 2 

10 1 

10 0 

10 -1 

BCG 

∆arcA BCG 

0 50 100 150 200 250 300 

Tage 

Abbildung 27: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Milz von BALB/c-Mäusen 


4.4.2. Klinische und pathologisch-anatomische Befunde 

Die Mäuse zeigten über den gesamten Versuchszeitraum ein gutes 

Allgemeinbefinden. Das Fell der Tiere war glatt, sie zeigten ein reges 

Erkundungsverhalten und ein etwaiger Gewichtsverlust wurde nicht festgestellt. 

Die Organe beider Tiergruppen, also die der mit BCG und die der mit ∆arcA BCG 

infizierten Mäuse, wurden nach der Sektion makroskopisch begutachtet und 

gewogen. An Tag 30 post infectionem wurde eine hochgradige Splenomegalie 

festgestellt, die bei beiden Gruppen über den gesamten Versuchzeitraum weiter 

bestand. An den anderen Organen ließen sich makroskopisch keine pathologischanatomischen 

Veränderungen beobachten und das Gewicht der Organe Leber, Milz 

und Niere blieb über den gesamten Versuchszeitraum konstant (Abb. 28). 

69

70 

Gewicht (Gramm) 

2,5 

2,0 

1,5 

1,0 

0,5 

0,0 

BCG Milz 

∆arcA Milz 

BCG Leber 

∆arcA BCG Leber 

BCG Niere 

∆arcA BCG Niere 

0 50 100 150 200 250 300 

Zeit post infectionem (Tage) 

Abbildung 28: Organgewichte von BALB/c-Mäusen nach Infektion mit BCG und ∆arcA 

BCG 

4.4.3. Pathologisch-histologische Organbefunde 

Es sollte überprüft werden, ob sich die Veränderungen in der Keimdichte in den 

Organen auch in histopathologischen Befunden widerspiegeln, und ob im 

histologischen Bild ein Unterschied zwischen Veränderungen, die von BCG oder 

∆arcA BCG herrühren, zu erkennen ist. Daher wurden histologische Schnitte 

angefertigt und nach Ziehl-Neelsen gefärbt. 

4.4.3.1. Histologische Beurteilung der Lunge 

In der Lunge wurden bei den mit BCG infizierten BALB/c-Mäusen ab Tag 30 post 

infectionem Granulome nachgewiesen, die sich während des gesamten 

Versuchszeitraums zeigten. Sie enthielten säurefeste Stäbchen, und in Aufbau und 

Größe waren im Versuchsverlauf keine Unterschiede auszumachen. 

Auch in den Lungen der Mäuse, die mit der ∆arcA-Mutante von BCG infiziert waren, 

waren ab Tag 30 post infectionem deutliche Granulome zu finden. Es wurden auch 

an Tag 290 post infectionem noch Granulome nachgewiesen, aber im

Versuchsverlauf dominierte in dieser Gruppe immer deutlicher das intakte 

Lungengewebe (Abb. 29, Abb. 30). 

71

Tag 60 post infectionem 

BCG ∆arcA BCG 

Abbildung 29: Histologie der Lunge von BALB/c Mäusen infiziert mit 1x 10 6 KBE des BCG-Wildtyps (linkes Bild) bzw. ∆arcA BCG 

(rechtes Bild). 

Ziehl-Neelsen-Färbung. Vergrößerung 25x. Die Pfeile weisen auf granulomatöse Veränderungen hin.



Abbildung 30: Histologie der Lunge von BALB/c Mäusen infiziert mit 1x 10 6 KBE des BCG-Wildtyps (linkes Bild) bzw. ∆arcA BCG 



74 

4.4.3.2. Histologische Beurteilung der Leber 

Auch in den Lebern der mit ∆arcA BCG und BCG infizierten BALB/c-Mäuse fanden 

sich von Tag 30 post infectionem an kleine Granulome. In diesen waren säurefeste 

Stäbchen nachzuweisen. Diese Granulome wurden in beiden Versuchsgruppen 

durchgehend gefunden, bis zum Versuchsende nach 290 Tagen. 

Im histopathologischen Erscheinungsbild der Granulome konnte zwischen den 

Lebern der mit ∆arcA BCG und BCG infizierten Mäuse kein Unterschied beobachtet 

werden (Abb. 31, Abb. 32).



Abbildung 31: Histologie der Leber von BALB/c Mäusen infiziert mit 1x 10 6 KBE des BCG-Wildtyps (linkes Bild) bzw. ∆arcA BCG 





Abbildung 32: Histologie der Leber von BALB/c Mäusen infiziert mit 1x 10 6 KBE des BCG-Wildtyps (linkes Bild) bzw. ∆arcA BCG 



4.4.3.3. Histologische Beurteilung der Niere 

Im histologischen Bild der Nieren beide Tiergruppen, also bei den mit BCG und mit 

∆arcA BCG infizierten Mäusen, zeigten sich ab Tag 56 post infectionem 

Ansammlungen von Entzündungszellen im Bereich der Nierenrinde. Jedoch konnte 

über den Versuchszeitraum nur vereinzelt organisierte Granulome festgestellt 

werden. Bei beiden Versuchgruppen stand das intakte Nierengewebe im 

Vordergrund. In Abbildung 33 wird exemplarisch das histologische Bild an Tag 290 

post infectionem dargestellt. 

77



Abbildung 33: Histologie der Niere von BALB/c Mäusen infiziert mit 1x 10 6 KBE des BCG-Wildtyps (linkes Bild) bzw. ∆arcA BCG 



Folgende Punkte lassen sich aus den Tierexperimenten zusammenfassen: 

• Die Lunge und die Leber der Versuchstiere zeigten ab Tag 170 post 

infectionem einen Rückgang der Keimzahl der ∆arcA Mutante bis zur 

Elimination, während der BCG-Wildtyp persistierte. 

• Die Milz der Versuchstiere zeigte bei ∆arcA BCG und dem BCG-Wildtyp eine 

vergleichbare Keimanzahl bis zum Versuchsende an Tag 290. 

• Im histologischen Bild der Leber und der Niere zeigten sich keine 

Unterschiede zwischen ∆arcA BCG und BCG Wildtyp. 

• Im histologischen Bild der Lunge zeigte sich bei ∆arcA BCG ein Rückgang 

des veränderten Gewebes im Versuchszeitraum, während das Lungengewebe 

der mit dem BCG-Wildtyp infizierten Mäuse konstant Granulome aufwies. 

4.5. Erstellung einer ∆narG ∆arcA Doppelmutante in M. tuberculosis 

Um die Effekte der ∆arcA-Deletion auf den Stickstoffstoffwechsel von M. tuberculosis 

mit einer weiteren Gendeletion zu kombinieren und so eventuell zu verstärken, wurde 

eine Doppelmutante erstellt. Hierzu wurde ein Konstrukt (pSR14) aus einer früheren 

Arbeit verwendet (STERMANN et al. 2003). Dieses Konstrukt trägt eine Deletion im 

narG-Gen. Das narG-Gen kodiert die mykobakterielle Nitratreduktase, die eine Rolle 

bei der mykobakteriellen Persistenz spielt (WEBER et. al. 2000; FRITZ et al. 2002) 

Ebenfalls auf diesem Konstrukt vorhanden ist eine Hygromycinresistenz-Kassette 

sowie ein sacB-Gen, das für eine Levansucrase kodiert. Für die Verwendung in E. 

coli sind die Ampicillinresistenz-Kassette sowie das oriE (Origin of replication in E. 

coli) vorhanden. Das Konstrukt besitzt jedoch kein „Origin of replication“ für 

Mykobakterien (oriM), ist also nicht in der Lage, sich in Mykobakterien zu replizieren. 

Der Sinn der Transformation von nicht-replikativen Plasmiden („suicide plasmids“) ist 

die Integration des Plasmids in das Bakteriengenom in unmittelbarer Nähe des 

Wildtypgens über einen Einzelstrangbruch („single-crossing-over“). Mit Hilfe der 

Hygromycinresistenz (positiver Selektionsmarker) kann auf die Klone selektioniert 

werden, die das Plasmid in ihr Genom integriert haben. 

Nach Inkubation dieser Klone in einem Kulturmedium ohne Selektionsdruck kann es 

zu einer zweiten homologen Rekombination zwischen dem Wildtypgen und den 

Flanken des deletierten Gens kommen („double-crossing-over“). Bei diesem Vorgang 

werden die Antibiotikaresistenz-Kassette, das sacB-Gen und das Wildtypgen aus 

79

80 

dem Bakteriengenom eliminiert. Beim folgenden Schritt werden diese Klone 

selektioniert (negative Selektion), indem sie auf einem sucrosehaltigen Nährboden 

angezüchtet werden. Hierbei produziert dann die Klonpopulation, die noch das sacB- 

Gen trägt, aus der Sucrose die für Mykobakterien toxische Lävane und wird 

abgetötet. Die überlebenden Klone besitzen nun also nur noch das narG-Gen mit der 

Deletion. Die Elimination der Antibiotikaresistenz-Kassette wird schließlich durch 

paralleles Ausplattieren auf Hygromycin-haltigen und –freien Nährböden überprüft. 

4.5.1. Transformation und homologe Rekombination 

narH' 

groEL' 

sacR 

''narG 

sacB 

'narG'' 

amp 

pSR14 

12683 bps 

Hygromycin 

'groEL 

Abbildung 34: Vektorkarte des Konstrukts pSR14 zur Erstellung einer Doppelmutante 

in M. tuberculosis 

OriE 

Cos 

Cos

Das Konstrukt pSR14 wurde in ∆arcA M. tuberculosis H37Rv transformiert. Die 

Kolonien der Bakterien, die auf Hygromycin-haltigem Nährboden gewachsen waren, 

wurden mittels PCR auf eine Kointegration überprüft (Abb. 35). 

Abbildung 35: PCR zur Überprüfung der Kointegration von ∆narG in das Genom von 

∆arcA M. tuberculosis H37Rv. 

Die Ziffern 1 – 8 bezeichnen die genomische DNA der untersuchten hygromycinresistenten 

Klone. 

7 der 8 untersuchten Klone wiesen ein PCR-Amplifikat in der Größe des narG-Gens 

mit Deletion (398 bp) auf. Als Kontrollen wurden das Konstrukt pSR14 

(Amplifikatgröße 398 bp), genomische DNA von M. tuberculosis in verschiedenen 

Verdünnungen (Amplifikatgröße 1122 bp) und destilliertes Wasser mitgeführt. 

Die 7 in der PCR gefundenen Kointegranten mussten nun mit Hilfe eines Southern 

Blots überprüft werden. Dadurch wird sichergestellt, dass sich die Rekombination 

wirklich im Bereich des gewünschten Genortes abgespielt hat („legitime 

Rekombination“), und nicht irgendwo im Genom in einem Bereich mit ähnlicher DNA- 

Sequenz („illegitime Rekombination“). Die chromosomale DNA wurde mit dem 

Restriktionsenzym EcoNI verdaut und mit der narG-Sonde hybridisiert. Auf dem 

Röntgenfilm zeigte sich bei allen 7 untersuchten Klonen ein gegenüber dem 

Wildtypfragment um die Länge des Vektor-Plasmids vergrößertes, einzelnes 

Fragment. Dieses einzelne Fragment kann als Indikator für eine legitime, homologe 

Rekombination gewertet werden, da bei einer illegitimen („homeologen“) 

Rekombination zwei Fragmente entstanden wären. 

81

82 

Abbildung 36: Southern Blot-Hybridisierung zur Überprüfung auf homologe 

Rekombination. 

Die Ziffern 1 – 8 bezeichnen die genomische DNA der PCR-positiven Klone (Der Klon 

Nummer 3 ist nicht aufgeführt, da er in der PCR kein Deletionsfragment aufwies). Die DNA 

wurde mit dem Restriktionsenzym EcoNI geschnitten und mit einer narG-Sonde hybridisiert. 

Zur Kontrolle wurde genomische DNA von M. tuberculosis H37Rv (w) mitgeführt. 

4.5.2. Entfernung des Wildtypgens und Überprüfung der Mutanten 

Alle 7 Klone wurden nun in 7H9-Flüssignährmedium kultiviert, um eine zweite 

Rekombination und damit ein Ausschleusen des Wildtypgens und der Vektor-DNA zu 

ermöglichen („ausloopen“). Danach wurden Verdünnungsreihen der Kulturen 

angefertigt, die auf 7H10-Platten mit Sucrosezusatz ausgestrichen wurden. Die 

Bakterien, die auf diesem Nährboden wachsen konnten, mussten den Vektor in 

einem zweiten Rekombinationsereignis wieder eliminiert haben. Ansonsten hätte das 

im Vektor enthaltene sacB-Gen über eine Levansucraseaktivität zur Bildung 

cytotoxischer Levansäuren geführt. Nach diesem Schritt, und einem erneuten 

Screening auf Hygromycinsensibilität, wurden die hygromycinsensiblen Klone in 

einer PCR auf Elimination des Wildtypgens überprüft (Abb. 37).

Abbildung 37: PCR zur Kontrolle der Elimination des narG-Wildtypgens. 

Die Ziffern 1 – 10 bezeichnen die genomische DNA der untersuchten hygromycinsensiblen 

Klone. Das Amplifikat des Plasmids pSR14 (P) zeigt die Größe des Deletionsfragments. 

Weitere Klone wurden untersucht, sind hier jedoch nicht dargestellt. 

Von insgesamt 22 untersuchten Klonen zeigten 5 nur eine Bande in Größe der 

deletierten narG-Region (398 bp) ohne Wildtypbande (1122 bp). 

Aufgrund einer präferentiellen Amplifikation kleiner Fragmente kann es vorkommen, 

dass das Wildtypgen neben dem deletierten Gen noch vorhanden ist, aber in der 

PCR nicht ausreichend amplifiziert wird. Daher sollte die Elimination des Wildtypgens 

mit einem Southern Blot abschließend bestätigt werden. Die genomische DNA wurde 

mit dem Restriktionsenzym SmaI geschnitten und mit einer narG-Sonde hybridisiert. 

Über Chemolumineszenz wurden die Fragmente auf einem Röntgenfilm abgebildet. 

Da durch die Deletion eine SmaI-Schnittstelle im Bereich des narG-Gens verloren 

geht, weist das Wildtypfragment eine Größe von 1114 bp auf, das Fragment der 

Deletion aber ist 2250 bp groß. Bei den Klonen 4 und 18 war noch die Bande des 

Wildtyps zu erkennen, die Klone 5, 11 und 19 aber zeigten nur das Fragment mit der 

∆narG-Mutation (Abb. 38). Der Klon Nr. 5 wurde im Folgenden funktionell 

charakterisiert. 

83

84 

Abbildung 38: Southern Blot zu Kontrolle der Elimination des ∆narG-Wildtypgens. 

Die Ziffern 4, 5, 11, 18 und 19 bezeichnen die genomische DNA der untersuchten Klone, die 

in der PCR kein Wildtypfragment aufwiesen. Die DNA wurde mit dem Restriktionsenzym 

SmaI geschnitten und mit einer narG-Sonde hybridisiert. 

4.5.3. Untersuchung der Doppelmutante ∆narG ∆arcA M. tuberculosis 

4.5.3.1. Anaerobe Bedingungen 

4.5.3.1.1. Desaminierung von Arginin und Citrullin 

Um zu überprüfen, ob die Doppelmutante ∆narG ∆arcA M. tuberculosis auch 

weiterhin den Phänotyp der einfachen ∆arcA-Mutation zeigt, wurde unter anaeroben 

Bedingungen die Desaminierung von Arginin überprüft. Hierzu wurden die Bakterien 

in Minimalmedium mit Arginin als alleiniger Stickstoffquelle inkubiert und über 10 

Tage der Ammoniakgehalt des Mediums gemessen (Abb. 39).


1,0 M. tuberculosis mit Arginin 10 mM 


∆narG ∆arcA M. tuberculosis mit Arginin 10 mM 

0,8 Bakterien ohne Zusatz 

0,6 

0,4 

0,2 

0,0 

0 2 4 6 8 10 

Zeit (Tage) 

Abbildung 39: Akkumulation von Ammoniak aus Arginin bei M. tuberculosis, ∆arcA M. 

tuberculosis und ∆narG ∆arcA M. tuberculosis 




Die ∆narG ∆arcA Doppelmutante bewirkte, wie die ∆arcA Mutante, keine 

Akkumulation von Ammoniak aus Arginin unter anaeroben Bedingungen. 

Anschließend wurde auch die Akkumulation von Ammoniak aus Citrullin erneut 

untersucht, um auch hier einen Einfluss der Doppelmutation auf den Phänotyp der 

∆arcA-Mutation auszuschließen. 

85

86 


0,30 

0,25 

0,20 

0,15 

0,10 

0,05 

0,00 



∆narG ∆arcA M. tuberculosis mit Citrullin 10 mM 


0 2 4 6 8 10 

Zeit (Tage) 

Abbildung 40: Akkumulation von Ammoniak aus Citrullin bei M. tuberculosis, ∆arcA 

M. tuberculosis und ∆narG ∆arcA M. tuberculosis 




Auch hier wurde kein Ergebnis beobachtet, das einen Effekt der Doppelmutation in 

dieser Versuchsanordnung belegen würde. Aus Citrullin wurde auch von der 

Doppelmutante Ammoniak abgespalten und im Medium angereichert. 

4.5.3.1.2. Nitratreduktaseaktivität 

Das narG-Gen vermittelt die Bildung einer Nitratreduktase, die bei Mykobakterien 

unter anaeroben Bedingungen die Reduktion von Nitrat zu Nitrit katalysiert. Um den 

Erfolg der Gendeletion anhand des Phänotyps der Mutante zu überprüfen, wurden 

die erstellte ∆narG ∆arcA-Mutante und der M. tuberculosis-Wildtyp in einem Minimal- 

Medium unter anaeroben Bedingungen inkubiert. Als alleinige Stickstoffquelle wurde 

nun Nitrat in einer Konzentration von 10 mmol/l hinzugegeben. Dieses wurde nun 

vom M. tuberculosis Wildtyp zu Nitrit umgesetzt, welches im Medium akkumulierte

und über eine Farbreaktion quantifiziert wurde. Die ∆narG ∆arcA-Mutante hingegen 

zeigte keine Akkumulation von Nitrit (Abb. 41). 

Nitrit (µmol/l) 

150 

100 

50 

0 

M. tuberculosis mit Kaliumnitrat 10 mM 

∆narG ∆arcA M. tuberculosis mit Kaliumnitrat 10 mM 


0 2 4 6 8 

Zeit (Tage) 

Abbildung 41: Nitritakkumulation bei M. tuberculosis und ∆narG ∆arcA M. tuberculosis. 

Die Bakterien wurden in MB-Medium unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C inkubiert. Die 

Start-OD600 betrug 0,2. 

Aus diesen Experimenten lässt sich festhalten: 

• Die Doppelmutante ∆narG ∆arcA M. tuberculosis akkumuliert unter 

anaeroben Bedingungen keinen Ammoniak aus Arginin. 


anaeroben Bedingungen Ammoniak aus Citrullin. 


anaeroben Bedingungen kein Nitrit aus Nitrat. 

87

5. Diskussion 

Nach einer aerogenen Infektion mit M. tuberculosis wird der Erreger durch 

Makrophagen phagozytiert. Er wird von diesen jedoch nicht abgetötet, sondern 

schafft es mit Hilfe verschiedener Mechanismen, intrazellulär im Phagosom zu 

persistieren. Dazu gehört die Fähigkeit, die Fusion des Phagosoms mit einem 

bakteriziden Lysosom zu verhindern, und sich den widrigen Bedingungen im Innern 

des Phagosoms zu widersetzen. Mit dieser Strategie gelingt es M. tuberculosis, über 

Jahre und Jahrzehnte im Wirt zu persistieren. Der Erreger wird in den tuberkulösen 

Granulomen durch Abwehrzellen an der Vermehrung und Verbreitung gehindert. 

Wenn der Wirt jedoch in eine Situation gerät, durch die sein Immunsystem 

geschwächt wird, können die Bakterien diesen Augenblick der Schwäche nutzen und 

zu einer Erkrankung führen, die unbehandelt tödlich enden kann. 

Diese Arbeit beschäftigt sich mit den Mechanismen, die es M. tuberculosis 

ermöglichen, in den Phagosomen zu überleben. Es wird angenommen, dass in 

tuberkulösen Granulomen ein anaerobes oder zumindest sauerstoffarmes Milieu 

herrscht (BARCLAY u. WHEELER 1989). Mykobakterien aber werden als strikt 

aerobe Organismen eingestuft. Daher wurden sie in dieser Studie auf ein 

Enzymsystem untersucht, das die Energiegewinnung unter anaeroben Bedingungen 

ermöglichen könnte: den Arginindeiminase-Weg (ADI-Weg). 

Von Pseudomonas aeruginosa ist bekannt, dass dieser obligat aerobe Keim den 

Abbau von Arginin über den Arginindeiminaseweg nutzt, um unter anaeroben 

Bedingungen aus Arginin ATP für sein Wachstum zu generieren (VANDER WAUVEN 

et al. 1984). Dabei entstehen (über die Zwischenstufe Citrullin) Ornithin und 

Carbamoylphosphat, das wiederum zu Ammoniak und CO2 abgebaut wird. Beim 

letzten Schritt wird die Phosphatgruppe dazu verwendet, ADP zu ATP zu 

phosphorylieren. So entstehen aus einem mol Arginin ein Mol Ornithin, zwei Mol 

Ammoniak, ein Mol CO2 und ein Mol ATP. Die dazu benötigten Enzyme Arginin- 

Deiminase (ADI), Ornithin-Transcarbamoylase (cOTCase) und Carbamat-Kinase 

(CK) werden bei Pseudomonas dem Operon arcABCD zugeordnet. 

In einer vorangegangen Arbeit (RÖHKER 2003) wurde gezeigt, dass ein Gen mit 

Homologie zu arcA von P. aeruginosa bei M. tuberculosis und M. bovis BCG 

vorhanden ist. Von diesem, ebenfalls arcA betitelten Gen wurden Deletionsmutanten 

in M. tuberculosis und M. bovis BCG erstellt und in vitro unter anaeroben 

89

90 

Bedingungen auf ihre Funktion untersucht. Die Abspaltung von Ammoniak von 

Arginin als erster Schritt im Arginindeiminaseweg wurde als Messgröße 

herangezogen. Dabei stellte sich heraus, dass unter anaeroben Bedingungen bei 

den Wildtypen von M. tuberculosis und M. bovis BCG eine Desaminierung von 

Arginin stattfand und sich das Ammoniak im Medium anreicherte. Dies war bei den 

Deletionsmutanten nicht der Fall. Also wurden diese Ergebnisse als Beleg für die 

Existenz einer Arginindeiminase angesehen, die durch das Gen arcA kodiert wird. 

Die vorliegende Arbeit knüpft an diese Ergebnisse an. Es sollte durch in-vitro- 

Versuche eine weitere Untersuchung der Arginindeiminase erfolgen. Außerdem 

sollte geklärt werden, ob weitere enzymatische Reaktionen des 

Arginindeiminasewegs, die einen Abbau von Citrullin zu Ornithin, CO2 und Ammoniak 

bei gleichzeitiger Generierung von ATP zur Folge haben, bei M. tuberculosis und M. 

bovis BCG auftreten. Ein weiterer Teil der Arbeit bestand in der Untersuchung, 

welche Bedeutung der Arginindeiminase für die Pathogenese in vivo zukommt. 

5.1. In-vitro-Charakterisierung der ∆arcA-Mutanten 


Die Wildtypen von M. tuberculosis und M. bovis BCG sowie die ∆arcA-Mutanten 

beider Spezies waren in der Lage, mit L-Arginin in einer Konzentration von 10mM als 

alleiniger Stickstoffquelle unter aeroben Bedingungen zu wachsen. Da keine 

Unterschiede im Wachstum zwischen Wildtypen und ∆arcA-Mutanten auftraten, kann 

davon ausgegangen werden, dass die Arginindeiminase in sauerstoffreicher 

Umgebung keine assimilatorische Funktion erfüllt. Andere Enzyme übernehmen 

offenbar vollständig die Assimilation des Arginins. Es sind bei prokaryoten 

Organismen mehrere Abbauwege für Arginin neben dem ADI-Weg bekannt, von 

denen einige auch bei Mykobakterien vorkommen. Zu nennen sind hier der Arginase- 

Weg und der Arginindecarboxylase-Weg (CUNIN et al. 1986). Gen-Homologien zu 

diesen Enzymen sind seit der Sequenzierung des Genoms von M. tuberculosis durch 

COLE und Kollegen im Jahre 1998 bekannt. 

Eine weitere Möglichkeit wäre, dass ein Ausfall der Arginindeiminase mit potentieller 

assimilatorischer Bedeutung für den Stickstoffstoffwechsel (schließlich entstehen 

insgesamt im ADI-Pathway zwei Moleküle Ammoniak aus einem Molekül Arginin)

unter aeroben Bedingungen durch diese anderen Enzyme so kompensiert würde, 

dass kein Unterschied im Wachstum zwischen Wildtypen und Mutanten zu erkennen 

ist. Diese Möglichkeit kann durch die durchgeführten Versuche nicht endgültig 

ausgeschlossen werden. Hierfür müssten Analysen durchgeführt werden, die die 

Expression des arcA-Gens unter aeroben Bedingungen eindeutig be- oder 

widerlegen. 

In diesem Zusammenhang bietet sich ein Vergleich mit den Verhältnissen bei P. 

aeruginosa an, dessen arcA-Gen Homologien zum arcA-Gen von M. tuberculosis 

aufweist. Bei diesem Erreger wurde unter mikroaeroben und anaeroben 

Bedingungen eine stark erhöhte Expression der Enzyme des ADI-Wegs gezeigt 

(MERCENIER et al. 1980), während unter aeroben Bedingungen andere Enzyme für 

die Argininassimilation exprimiert wurden. Auch bei anderen Bakterien, wie 

Mycoplasma spp.(FENSKE und KENNY 1976), Bacillus licheniformis (BROMAN et 

al. 1978) Halobacterium salinarium (HARTMANN et al. 1980) und Enterococcus 

faecalis (SIMON et al. 1982) wird die Arginindeiminase hauptsächlich unter 

anaeroben Bedingungen exprimiert. 

SETH und CONNELL konnten 2000 in ihren Versuchen kein Wachstum von M. bovis 

BCG mit L-Arginin als alleiniger Stickstoffquelle feststellen. In den Experimenten der 

vorliegenden Arbeit ist das jedoch gelungen. Möglicherweise ist das auf 

Unterschiede in der Versuchsanordnung zurückzuführen. Die Kultivierung von 

Mykobakterien war lange Zeit ein Problem (und ist es bei manchen Spezies wie zum 

Beispiel M. leprae heute noch), das die Berücksichtigung vieler Faktoren verlangt. 

Dazu gehören optimale Sauerstoffzufuhr und die Zugabe von Detergentien wie 

Tween ® 80, das die Bakterien in Suspension hält (METCHOCK et al. 1999). 

Auch die Konzentration des Arginins scheint eine Rolle zu spielen. SETH und 

CONNELL zeigten eine Wachstumsinhibition bei M. bovis BCG durch Arginin in 

Vollmedien (in dem auch andere Stickstoffquellen vorliegen), die sich ab einer 

Konzentration von 15mM L-Arginin zeigte. 20mM L-Arginin erwiesen sich hierbei 

sogar als letal für die Mykobakterien, da nach 4 Tagen Inkubation bei 37°C keine 

kultivierbaren Zellen mehr nachzuweisen waren. Bei einer Konzentration von 10mM 

L-Arginin, wie sie in den Versuchen zu dieser Arbeit zur Anwendung kam, wurde 

dieser Effekt jedoch nicht festgestellt. 

91

92 


Der Arginindeiminaseweg ermöglicht es P. aeruginosa, unter anaeroben 

Bedingungen zu wachsen (VANDER WAUVEN et al. 1984). Im Rahmen dieser Arbeit 

konnte bei M. tuberculosis kein Wachstum unter anaeroben Bedingungen mit Arginin 

festgestellt werden. 

Bei P. aeruginosa führt die Nutzung des Arginins als Energiequelle unter anaeroben 

Bedingungen zu einem verlangsamten Wachstum gegenüber aeroben Bedingungen 

(VANDER WAUVEN et al. 1984). Die in dieser Arbeit durchgeführten Experimente 

beschränkten sich auf einen Zeitraum von 10 Tagen. Da M. tuberculosis und M. 

bovis BCG zu den langsam wachsenden Mykobakterien zählen und schon unter 

sauerstoff- und nährstoffreichen Bedingungen eine Generationszeit von 24 Stunden 

aufweisen, ist zu bedenken, dass ein eventuelles anaerobes Wachstum einen 

wesentlich längeren Zeitraum erforderlich machen könnte. 

Beim ersten Schritt des ADI-Wegs wird aus Arginin Ammoniak abgespalten, und es 

entsteht Citrullin. Das abgespaltene Ammoniak akkumuliert im Medium und wurde 

mittels einer photometrisch quantifizierbaren chemischen Reaktion nachgewiesen. 

Unter anaeroben Bedingungen spalteten M. tuberculosis und M. bovis BCG 

Ammoniak aus Arginin ab, die ∆arcA-Mutanten beider Stämme jedoch nicht. Die 

Konzentration des abgespaltenen Ammoniaks lag nach 10 Tagen im Bereich von 

1mM, bei einer Anfangskonzentration des Arginins von 10mM. Mittels einer 

Komplementation mit dem arcA-Gen aus M. tuberculosis war bei den ∆arcA- 

Mutanten eine Wiederherstellung des Wildtyp-Phänotyps möglich. Damit kann diese 

Funktion eindeutig dem Genprodukt des arcA-Gens, der Arginindeiminase, 

zugeschrieben werden. In Verbindung mit den Erkenntnissen aus den Versuchen 

unter aeroben Bedingungen (keine Unterschiede zwischen Wildtypen und ∆arcA- 

Mutanten) kann postuliert werden, dass die Arginindeiminase nur unter anaeroben 

Bedingungen exprimiert wird. 

In dem Medium, das für die Versuche zur Messung der Ammoniakakkumulation 

verwendet wurde, führte eine Konzentration von 10mM L-Arginin zu einer Erhöhung 

des pH-Werts auf bis zu 10,1. Um eventuelle Einflüsse des pH-Werts auf die 

Ammoniakproduktion zu überprüfen, wurden die Versuche ebenfalls mit einer 

anderen Form des Arginins (Arginin-HCl) durchgeführt. Diese verursachte eine 

weniger starke Erhöhung des pH-Werts. Es zeigten sich aber keine Unterschiede in 

der Menge des akkumulierten Ammoniaks.

Die weiteren Schritte des Argininabbaus über den ADI-Weg führen über eine 

katabole Ornithintranscarbamoylase (cOTC), die Citrullin zu Ornithin und 

Carbamoylphosphat umsetzt. Im Genom von M. tuberculosis wurde jedoch kein Gen 

für eine cOTC, sondern nur die Gensequenz für eine anabole OTC gefunden, die als 

Gen argF annotiert wurde (COLE et al. 1998). Das Gen gehört zum Gencluster 

argCJBDFRGH (ZUNIGA et al. 2002). Diese anabole OTC ist ein Enzym der 

Argininbiosynthese. Die Möglichkeit, dass im Genom auch noch eine katabole OTC 

vorhanden ist, besteht jedoch. Im Genom der Bakterien, die auf Gene des ADI-Wegs 

untersucht wurden, lagen diese in unmittelbarer Nähe zueinander. Die Gene in der 

Umgebung von arcA in M. tuberculosis sind bislang noch nicht annotiert. 

Möglicherweise befindet sich darunter ein Gen für eine cOTC, das nicht genügend 

Homologien zu bisher bekannten katabolen Ornithintranscarbamoylasen aufweist, 

um es zu annotieren. 

Anabole und katabole OTCasen sind sich strukturell oft ähnlich. Die normalerweise 

unidirektional funktionierende, katabole OTCase von P. aeruginosa zum Beispiel 

konnte durch Austausch einer Aminosäure an der Carbamoylphosphat-Bindungstelle 

in ein partiell anabol wirksames Enzym umgewandelt werden (BAUR et al. 1990). Die 

Aminosäuresequenz der katabolen OTCase von Halobacterium salinarium ist zum 

großen Teil homolog zu der des anabolen Enzyms bei P. aeruginosa (RUEPP et al. 

1995). Bei Rhizobium etli gelang in vitro sogar die Umkehrung der Funktion des 

katabolen Enzyms (D'HOOGHE et al. 1997). Die bisher untersuchten anabolen 

OTCasen sind zu kataboler Funktion nach bisherigem Kenntnisstand jedoch nicht in 

der Lage. Daher erscheint es unwahrscheinlich, das argF bei M. tuberculosis an der 

Umwandlung von Citrullin zu Carbamoylphosphat und Ornithin beteiligt ist. 

Für das dritte Enzym des Arginindeiminasewegs, die Carbamat-Kinase (CK), ist 

ebenfalls kein Gen im Genom von M. tuberculosis entdeckt worden. Für sie gilt aber 

auch, wie für die cOTCase, dass ein entsprechendes Gen möglicherweise aufgrund 

mangelnder Homologie zu bekannten Genen nicht annotiert wurde. Die Carbamat- 

Kinase, deren Gen bei P. aeruginosa das arcC ist, katalysiert die Hydrolyse von 

Carbamoyl-Phospat zu Ammoniak und CO2, wobei die freiwerdende Phospat-Gruppe 

genutzt wird, um ADP zu ATP zu phosporylieren. 

Es wurde in dieser Arbeit versucht, die Aktivität weiterer Enzyme des ADI-Wegs 

nachzuweisen. Dazu wurde die Ammoniak-Akkumulation aus Citrullin unter 

anaeroben Bedingungen bei M. bovis BCG und M. tuberculosis untersucht, indem 

93

94 

Citrullin als alleinige Stickstoffquelle in Minimalnährmedium angeboten wurde. Es 

wurde also der erste Schritt im ADI-Weg, die Desaminierung von Arginin, umgangen. 

Die ∆arcA-Mutation bei ∆arcA M. tuberculosis und ∆arcA M. bovis BCG sollte folglich 

in diesem Versuch keinen Einfluss haben. Die Ammoniak-Akkumulation müsste unter 

diesen Voraussetzungen aus dem letzten Schritt des ADI-Wegs, der Hydrolyse von 

Carbamoyl-Phospat durch die Carbamat-Kinase (CK) zu CO2 und Ammoniak, 

resultieren. 

Die Wildtypen und die ∆arcA-Mutanten von M. tuberculosis und M. bovis BCG, sowie 

die komplementierten Mutanten, konnten aus L-Citrullin in vergleichbarem Umfang 

Ammoniak abspalten. Die Konzentrationen des Ammoniaks nach 10 Tagen 

Versuchsdauer waren deutlich geringer als bei der Abspaltung aus L-Arginin, sie 

lagen im Bereich von 150-250 µM Ammoniak/l. Vorausgesetzt, die Enzyme cOTC 

und CK sind bei M. tuberculosis und M. bovis BCG vorhanden, könnten diese 

Ergebnisse auf eine unterschiedliche Affinität der Enzyme für ihr Substrat hindeuten. 

Daraus würde eine langsamere Umsetzung der Metabolite resultieren. Bei 

theoretischer sofortiger Umsetzung der verfügbaren Substrate durch cOTCase und 

CK, beginnend mit Citrullin, wäre eine Konzentration des Ammoniaks zu erwarten, 

die der Hälfte dessen entspricht, was mit Arginin als zugesetzter Stickstoffquelle 

umgesetzt wird. 

Möglich wäre allerdings auch, dass durch andere, unbekannte enzymatische 

Reaktionen das Ammoniak aus Citrullin freigesetzt wird. Diese Möglichkeit ist, 

solange keine weiteren Enzyme des ADI-Pathways gefunden werden, nicht 

auszuschließen. Auch eine singulär vorliegende Arginindeiminase könnte für die 

Mykobakterien patho-physiologische Vorteile haben, auf die bei der Diskussion der in 

vivo-Experimente eingegangen wird. 

5.2. In-vivo-Charakterisierung der ∆arcA-Mutante 

Die Bedeutung der Arginindeiminase für die Persistenz von M. bovis BCG wurde an 

immunkompetenten BALB/c-Mäusen untersucht. Die ∆arcA-Mutante von M. bovis 

BCG zeigte hierbei eine deutliche Attenuierung gegenüber dem Wildtyp. Die Lungen 

und die Lebern der mit ∆arcA BCG infizierten Versuchstiere wiesen am Tag 170 

einen Rückgang der Keimbelastung gegenüber dem Wildtyp auf. An den folgenden 

Sektionszeitpunkten waren bei den mit ∆arcA-Mutanten infizierten Mäusen in den

Lebern ab Tag 200 und in den Lungen an Tag 290 keine Mykobakterien mehr 

nachweisbar. Daher lässt sich festhalten, dass die Arginindeiminase für die 

Persistenz von M. bovis BCG in der Lunge und der Leber immunkompetenter Mäuse 

essentiell ist. Die Milzen wiesen überraschenderweise bei beiden Tiergruppen über 

den gesamten Versuchsverlauf eine vergleichbare Bakterienlast auf. Diese 

Beobachtung wurde schon bei Nitratreduktase-Deletionsmutanten von M. bovis BCG 

gemacht (FRITZ 2001). Möglicherweise ist das Nährstoffangebot in der Milz ein 

anderes als in den übrigen Organen, und besser geeignet, unter anaeroben 

Bedingungen die Persistenz von Mykobakterien zu fördern. Eine andere Möglichkeit 

wäre eine höhere Sauerstoffverfügbarkeit, die aber gegenüber den Verhältnissen in 

der Lunge unwahrscheinlich ist. 

Im histologischen Bild zeigte sich in den Lungen ein Unterschied in der Form, dass 

die Granulome sich bei den mit ∆arcA BCG infizierten Mäusen immer weiter 

zurückbildeten, während die mit dem BCG-Wildtyp infizierten Mäuse ein gleich 

bleibend pathologisch verändertes Gewebe mit ausgeprägten Granulomen zeigten. 

In den Lebern war kein Unterschied zwischen beiden Gruppen in der Ausprägung 

der Granulome und ihrer Anzahl zu konstatieren, ebenso in den Nieren. 

Eine Deletion im arcA-Gen könnten auf mehreren Wegen die Persistenz von M. 

bovis BCG im Wirt erschweren. Zum einen ist die Energiegewinnung unter 

anaeroben Bedingungen aus Arginin zu nennen. Vorausgesetzt, die Nutzung dieses 

Stoffwechselwegs ist Mykobakterien möglich, wäre bei einem Wegfall dieser 

Energiequelle der Erreger anfälliger gegen die Abwehrmechanismen der 

Makrophagen und könnte leichter eliminiert werden. 

Eine weitere Möglichkeit wäre, dass durch eine Senkung der intrazellulären 

Argininkonzentration im Makrophagen der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) das 

Substrat entzogen wird. Aktivierte Makrophagen sind in der Lage, mittels so 

genannter reaktiver Stickstoffverbindungen (engl.: reactive nitrogen intermediates, 

RNI) die DNA und Proteine bakterieller Pathogene zu schädigen (ZAHRT und 

DERETIC 2002). Die iNOS ist das Schlüsselenzym für die Herstellung dieser 

Verbindungen, zu denen NO, Nitrat und Nitrit sowie die Zwischenstufen dieser 

Moleküle gehören. Außerdem können dabei zusammen mit hochreaktiven 

Sauerstoffverbindungen stark bakterizid wirksame Oxidantien, wie zum Beispiel das 

Peroxynitrit, entstehen. Es konnte gezeigt werden, das NO in humanen 

Makrophagen, die mit IFN-γ, TNF-α und IL-1R aktiviert worden waren, effektiv zur 

95

96 

Abtötung von M. tuberculosis beitrug (BOSE et al. 1999). Die Hemmung der iNOS, 

zum Beispiel durch Aminoguanidin oder NG-Monomethyl-L-Arginin (NMMA), führte 

bei Mäusen, die mit M. tuberculosis infiziert worden waren, zu einer erhöhten 

Bakterienlast in den Organen, stärkeren histopathologischen Veränderungen und 

einer erhöhten Sterblichkeitsrate (CHAN et al. 1995). Bei humanen Alveolar- 

Makrophagen konnte ein ähnlicher Effekt bei der Elimination von intrazellulärem M. 

bovis BCG beobachtet werden. Die unbehandelten, aktivierten Makrophagen 

konnten den Erreger abtöten, während diese Fähigkeit bei den mit NMMA 

behandelten Zellen deutlich reduziert war (NOZAKI et al. 1997). DILLON und 

Kollegen zeigten, das Arginindeiminase die Konzentration von extrazellulärem 

Arginin effektiv senken und so aktivierte murine Makrophagen an der Synthese von 

NO hindern konnte (DILLON et al. 2002). Dass ein mit M. bovis BCG infizierter, IFNγ-aktivierter 

muriner Makrophage eine erhöhte Aufnahme von extrazellulärem Arginin 

aufweist, wurde von 2001 von PETEROY-KELLY und Kollegen berichtet. In diesem 

Zusammenhang erscheint es also durchaus möglich, dass sich die ∆arcA-Mutante 

von M. bovis BCG (unter anderem) deswegen attenuiert gezeigt hat, weil einer 

Elimination durch die RNI nicht mehr effektiv entgegengewirkt werden konnte. 

Ein anderer möglicher Effekt beruht auf der Beobachtung, dass eine 

Phagolysosomenfusion durch erhöhten Ammoniakgehalt im Phagosomen inhibiert 

werden kann (GORDON et al. 1980). Die lysosomalen Enzyme können den 

intrazellulären Erreger also nicht mehr erreichen. Außerdem zeigten HART und 

Kollegen 1987 durch mikroskopische Untersuchungen, das eine Infektion eines 

Makrophagen mit M. tuberculosis eine Inhibition der saltatorischen Bewegungen von 

Lysosomen zur Folge hat. Diese Mechanismen könnten erheblich zur Persistenz von 

Mykobakterien in Makrophagen beitragen. 

Eine Arginindeiminase könnte also für die Mykobakterien auch ohne die Nutzung der 

Energiegewinnung durch den ADI-Weg Überlebensvorteile im Granulom bewirken. 

5.3. Die ∆narG ∆arcA Doppelmutante 

Die Erstellung einer ∆narG ∆arcA Doppelmutante in M. tuberculosis sollte mit 

Hinblick auf die Entwicklung eines neuen Impfstoffs die Effekte der Nitratreduktase- 

Deletion mit denen der Arginindeiminase-Deletion verbinden. Fritz zeigte 2001, dass 

die ∆narG-Mutante sowohl in immundefizienten BALB/c-Prkdc scid -Mäusen als auch in

immunkompetenten BALB/c-Mäusen attenuiert war. Das narG-Gen ist bei 

Mykobakterien Teil des narGHJI-Operons. Es kodiert bei M. bovis BCG eine 

anaerobe Nitratreduktase, die bei M. tuberculosis noch eine zusätzliche, 

assimilatorische Funktion unter aeroben Bedingungen vermittelt (STERMANN 2003). 

Es wird vermutet, dass die anaerobe Nitratreduktaseaktivität von M. bovis BCG und 

M. tuberculosis eine Möglichkeit darstellt, unter den mikroaeroben oder anaeroben 

Bedingungen des Granuloms Nitrat an Stelle von Sauerstoff als terminalen 

Elektronenakzeptor zu nutzen und damit die Persistenz in vivo zu ermöglichen. 

Die erstellte Doppelmutante ist nun an zwei offensichtlich essentiellen Punkten für 

die Persistenz in vivo geschädigt. Dies wird im Hinblick auf die Verwendung als 

Impfstoff gewünscht, um sich gegen die mögliche Reversion einer Mutation und eine 

damit verbundene Virulenzsteigerung abzusichern. Ob diese sich potenzieren und 

eine noch weiter attenuierte Variante von M. tuberculosis zur Folge haben, muss 

durch Experimente in vivo geklärt werden. 

In vitro ist der Phänotyp der neu entstandenen Doppelmutante im jeweiligen Bezug 

auf anaerobe Nitratreduktaseaktivität und Ammoniakakkumulation unter anaeroben 

Bedingungen aus Arginin gegenüber den Stämmen mit nur einer Mutation identisch. 

Die Mutationen beeinflussen sich also offenbar auf genetischer Ebene nicht. 

97

6. Zusammenfassung 


Untersuchungen zum Argininstoffwechsel bei Mycobacterium bovis BCG in 

vitro und im Infektionsmodell 

Der Erreger der Tuberkulose, Mycobacterium tuberculosis, ist in der Lage, im Wirt 

unter mikroaeroben bis anaeroben Bedingungen jahrelang zu persistieren, obwohl er 

als strikt aerobes Bakterium gilt. Bei der Sequenzierung von M. tuberculosis wurde 

ein Gen annotiert, das Homologien zu arcA von Pseudomonas aeruginosa aufweist. 

Dieses Gen kodiert für die Arginindeiminase. ein Enzym, das bei P. aeruginosa Teil 

eines Stoffwechselwegs (Arginindeiminase-Weg), der es dem obligat aeroben 

Bakterium ermöglicht, unter anaeroben Bedingungen zu wachsen. In einer 

vorangegangenen Arbeit wurden ∆arcA-Deletionsmutanten in M. tuberculosis und M. 

bovis BCG erstellt (RÖHKER 2003). 

Ziel dieser Arbeit war es, die Arginindeiminase in vitro näher zu charakterisieren und 

festzustellen, ob bei M. tuberculosis und M. bovis BCG neben der Arginindeiminase 

weitere Enzyme des Arginindeiminasewegs vorhanden sind. Außerdem wurde 

untersucht, ob eine Deletion des arcA-Gens zu einer Attenuierung von 

Mycobacterium bovis BCG in vivo führt. 

In in-vitro-Untersuchungen dieser Arbeit wurden arcA-Deletionsmutanten von M. 

tuberculosis und M. bovis BCG unter aeroben und anaeroben Bedingungen mit den 

Wildtypen beider Stämme verglichen. Unter aeroben Bedingungen wurde das 

Wachstum mit Arginin als alleiniger Stickstoffquelle untersucht. Alle Stämme zeigten 

Wachstum, es traten keine Unterschiede im Wachstumsverhalten zwischen 

Wildtypen und Mutanten auf. 

Unter anaeroben Bedingungen waren die arcA-Deletionsmutanten, im Gegensatz zu 

den Wildtypen, nicht in der Lage, Ammoniak aus Arginin abzuspalten. Diese 

Fähigkeit erlangten sie durch eine Komplementation mit dem Wildtyp-Gen wieder. 

Daraus kann geschlossen werden, dass das arcA-Gen von M. tuberculosis und M. 

bovis BCG eine Arginindeiminase-Aktivität vermittelt. Außerdem zeigen die 

99

100 

Ergebnisse, dass die durch arcA vermittelte Aktivität nur unter anaeroben 

Bedingungen vorhanden ist. 

Neben Ammoniak ist Citrullin ein weiteres Abbauprodukt der Arginindeiminase- 

Reaktion. Mit Citrullin als alleiniger Stickstoffquelle unter anaeroben Bedingungen 

inkubiert, spalteten die ∆arcA-Mutanten vergleichbare Mengen an Ammoniak aus 

Citrullin ab wie die Wildtypen. Dies weist darauf hin, dass auch die beiden Enzyme 

ArcB und ArcC bei M. tuberculosis und M. bovis BCG vorhanden sind. 

Die abschließenden in vivo-Versuche zeigten, dass die ∆arcA-Mutante von M. bovis 

BCG gegenüber dem Wildtyp in immunkompetenten BALB/c-Mäusen attenuiert ist. 

Dies weist darauf hin, dass die Arginindeiminase eine Rolle für die Persistenz in 

Mäusen spielt. 

Mit Hinblick auf das langfristige Ziel der Entwicklung eines Impfstoffs wurde durch die 

Deletion des narG-Gens in der ∆arcA-Mutante von M. tuberculosis eine ∆narG- 

∆arcA-Doppelmutante erzeugt. In vitro zeigte die Doppelmutante wie erwartet weder 

eine Arginindeiminaseaktivität, noch eine Nitratreduktaseaktivität. Ob sich die 

Attenuierung in vivo durch die zwei vorliegenden Mutationen potenziert, muss in 

Infektionsversuchen untersucht werden.

7. Summary 


101 

Studies on the arginine metabolism of Mycobacterium bovis BCG in vitro and 

in a model of infection 

The causative agent of tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis, is able to persist in 

its host for years under microaerobic or even anaerobic conditions, even though it is 

considered to be an obligate aerobe organism. In the genome sequence of M. 

tuberculosis, a gene with homology to arcA of Pseudomonas aeruginosa was 

annotated. This gene encodes an arginine deiminase, an enzyme that is part of a 

pathway (the arginine deiminase pathway, ADI-Pathway) in P. aeruginosa, enabling it 

to grow under anaerobic conditions. In a previous study, arcA- deletion mutants in M. 

tuberculosis and M. bovis BCG had been constructed (RÖHKER 2003). 

The aim of the present study was to characterize the arginine deiminase in vitro and 

to determine whether further enzymes of the ADI-Pathway are active in M. 

tuberculosis and M. bovis BCG. Furthermore, it was examined if a deletion of the 

arcA-gene in M. bovis BCG leads to attenuation in vivo. 

In the in vitro examinations of this study, the arcA deletion mutants of M. tuberculosis 

and M. bovis BCG were compared to the wildtype strains under anaerobic and 

aerobic conditions. Under aerobic conditions, growth with arginine as the sole 

nitrogen source was analysed. All strains grew under these conditions and no 

differences in growth between mutants and wildtype strains were observed. 

Under anaerobic conditions, the ∆arcA mutants were not able to produce ammonia 

from arginine, in contrast to the wildtype strains. The mutant strains regained this 

ability by complementation with the arcA-gene of M. tuberculosis. Thus, it can be 

concluded that arcA in M. tuberculosis and M. bovis BCG mediates arginine 

deiminase activity. These results also show that the activity mediated by arcA is only 

present under anaerobic conditions. 

Besides ammonia, citrulline is another product of the arginine deiminase reaction. 

Incubated with Citrulline as the sole nitrogen source under anaerobic conditions, the 

∆arcA mutants produced ammonia in comparable rates to the wildtype strains. This

102 

points out that the enzymes ArcB and ArcC are as well present in M. bovis BCG and 

M. tuberculosis. 

It was shown by the in vivo experiments that the ∆arcA-mutant of M. bovis BCG was 

attenuated in immunocompetent BALB/c-mice. Therefore, the arginine deiminase 

seems to play a role for persistence in mice. 

With regards to the long term objective of the development of a new vaccine, a 

∆narG ∆arcA M. tuberculosis double mutant was generated. As expected, it showed 

neither arginine deiminase activity nor nitrate reductase activity. Whether the 

attenuation in vivo is amplified by the double mutation has to be subject of further 

experiments.

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Anhang 

Tabelle 5: Geräte 

Geräte Firma 

Brutschrank Modell B5090 E Heraeus, Osterode 

Cellroll-System mit Antriebseinheit Cellroll integra 

bioscience 

Omnilab, Gehrden 

Elektroporationsgerät Gene Pulser Biorad, München 

Homogenisator Ultra-Turrax T 8 Ika-Werke, Staufen 

Photometer Ultrospec III Pharmacia Biotech, Freiburg 

Pipettierhilfe Pipetman Gilson, Bad Camberg 

Rolleinheit Gilson, Bad Camberg 

Schüttelinkubator Incubator Shaker Model G25 New Brunswick Scientific, New Jersey, 

USA 

Sterilbank hera safe 32 Heraeus, Osterode 

Ultraschallbad Bandelin Sonovex TK 52 Bandelin,Berlin 

Zentrifuge Biofuge pico Heraeus, Osterode 

Zentrifuge Rotanta 96 RSC Hettich, Tuttlingen 

Gewebeeinbettungsgerät Tissue Tek VIP Vogel 

Schlittenmicrotom HM 400 Micron 

Ausgießstation Medite 

Elektrophoresekammer Mini SubCell Bio-Rad, München 

Heizblock BT100 Kleinfeld Labortechnik, Gehrden 

Hybridisierungsofen OV-1 Biometra Göttingen 

PCR-Thermocycler Techne Touchgene Techne, Cambridge, GB 

Laborwaage PL 1200 Mettler, Gießen 

Wasserbad Dräger & Heerhorst, Göttingen 

117

118 

Nährmedien 

Middlebrook 7H9-Flüssigmedium mit ADS (1000ml) 

4,7 g Middlebrook 7H9 wurden in 900 ml dest. H2O gelöst und nach Zugabe von 100 

ml Albumin Dextrose Salz (ADS), 2,5 ml 20% Tween80 und 10 ml 50 % Glycerin 

sterilfiltriert. 

Middlebrook 7H9-Flüssigmedium mit OADC (1000ml) 

4,7 g Middlebrook 7H9 wurden in 960 ml dest. H2O gelöst und nach Zugabe von 40 

ml Middlebrook OADC, 2,5 ml 20% Tween80 und 10 ml 10% Glycerin sterilfiltriert. 

Middlebrook 7H10-Agar mit ADS (1000ml) 

19 g Middlebrook 7H10 wurden in 900 ml dest. H2O gelöst und autoklaviert. 

Nachfolgend wurde der Nährboden auf 50 °C abgekühlt und 100 ml ADS sowie 10 ml 

50% Glycerin hinzugefügt. Dann wurde der Nährboden in Portionen zu je 25 ml in 

Petrischalen gegossen. 

Middlebrook 7H10-Agar mit OADC (1000ml) 

19 g Middlebrook 7H10 wurden in 960 ml dest. H2O gelöst und autoklaviert. 

Nachfolgend wurde der Nährboden auf 50 °C abgekühlt und 40 ml OADC sowie 10 

ml 50 % Glycerin hinzugefügt. Dann wurde der Nährboden in Portionen zu je 25 ml in 

Petrischalen gegossen. Wahlweise wurden 920 ml dest. H2O verwendet und 40 ml 

50 % Sucroselösung hinzugefügt, um eine Sucrosekonzentration von 2 % im Medium 

zu erreichen 

ADS (Albumin Dextrose Natriumchlorid) 

8,1 g Natriumchlorid, 50 g Rinderalbumin und 22 g D-Glucose-Monohydrat wurden in 

950ml dest. H2O gelöst und unter Verwendung einer Sterilfiltrationseinheit gefiltert. 

Mykobakterien-Basalsalz-Medium (MB-Medium) für langsam wachsende 

Mykobakterien (1000 ml) 

100 ml Basissalz-Lösung, 2 ml Spurenelementlösung, 10 ml 50 % Glycerin, 2,5 ml 

20% Tween80, 0,5 ml 1 mol/l MgCl2-Lösung und 0,5 ml 1 mol/l CaCl2-Lösung wurden 

in 885 ml dest. H2O gegeben, gerührt und durch eine Sterilfiltrationseinheit gefiltert. 

Bei Bedarf wurden 785 ml dest H2O verwendet und 100 ml ADS hinzugefügt.

119 

Basissalz-Lösung ohne Stickstoffquelle für MB-Medium (1000ml) 

10 g KH2PO4, 25 g Na2HPO4 und 20 g K2SO4 wurden schrittweise in 950 ml dest. 

H2O gelöst und sterilfiltriert. 

Spurenelementlösung für MB-Medium 

40 mg ZnCl2, 200 mg FeCl3x6H2O, 10 mg CuCl2 x 4H2O, 10 mg MnCl2 x 4H2O, 10 mg 

Na2B4O7 x 10H2O, 10 mg (NH4)6Mo7O24 x 4H2O wurden in 1000 ml destilliertem 

Wasser gelöst und sterilfiltriert. 

LB-Bouillon 

20 g Lennox-Broth-Base wurden in 1000 ml dest H2O gelöst und autoklaviert. 

Tabelle 6: Chemikalien 

Substanz Firma Best.-Nr. 

Agarose Seakem LE Biozym, Hessisch-Oldendorf 840004 

Ammoniummolybdat-tetrahydrat Fluka Chemie, Buchs, Schweiz 9880 

L-Arginin Sigma, Steinheim A5006 

L-Arginin-HCl Sigma, Steinheim A5131 

Bovine Albumin Fraktion V Appli Chem, Darmstadt A1391.0500 

L-Citrullin Sigma, Steinheim C7629 

Diethylether Merck, Darmstadt 100-921 

Di-Natriumhydrogen-Phosphat- 

Heptahydrat 

Sigma Chemical, St. Louis, USA S9390 

Eisen(III)chlorid-hexahydrat Merck, Darmstadt 103-943 

Ethanol MHH Bestand, Hannover 

Ethidiumbromid Gibco BRL, Langley, USA 15585-011 

EDTA Sigma, Steinheim E6758 

Glycerol Merck, Darmstadt 1040931000 

D-Glucose Sigma, Steinheim G5400 

Hygromycin Roche, Mannheim 843555

120 

Isoamylalkohol Fluka-Sigma, Seelze 25666 

Isopropanol Merck, Darmstadt 109634 

Kaliumdihydrogenphosphat Merck, Darmstadt 104-873 

Kaliumchlorid Merck, Darmstadt 104-936 

Kaliumnitrat Fluka Chemie, Buchs, Schweiz 63063 

Kaliumsulfat Merck, Darmstadt 105-153 

Laurylsulfat (SDS) Sigma-Aldrich, Steinheim L570 

Natriumchlorid Merck, Darmstadt 1064045000 

Natriumhydroxid Merck, Darmstadt 1064981000 

Magnesiumchlorid (wasserfrei) Fluka Chemie, Buchs, Schweiz 60419 

Mangan(II)chlorid-tetrahydrat Sigma Chemical, St. Louis, USA M3634 

Middlebrook OADC Enrichment Becton Dickinson, Sparks, USA 211886 

Middlebrook 7H9 Broth Difco Laboratories, Detroit, USA 0713-17 

Middlebrook 7H10 Agar Difco Laboratories, Detroit, USA 0627-17-4 

Natriumborat Sigma Chemical, St. Louis, USA S9640 

Nit 1 + Nit 2 Bio Mérieux, Marcy I`Etoile, 

Frankreich 

70442 

Resuspensionspuffer P1 Qiagen, Hilden 19051 

Lysepuffer P2 Qiagen, Hilden 19052 

Neutralisationspuffer P3 Qiagen, Hilden 19053 

Phenol-Chloroform- 

Isoamylakohol 

Roth, Karlsruhe A156-1 

D(+)-Sucrose Fluka, Steinheim 24106 

TRIS Biomol 50005 

Tween 80 

(Polyoxyethylensorbitan) 

Sigma Chemical, St. Louis, USA P-8074 

Zinkchlorid Fluka Chemie, Buchs, Schweiz 96469 

Ziehl-Neelsen-Lösung Merck, Darmstadt 9215

Tabelle 7: Kits und Größenstandards 

Firma Bestell-Nummer 

Ammoniaktest Roche, Mannheim 1 112 732 

Anti-Dioxigenin-AP Roche, Mannheim 1093274 

Blocking Reagenz Roche, Mannheim 1096176 

CSPD Roche, Mannheim CD010 

Dig-DNA Labeling Kit Roche, Mannheim 1093657 

1 kb DNA Ladder New England Biolabs, Frankfurt 

am Main 

N3232L 

Gene elute plasmid miniprep Kit Sigma, Seelze PLN-10 

Tabelle 8: Enzyme 

Enzym Firma Bestell-Nummer 

SmaI New England Biolabs, Beverly, 

MA, USA 

NotI New England Biolabs, Beverly, 

MA, USA 

BamHI New England Biolabs, Beverly, 

MA, USA 

EcoNI New England Biolabs, Beverly, 

MA, USA 

R0141S 

R0189S 

R0136S 

R0521S 

Lysozym Sigma-Aldrich, Steinheim L6876 

Proteinase K Merck, Darmstadt 124568 

Taq DNA-Polymerase Sigma, Seelze D1806 

121

122 

Tabelle 9: Verbrauchsmaterialien 

Artikel Firma Bestellnummer 

Anaerobenindikator Oxoid, Hampshire, Großbritannien BR 55 

Anaerobentopf Merck, Darmstadt 116.387 

Anaero GenTM Papierbeutel Oxoid, Hampshire, Großbritannien ANO 35 A 

Columbia Agar mit 5 % Schafblut Becton Dickinson, Heidelberg 254071 

Einmal-Injektionskanülen Gr 2 Braun, Melsungen 4657527 

Einmal-Insulinkanülen Braun, Melsungen 4665406 

Einmal-Insulinspritze 1 ml Braun, Melsungen 9161309 

Elektroporationsküvetten Biozym Diagnostik, Hess. Oldendorf 748020 

Falcon-Tubes 15 ml Becton-Dickinson, Heidelberg 352095 

Hybond-Nylonmembran Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, 

GB 

Haltungsfutter Ratten/Mäuse Standard 

Diät 

RPN203N 

Altromin GmBH, Lage 1324 

Impfschlingen (10 µl) Sarstedt, Nürnbrecht 861.562 

Mikro-Schraubröhre 1,5 ml PP Sarstedt, Nürnbrecht 72.692 

Petrischalen 92 x 16 mm Sarstedt, Nürnbrecht 821.473 

Photometerküvetten Sarstedt, Nürnbrecht 67.742 

Pipettenspitzen 1000µl Sarstedt, Nürnbrecht 70.762 

Pipettenspitzen 200µl Sarstedt, Nürnbrecht 70.760 

Reagiergefäße 1,5 ml Sarstedt, Nürnbrecht 72.690 

Röhrchen PS – Tube TC 4,5 ml, steril Greiner bio one, Frickenhausen 120.160 

Röhrchen PP – Tube 14 ml, steril Greiner bio one, Frickenhausen 187.261 

Röhrchen PP – test tubes 50 ml, steril Greiner bio one, Frickenhausen 227.261 

Roller bottles (490 cm2) Corning incorporated, New York, USA 430195 

Roti-Plast Einbettmittel für die Histologie Roth, Karlsruhe 6642.4 

Serologische Pipetten 1 ml Sarstedt, Nürnbrecht 861.251 

Serologische Pipetten 10 ml Sarstedt, Nürnbrecht 861.254

Serologische Pipetten 25 ml Sarstedt, Nürnbrecht 861.685 

Sterile Square media bottles Nalge Nunc international, Rochester, USA 2019-0030 

Sterilfilter 0,2µl Nalge Nunc international, Rochester, USA 190-2500 

Sterilfiltrationseinheit 1 l Corning incorporated, New York, USA 430517 

123

Abbildungsverzeichnis 

Abbildung 1: Arginindeiminaseweg bei Pseudomonas aeruginosa ...................................................... 18 

Abbildung 2: Arginin-Assimilation von BCG .......................................................................................... 42 

Abbildung 3: Arginin-Assimilation von M. tuberculosis.......................................................................... 43 

Abbildung 4: Arginin-Assimilation von M. tuberculosis unter anaeroben Bedingungen........................ 44 

Abbildung 5: Akkumulation von Ammoniak aus Arginin bei BCG ......................................................... 45 

Abbildung 6: Akkumulation von Ammoniak aus Arginin bei M. tuberculosis......................................... 46 

Abbildung 7: Akkumulation von Ammoniak aus Arginin bzw. Arginin-HCl bei M. tuberculosis............. 47 

Abbildung 8: Akkumulation von Ammoniak aus Citrullin bei BCG ........................................................ 48 

Abbildung 9: Akkumulation von Ammoniak aus Citrullin bei M. tuberculosis........................................ 49 

Abbildung 10: Wachstum von BCG und ∆arcA BCG ............................................................................ 51 

Abbildung 11: Wachstum von M. tuberculosis und ∆arcA M. tuberculosis ........................................... 52 

Abbildung 12: Arginin-Assimilation von BCG und ∆arcA BCG ............................................................. 53 

Abbildung 13: Arginin-Assimilation von M. tuberculosis und ∆arcA M. tuberculosis ............................ 54 

Abbildung 14: Akkumulation von Ammoniak aus Arginin bei BCG und ∆arcA BCG ............................ 55 

125 

Abbildung 15: Akkumulation von Ammoniak aus Arginin bei M. tuberculosis und ∆arcA M. tuberculosis 

...................................................................................................................................................... 56 

Abbildung 16: Akkumulation von Ammoniak aus Citrullin bei BCG und ∆arcA BCG ........................... 57 

Abbildung 17: Akkumulation von Ammoniak aus Citrullin bei M. tuberculosis und ∆arcA M. 

tuberculosis................................................................................................................................... 58 

Abbildung 18: Konstrukt pCR5 zur Komplementation der ∆arcA-Mutanten ......................................... 59 

Abbildung 19: Arginin-Assimilation von BCG, ∆arcA BCG und ∆arcA BCG::arcA + 

M. tuberculosis .............. 60 

Abbildung 20: Assimilation von Arginin in M. tuberculosis, ∆arcA M. tuberculosis und ∆arcA M. 

tuberculosis::arcA + 

M. tuberculosis ........................................................................................................ 61 

Abbildung 21: Akkumulation von Ammoniak aus Arginin bei BCG, ∆arcA BCG und ∆arcA 

BCG::arcA + 

M. tuberculosis.................................................................................................................... 62 

Abbildung 22: Akkumulation von Ammoniak aus Arginin bei M. tuberculosis, ∆arcA M. tuberculosis 

und ∆arcA M. tuberculosis::arcA + 

M. tuberculosis ................................................................................. 63 

Abbildung 23: Akkumulation von Ammoniak aus Citrullin bei BCG, ∆arcA BCG und ∆arcA 

BCG::arcA + M. tuberculosis.................................................................................................................... 64 

Abbildung 24: Akkumulation von Ammoniak aus Citrullin bei M. tuberculosis, ∆arcA M. tuberculosis 

und ∆arcA M. tuberculosis::arcA + M. tuberculosis ................................................................................. 65 

Abbildung 25: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Lunge von BALB/c-Mäusen ...................... 67 

Abbildung 26: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Leber von BALB/c-Mäusen....................... 68 

Abbildung 27: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Milz von BALB/c-Mäusen.......................... 69 

Abbildung 28: Organgewichte von Balb/c-Mäusen nach Infektion mit BCG und ∆arcA BCG .............. 70 

Abbildung 29: Histologie der Lunge von BALB/c Mäusen infiziert mit 1x 10 6 KBE des BCG-Wildtyps 

(linkes Bild) bzw. ∆arcA BCG (rechtes Bild)................................................................................. 72

126 

Abbildung 30: Histologie der Lunge von BALB/c Mäusen infiziert mit 1x 10 6 KBE des BCG-Wildtyps 

(linkes Bild) bzw. ∆arcA BCG (rechtes Bild)................................................................................. 73 

Abbildung 31: Histologie der Leber von BALB/c Mäusen infiziert mit 1x 10 6 KBE des BCG-Wildtyps 


Abbildung 32: Histologie der Leber von BALB/c Mäusen infiziert mit 1x 10 6 KBE des BCG-Wildtyps 


Abbildung 33: Histologie der Niere von BALB/c Mäusen infiziert mit 1x 10 6 KBE des BCG-Wildtyps 


Abbildung 34: Vektorkarte des Konstrukts pSR14 zur Erstellung einer Doppelmutante in M. 

tuberculosis................................................................................................................................... 80 

Abbildung 35: PCR zur Überprüfung der Kointegration von ∆narG in das Genom von ∆arcA M. 

tuberculosis H37Rv....................................................................................................................... 81 

Abbildung 36: Southern Blot-Hybridisierung zur Überprüfung auf homologe Rekombination.............. 82 

Abbildung 37: PCR zur Kontrolle der Elimination des narG-Wildtypgens............................................. 83 

Abbildung 38: Southern Blot zu Kontrolle der Elimination des ∆narG-Wildtypgens. ............................ 84 

Abbildung 39: Akkumulation von Ammoniak aus Arginin bei M. tuberculosis, ∆arcA M. tuberculosis 

und ∆narG ∆arcA M. tuberculosis ................................................................................................ 85 

Abbildung 40: Akkumulation von Ammoniak aus Citrullin bei M. tuberculosis, ∆arcA M. tuberculosis 

und ∆narG ∆arcA M. tuberculosis ................................................................................................ 86 

Abbildung 41: Nitritakkumulation bei M. tuberculosis und ∆narG ∆arcA M. tuberculosis..................... 87

Tabellenverzeichnis 

Tabelle 1: Verwendete Plasmide........................................................................................................... 21 

Tabelle 2: Verwendete Bakterienstämme. ............................................................................................ 22 

Tabelle 3: Einstellungen für das PCR-Gerät ......................................................................................... 30 

Tabelle 4: Programm zur Gewebeeinbettung........................................................................................39 

Tabelle 5: Geräte................................................................................................................................. 117 

Tabelle 6: Chemikalien........................................................................................................................ 119 

Tabelle 7: Kits und Größenstandards.................................................................................................. 121 

Tabelle 8: Enzyme............................................................................................................................... 121 

127 

Tabelle 9: Verbrauchsmaterialien........................................................................................................ 122

Danksagung 

129 

An erster Stelle gilt der ganz herzliche Dank Prof. Dr. med. Franz-Christoph Bange, 

der durch Überlassen des Themas nicht nur die Voraussetzung für diese Arbeit 

geschaffen, sondern durch seine intensive und gute Betreuung mit vielen 

Anregungen und Ratschlägen das Gelingen dieser Dissertation ermöglicht hat. 

Ein großer Dank richtet sich an Prof. Dr. med. vet. Peter Valentin-Weigand für die 

Übernahme der Betreuung der Arbeit an der Tierärztlichen Hochschule Hannover. 

Für die Möglichkeit, diese Arbeit am Institut für Medizinische Mikrobiologie und 

Krankenhaushygiene der Medizinischen Hochschule Hannover anzufertigen, möchte 

ich mich bei Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann bedanken. Auch bei Prof. Dr. 

med. Sebastian Suerbaum, der die Institutsleitung mittlerweile übernommen hat, 

möchte ich mich bedanken. 

Ein besonderer Dank geht an Silvia Maaß aus meiner Arbeitsgruppe für ihre 

unendliche Geduld sowie für ihre Hilfestellung und Tipps im Laboralltag. 

Neben allen anderen Doktoranden und Mitarbeitern der Mikrobiologie der 

Medizinischen Hochschule möchte ich ein besonderes Dankeschön an meine 

Arbeitsgruppe (Silvia Maaß, Marion Stermann, Antje Bohrßen, Claudia Röhker, 

Torsten Jäger, Sonja Schultze, Ludwig Sedlacek, Mario Michell Reimer und Claudia 

Plinke) richten, mit denen ich nicht nur während der Laborarbeit, sondern auch bei 

manchem Treffen außerhalb des Labors viel Spaß hatte. 

Der größte Dank gilt meiner Familie für die ständige Unterstützung und die 

gelegentlich nötige Aufmunterung und Ablenkung. Meinen Eltern danke ich 

insbesondere für die jahrelange, geduldige und großzügige Unterstützung während 

meines Studiums und der Promotion.

Untersuchungen zum Argininstoffwechsel bei Mycobacterium bovis ...

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