Untersuchungen zum Argininstoffwechsel bei Mycobacterium bovis ...

ml MB-Medium mit ADS vorgelegt. Die Flaschen wurden in einen Anaerobiertopf der
Firma Merck eingesetzt, in dem mit dem AnaeroGen System der Firma Oxoid eine
anaerobe Atmosphäre erzeugt wurde. Zur Überprüfung der anaeroben Verhältnisse
wurde ein Indikatorpapier der Firma Oxoid verwendet. Die Anaerobiertöpfe wurden
bei 37 °C in einem Schüttelinkubator inkubiert.
3.2.10.2. Überprüfung auf Ammoniak-Akkumulation
Nach Anzucht von 50 ml einer Vorkultur in 7H9-Medium bis zu einer OD600 von ca.
1,0 wurde diese bei 3000 U./min. und 20°C für 10 min zentrifugiert. Das
Bakterienpellet wurde in MB-Medium (ohne ADS) resuspendiert und erneut
zentrifugiert. Dieser Waschschritt wurde noch zweimal wiederholt, bevor das Pellet in
1/10 des Ausgangsvolumens MB-Medium resuspendiert wurde. Mit dieser
Bakteriensuspension wurde in Kunststoffröhrchen (Greiner PP 14ml), in denen 12 ml
MB-Medium vorgelegt wurde, eine Bakteriendichte, deren OD600 ca. 0,4 entsprach,
eingestellt. Daraufhin wurde die gewünschte Menge an Arginin-Stammlösung bzw.
Citrullin-Stammlösung hinzugefügt. Die Leerwerte wurden entsprechend ohne
Bakterien präpariert. Die Röhrchen wurden einem Ständer aufrecht stehend in einen
Anaerobiertopf eingesetzt, in dem mit dem AnaeroGen System der Firma Oxoid eine
anaerobe Atmosphäre geschaffen wurde. Diese wurde mit einem Indikator überprüft,
der sich in Verbindung mit Sauerstoff rot färbt. Die Töpfe wurden in einem
Brutschrank bei 37 °C inkubiert.
3.2.10.3. Überprüfung auf Nitratreduktion
Eine Vorkultur mit einer OD600 von 0,8 - 1,0 wurde zentrifugiert bei 3000 U/min und
Raumtemperatur für 10 min. Es folgten drei Waschschritte mit MB-Medium mit ADS-
Zusatz. Nach dem Waschen wurden die Bakterien, abhängig von der OD600 der
Vorkultur, in 1 – 2 ml MB-Medium resuspendiert. Danach wurden die Zellen in
Kunststoffröhrchen (Greiner PP) in 10 ml MB-Medium mit 10 % ADS-Zusatz und 0,01
mol/l KNO3 inokuliert, wobei die OD600 der Bakterien zwischen 0,2 und 0,3 eingestellt
wurde. Die Bebrütung erfolgte bei 37 °C in einem Anaerobentopf, in dem die
anaeroben Bedingungen mit dem AnaeroGen System erreicht wurden. Zur
Überprüfung der anaeroben Bedingungen wurde ein Anaerobenindikator verwendet.
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