Untersuchungen zum Argininstoffwechsel bei Mycobacterium bovis ...

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Das in dieser Arbeit verwendete PCR-Gerät Techne Touchgene wurde mit folgenden
Einstellungen betrieben:
Tabelle 3: Einstellungen für das PCR-Gerät
Schritt Temperatur Dauer Anzahl
1. Denaturierung 94 °C 120 sec. 1x
2. Annealing
Extension
Denaturierung
53,5 °C
72 °C
94 °C
120 sec.
120 sec.
20 sec.
3. Extension 72 °C 10 min. 1x
Der hierbei verwendete Ansatz setzt sich aus folgenden Komponenten zusammen:
Template-DNA 5,0 µl
Primer SR3 0,5 µl
Primer SR4 0,5 µl
Taq-Polymerase 0,25 µl
10x Puffer 5,0 µl
4 mM dNTP´s 2,5 µl
Aqua bidest. 36,25 µl
Gesamtansatz 50,0 µl
3.2.8. Southern Blot-Analyse
Die zu überprüfende genomische DNA wurde nach einer Spaltung mit
Restriktionsenzymen in einem Agarosegel ihrer Größe nach aufgetrennt und auf eine
Nylonmembran übertragen (Blotting).
Dazu wurde das in Ethidiumbromid gefärbte Agarosegel mit einem UV-Lineal, das
als Größenstandard diente, fotografiert.
Dann wurde das Gel 2 x 30 min in einer Schale mit Denaturierungslösung (DNA-I)
und weitere 2 x 30 min. in Neutralisationspuffer (DNA-II) gewaschen.
Der Transfer der DNA auf eine Nylonmembran erfolgte über Nacht. Dazu wurde eine
Lage Whatman-Papier auf einen umgedrehten Gelschlitten gelegt, der in einer
Schale mit 20 x SSC stand. Das Saugpapier reichte an den längsseitigen Enden
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