Untersuchungen zum Argininstoffwechsel bei Mycobacterium bovis ...

Das Konstrukt pSR14 wurde in ∆arcA M. tuberculosis H37Rv transformiert. Die
Kolonien der Bakterien, die auf Hygromycin-haltigem Nährboden gewachsen waren,
wurden mittels PCR auf eine Kointegration überprüft (Abb. 35).
Abbildung 35: PCR zur Überprüfung der Kointegration von ∆narG in das Genom von
∆arcA M. tuberculosis H37Rv.
Die Ziffern 1 – 8 bezeichnen die genomische DNA der untersuchten hygromycinresistenten
Klone.
7 der 8 untersuchten Klone wiesen ein PCR-Amplifikat in der Größe des narG-Gens
mit Deletion (398 bp) auf. Als Kontrollen wurden das Konstrukt pSR14
(Amplifikatgröße 398 bp), genomische DNA von M. tuberculosis in verschiedenen
Verdünnungen (Amplifikatgröße 1122 bp) und destilliertes Wasser mitgeführt.
Die 7 in der PCR gefundenen Kointegranten mussten nun mit Hilfe eines Southern
Blots überprüft werden. Dadurch wird sichergestellt, dass sich die Rekombination
wirklich im Bereich des gewünschten Genortes abgespielt hat („legitime
Rekombination“), und nicht irgendwo im Genom in einem Bereich mit ähnlicher DNA-
Sequenz („illegitime Rekombination“). Die chromosomale DNA wurde mit dem
Restriktionsenzym EcoNI verdaut und mit der narG-Sonde hybridisiert. Auf dem
Röntgenfilm zeigte sich bei allen 7 untersuchten Klonen ein gegenüber dem
Wildtypfragment um die Länge des Vektor-Plasmids vergrößertes, einzelnes
Fragment. Dieses einzelne Fragment kann als Indikator für eine legitime, homologe
Rekombination gewertet werden, da bei einer illegitimen („homeologen“)
Rekombination zwei Fragmente entstanden wären.
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