Untersuchungen zum Argininstoffwechsel bei Mycobacterium bovis ...

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3.2.11. Nitratreduktase-Test
Die Fähigkeit einiger Bakterien, durch eine Nitratreduktase Nitrat zu Nitrit zu
reduzieren, wurde mittels einer Diazotierungsreaktion nachgewiesen. Durch
salpetrige Säure, die aus Nitrit und Essig entsteht, werden primäre Amine in
Diazoniumsalze umgewandelt. Bei der Diazotierungsreaktion von Sulphanilamid (NIT
1) und N-N-Dimethyl-1-Naphtylamin (NIT 2) entsteht bei Anwesenheit von Nitrit bzw.
salpetriger Säure ein Diazoniumsalz von roter Farbe. Diese Farbstoffentwicklung gilt
als Nachweis des Nitratreduktionsvermögens bei Mikroorganismen.
Zur Durchführung dieses Tests wurden in ein Eppendorfgefäß mit 1 ml
Bakteriensuspension jeweils 50 µl NIT 1 und 50 µl NIT 2 gegeben. Das Gefäß wurde
dann für 7 min. bei 13000 U/min zentrifugiert. Die OD440 des Überstandes wurde
anschließend gemessen, woraus sich mit Hilfe einer Formel der Nitritgehalt
berechnen ließ. Diese Formel wurde anhand einer zuvor erstellten Eichkurve
ermittelt.
3.2.12. Ammoniaktest
Absorption 440
(OD ) + 0,01663
= Nitritmenge
( µ mol/l)
0,00956
Mit dem Ammoniak-Test der Firma Roche wurde Ammoniak in den verwendeten
Medien nachgewiesen und quantifiziert.
Der Test basiert auf einer Reaktion, bei der 2-Oxoglutarat, NADH und Ammoniak von
einer Glutamatdehydrogenase zu L-Glutamat umgesetzt werden. Bei dieser Reaktion
wird NADH verbraucht. Die Abnahme der NADH-Menge ist äquivalent zur
vorhandenen Menge an Ammoniak und kann photometrisch bei einer Wellenlänge
von 340 nm nachgewiesen werden.
2-Oxoglutarat + NADH + NH4 + → L-Glutamat + NAD + + H2O