Untersuchungen zum Argininstoffwechsel bei Mycobacterium bovis ...

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40 führt. Nach einer Gegenfärbung mit Hämalaun stellen sich die Mykobakterien im umgebenden Gewebe daher immer noch rot dar. Im Folgenden wird die verwendete Ziehl-Neelsen-Färbung für Paraffinschnitte dargestellt: • Präparate ca. 20 min bei 60 °C erwärmen, um überschüssiges Paraffin ablaufen zu lassen • 10 min Xylol • absteigende Alkoholreihe (100%, 90%, 70%, 50% Ethanol) • entmineralisiertes Wasser • 20 min vorgewärmte Ziehl-Neelsen-Lösung (60 °C) • kurz an der Luft abkühlen lassen • kurz abspülen mit Wasser • entfärben in 1% HCl-Alkohol • 10 min fließendes Leitungswasser • 2 min Hämalaun • 10 min fließendes Leitungswasser • aufsteigende Alkoholreihe (50%, 70%, 90%, 100%, 100% Ethanol) • Xylol Anschließend wurden die Präparate mit Corbit eingedeckt.
4. Ergebnisse Bei der Sequenzierung des Genoms von M. tuberculosis wurde ein Gen mit Homologie zur Arginindeiminase (arcA) von Pseudomonas aeruginosa gefunden. Dieses Enzym vermittelt bei Pseudomonaden die anaerobe Desaminierung von Arginin, die zur Akkumulation von Ammoniak führt. Es ist bei P. aeruginosa Teil eines Genclusters (arcABCD), der für die Enzyme des sog. Arginindeiminasewegs kodiert. Dieser ermöglicht es P. aeruginosa unter anaeroben Bedingungen zu wachsen und aus Arginin ATP zu generieren (VANDER WAUVEN et al. 1984). Dabei entstehen aus 1 mol Arginin 1 mol ATP, 2 mol NH3, 1 mol Ornithin und 1 mol CO2. Ein Ziel dieser Arbeit ist es, zu klären, ob bei M. tuberculosis respektive BCG ein Analogon zum Arginindeiminaseweg von P. aeruginosa existiert. Obwohl der Arginindeiminase-Stoffwechselweg bei anderen Bakterien ausschließlich unter anaeroben Bedingungen genutzt wird, kann Arginin auch unter aeroben Bedingungen zu Citrullin und Ammoniak abgebaut werden. Dabei dient Ammoniak als Stickstoffquelle für den Substratstoffwechsel. Jedoch sind für diese Argininassimilation andere Argininabbauwege wie zum Beispiel der Arginase-Weg und der Arginin-Decarboxylase-Weg verantwortlich. Um den Argininstoffwechsel als Ganzes zu betrachten beziehungsweise zu klären, ob das arcA-Gen unter aeroben, unter anaeroben oder unter beiden Bedingungen eine Rolle spielt, wurde grundsätzlich in dieser Arbeit die Argininassimilation unter aeroben Bedingungen und die Arginindesaminierung unter anaeroben Bedingungen untersucht. 4.1. Untersuchung des Argininstoffwechsels bei M. tuberculosis und BCG 4.1.1. Aerobe Bedingungen 4.1.1.1. Assimilation von Arginin Um zu überprüfen, ob M. tuberculosis und BCG unter aeroben Bedingungen Stickstoff aus Arginin assimilieren können, wurden die Wildtypen in einem Minimal- Medium mit 10 mM Arginin bei einer OD600 von ca. 0,03 angeimpft und über 10 Tage bei 37°C inkubiert. Außerdem wurde der Ammoniakgehalt im Medium bestimmt. 41
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