Untersuchungen zum Argininstoffwechsel bei Mycobacterium bovis ...

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Abbildung 36: Southern Blot-Hybridisierung zur Überprüfung auf homologe
Rekombination.
Die Ziffern 1 – 8 bezeichnen die genomische DNA der PCR-positiven Klone (Der Klon
Nummer 3 ist nicht aufgeführt, da er in der PCR kein Deletionsfragment aufwies). Die DNA
wurde mit dem Restriktionsenzym EcoNI geschnitten und mit einer narG-Sonde hybridisiert.
Zur Kontrolle wurde genomische DNA von M. tuberculosis H37Rv (w) mitgeführt.
4.5.2. Entfernung des Wildtypgens und Überprüfung der Mutanten
Alle 7 Klone wurden nun in 7H9-Flüssignährmedium kultiviert, um eine zweite
Rekombination und damit ein Ausschleusen des Wildtypgens und der Vektor-DNA zu
ermöglichen („ausloopen“). Danach wurden Verdünnungsreihen der Kulturen
angefertigt, die auf 7H10-Platten mit Sucrosezusatz ausgestrichen wurden. Die
Bakterien, die auf diesem Nährboden wachsen konnten, mussten den Vektor in
einem zweiten Rekombinationsereignis wieder eliminiert haben. Ansonsten hätte das
im Vektor enthaltene sacB-Gen über eine Levansucraseaktivität zur Bildung
cytotoxischer Levansäuren geführt. Nach diesem Schritt, und einem erneuten
Screening auf Hygromycinsensibilität, wurden die hygromycinsensiblen Klone in
einer PCR auf Elimination des Wildtypgens überprüft (Abb. 37).