Untersuchungen zum Argininstoffwechsel bei Mycobacterium bovis ...

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einem weiteren Zentrifugationsschritt (5 min 13000 U/min) wurde der Überstand
verworfen, das Pellet 15 min an der Luft getrocknet und mit 35 µl Aqua bidest.
bedeckt. Bei 4°C wurde das Pellet über Nacht im Aqua bidest. gelöst und gelagert.
3.2.4. Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen
Restriktionsenzyme oder –endonucleasen sind in der Lage, doppelsträngige DNA zu
spalten. Die DNA muss dazu eine bestimmte Nucleotidsequenz von 4 - 10
aufeinander folgenden Basen aufweisen. Die Enzyme schneiden in dem Bereich der
Nucleotidsequenz entweder mit (sticky ends) oder ohne (blunt ends) überstehende
Enden. Für ihre Aktivität benötigen Restriktionsendonucleasen ein spezielles Milieu,
das durch Zugabe von Puffern erreicht wird. Einige Enzyme benötigen außerdem
bovines Serumalbumin (BSA) zur Aktivitätssteigerung.
Per Definition schneidet eine Einheit Enzym 1 µg DNA in einer Stunde. Das
standardisierte Gesamtvolumen des Reaktionsansatzes betrug 10 µl. Die Ansätze
wurden 1-2 Stunden bei 37 °C inkubiert.
3.2.5. Agarose-Gel-Elektrophorese
Mit Hilfe der Agarose-Gel-Elektrophorese lassen sich durch Restriktionsenzyme
gespaltene DNA-Fragmente von ca. 200 bis 20.000 bp Größe trennen. Jede DNA
enthält negativ geladene Phosphatreste, die einem elektrischen Gradienten folgen.
Je nach Größe der DNA-Stücke wandern diese unterschiedlich schnell in einem
entsprechenden Transportmilieu. Dieses Transportmilieu ist ein Agarosegel, das in
Konzentrationen von 0,7 – 1,5 % aus einem Agarosepulver mit 50 x TAE und Wasser
angesetzt wurde. Durch Aufkochen löst sich das Pulver, so dass eine klare
Flüssigkeit entsteht. Diese wurde in einen Gelschlitten gegossen, in dem die
Flüssigkeit aushärtet und in eine Gelphase übergeht. Das Gel wurde in eine mit
Ladepuffer versehene Elektrophoresekammer eingesetzt. Die DNA wurde in
Taschen, die beim Gießen des Geles ausgespart wurden, einpipettiert. An der
Elektrophoresekammer wurde nun für 60 min. eine Spannung von 120V angelegt.
Anschließend wurde das Gel in einem Ethidiumbromidbad für 10-20 min. gefärbt.
Dabei interkalierte die DNA mit dem Ethidiumbromid und wurde so, nach einer 10
min. Entfärbung in dest. H2O, unter UV-Licht sichtbar.