Untersuchungen zum Argininstoffwechsel bei Mycobacterium bovis ...

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3.2.9. Kultivierung der Mykobakterien unter aeroben Bedingungen
3.2.9.1. Kultivierung in 7H9-Medium
Nach Anzucht einer Vorkultur bis zu einer OD600 von ca. 0,8-1,0 wurde diese für 10
min. bei 3000 U./min. und Raumtemperatur abzentrifugiert. Der Überstand wurde
verworfen, das Bakterienpellet in 7H9-Medium resuspendiert und wiederum
zentrifugiert. Dieser Waschschritt wurde noch zweimal wiederholt, um
sicherzustellen, dass keine eventuell toxischen Stoffwechselprodukte der Bakterien
im Medium verbleiben. Anschließend wurde das Pellet in 1/10 des
Ausgangsvolumens resuspendiert. In Rollflaschen, die zuvor mit 50 ml 7H9-Medium
gefüllt worden waren, wurde nun eine optische Dichte bei 600 nm von ca. 0,02-0,03
eingestellt. Dann wurden sie über einen Zeitraum von 8 Tagen auf Rolleinheiten bei
37 °C inkubiert. Die Bestimmung der Keimdichte erfolgte über die Messung der
OD600 und, je nach Versuchsansatz, über Erstellung einer Verdünnungsreihe und
Kultivierung derselben auf einem Festnährmedium.
3.2.9.2. Überprüfung auf Arginin-Assimilation
Die Kultivierung in Minimalnährmedium mit Arginin erfolgte analog der Kultivierung in
7H9-Medium. Hier wurde jedoch für die Waschschritte MB-Medium verwendet,
ebenso für das Resuspendieren. Die Rollflaschen wurden mit 50 ml MB-Medium mit
ADS gefüllt, die OD600 mit Bakteriensuspension auf 0,03 eingestellt und Arginin in der
gewünschten Konzentration (10 mmol/l) hinzugefügt. Dann folgte eine Inkubation
über 8 Tage bei 37 °C auf einer Rolleinheit. Die Bestimmung der Keimdichte erfolgte
analog zum Verfahren bei der Kultivierung in 7H9-Medium.
3.2.10. Kultivierung der Mykobakterien unter anaeroben Bedingungen
3.2.10.1. Überprüfung auf Arginin-Assimilation
Für die Kultivierung der Mykobakterien unter anaeroben Bedingungen zur
Überprüfung auf Arginin-Assimilation wurde weitestgehend verfahren wie bei der
Kultivierung unter aeroben Bedingungen. Allerdings wurden an Stelle der
Rollflaschen Zellkulturflaschen mit Filterdeckeln verwendet, die einen Gasaustausch
mit der Umgebung ermöglichen. In den Zellkulturflaschen wurde ein Volumen von 20