Untersuchungen zum Argininstoffwechsel bei Mycobacterium bovis ...

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3.2. Methoden
3.2.1. Anzucht von Bakterien
Die Anzucht der Bakterien richtete sich nach der Spezies, der gewünschten Menge
an Kulturmaterial und eventuell erforderlicher Antibiotikazusätze.
E. coli wurde in 5 ml LBB-Flüssignährmedium angezüchtet. Dazu wurden 5 µl einer
auf Eis aufgetauten Kultur in das Medium (bei Bedarf mit entsprechendem
Antibiotikazusatz) überimpft und über Nacht bei 37 °C in einem Schüttelinkubator
inkubiert.
Langsam wachsende Mykobakterien wurden in 7H9-Medium angezüchtet. 250µl
einer tiefgekühlten Kultur wurden auf Eis aufgetaut und in 50 ml 7H9-Medium (bei
Bedarf mit Antibiotikazusatz) angeimpft. In 1000 ml-Rollflaschen wurden die Kulturen
7 Tage bei 37 °C auf einer Roll-Einheit mit 2 Umdrehungen pro Minute inkubiert.
Von allen verwendeten Mykobakterienstämmen wurden Tiefgefrierstammkulturen
angelegt.
Zur Konservierung der Bakterien wurde eine flüssige Bakterienkultur, die sich in der
Wachstumsphase befand, zentrifugiert (2.500 U./min., 10 min, 37 °C), der Überstand
verworfen und das Bakterienpellet in 7H9-Nährmedium resuspendiert. Nach einer
weiteren Zentrifugation mit Verwerfen des Überstandes wurden die Bakterien in 7H9-
Nährmedium mit 15 % Glycerinzusatz resuspendiert, in je 1 ml Portionen in
Mikroschraubröhren abgefüllt und bei -70 °C eingefroren.
3.2.2. Präparation von Plasmid-DNA
Die Minipräparation von Plasmiden wurde mit Hilfe eines Kits der Firma Qiagen
durchgeführt. Die Methode basiert auf alkalischer Denaturierung hochmolekularer,
chromosomaler DNA in Einzelstränge, während niedermolekulare Plasmid-DNA nicht
denaturiert wird. Auf diese Weise ist es möglich, Plasmid-DNA aus Zellen zu
gewinnen und sie gleichzeitig von chromosomaler DNA zu bereinigen.
1,5 ml einer Übernacht-Kultur von E. coli wurden in einem Eppendorfgefäß bei 13000
U/min zentrifugiert. Das Bakterienpellet wurde in 100 µl Resuspensionspuffer P1
gelöst. Anschließend wurde 100 µl Lysepuffer P2 hinzupipettiert und für 5 min bei
Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe von 100 µl Neutralisationspuffer wurde das
Gefäß für 15 min. auf Eis inkubiert. Zellreste wurden mit 13000 U/min. abzentrifugiert