Anleitung zum Biochemischen Praktikum für Mediziner Universität zu

Enzymkinetik der sauren Phosphatase 3-7
v 0
Km
1
2 Vmax
Abbildung 3-3: Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration
Geräte:
Wasserbad 37 °C, mit Kontaktthermometer
Einsatz für Reagenzgläser
Filter-Photometer Filter 623 nm , 2 × 1 cm Küvetten
Reagenzgläser 30, im Reagenzglasständer
Vollpipetten 5 ml
Messpipetten 1 ml, 5 ml
Lösungen
Enzym: 1 mg saure Phosphatase in 100 ml Wasser
Phenol-Standard-Lösung: 0,5 mM
Dinatriumphenylphosphat (DPP): 0,005 M, mit 2 N HCl auf pH 5,3 eingestellt.
Ethylendiamin-Zitratpuffer: 0,1 M, pH 5,9
(0,1 M Lösung von Ethylendiamin, pH mit fester Zitronensäure einstellen).
Na2CO3-Lösung: 7 %ig
Folin-Reagenz: 1:1 mit Wasser verdünnt
[S]
3-8 Enzyme
I. Der optische Test: Bestimmung von Pyruvat
Vorbemerkung:
Die Pyridinnukleotide NAD + und NADP + können reversibel Wasserstoff aufnehmen.
Diese Fähigkeit bedingt ihre Funktion als Coenzym vieler Dehydrogenasen
(Oxidoreduktasen). Bei der Hydrierung wird der aromatische Charakter
des Nikotinsäureamid-Ringsystems aufgehoben. Das entstandene Dihydropyridin-Ringsystem
besitzt eine spezifische Lichtabsorption mit einem Maximum
von 340 nm, die bei NAD + fehlt.
1,2
E
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
200
300
400
Abbildung 3-9: Absorptionsspektren von NADH und NAD+
NAD+
NADH
Man kann daher die Umwandlung von NAD + in NADH und umgekehrt mit
dem Photometer messen (optischer Test).
Die Konzentration des gebildeten bzw. verbrauchten NADH oder die Konzentration
der entsprechenden Reaktionspartner der Enzyme werden mit Hilfe des
Lambert-Beerschen Gesetzes berechnet.
nm
500