Anleitung zum Biochemischen Praktikum für Mediziner Universität zu
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Optischer Test 3-23<br />
Im Folgenden wird die Aktivität, Hemmung und Reaktivierung der Acetylcholinesterase<br />
bestimmt. Der Inhibitor DIFP ist eine hoch toxische Substanz. Achten Sie bitte<br />
darauf, dass die Haut nicht mit der Flüssigkeit in Berührung kommt.<br />
Ausführung:<br />
Nach gutem Mischen wird nach einer Minute und dann in einem Zeitraum von<br />
30 min alle fünf Minuten die Extinktion der drei Reaktionsküvetten (2-4, siehe<br />
Tabelle 3-5) bei 405 nm gemessen (Achtung die Zeit läuft nach Zugabe des<br />
Substrats Acetylcholiniodid!). Vor jeder Messung muss der Leerwert mit<br />
Küvette-Nr. 1 erneut auf Null eingestellt werden, da das Serum mit dem<br />
Reagenz reagiert. Tragen Sie die Werte in Tabelle 3-6 ein.<br />
Tabelle 3-5:<br />
Durchführung der Aktivität, Hemmung und Reaktivierung der AChE<br />
Küvetten-Nr. 1 2 3<br />
4<br />
0,25 mM 5,5‘-Dithio-bis-(2-<br />
Leerwert Aktivität Hemmung Reaktivierung<br />
nitro-benzoesäure) in 50 mM<br />
Phosphatpuffer<br />
3 ml 3 ml 3 ml 3 ml<br />
Serum (enthält<br />
Acetylcholinesterase)<br />
20 µl 20 µl 20 µl 20 µl<br />
DIFP (Hemmstoff) 50 µl - 50 µl 50 µl<br />
5 min nach mischen:<br />
PAM (Enthemmer)<br />
15 min nach mischen:<br />
5mMAcetylthiocholinjodid<br />
(Substrat)<br />
jeweils gut mischen!<br />
50 µl - - 50 µl<br />
- 100 µl 100 µl 100 µl<br />
Tragen Sie bitte die abgelesenen Extinktionen gegen die Zeit auf (vgl. Abb. 3-<br />
8). Aus dem Graphen wird die ∆E/min. abgelesen (Steigungsdreieck).<br />
Berechnen Sie die Acetylcholinesterase-Aktivität c/min (Einheit: Mol/min) mit<br />
Hilfe des Lambert-Beer`schen Gesetzes.<br />
ε = 13,3 x 10 3 [l x mol -1 x cm -1 ]<br />
3-24 Enzyme<br />
Geben Sie die Acetylcholinesterase-Aktivität in U/l an (1 U = 1 µMol/min).<br />
Tabelle 3-6: Wertetabelle <strong>für</strong> die Zeit-Umsatzkurve<br />
Zeit nach<br />
Werte <strong>für</strong> Werte <strong>für</strong><br />
Substrat<strong>zu</strong>gabe<br />
1 min [E(405nm)1]<br />
3 min [E(405nm)3]<br />
5 min [E(405nm)5]<br />
10 min [E(405nm)10]<br />
15 min [E(405nm)15]<br />
20 min [E(405nm)20]<br />
25 min [E(405nm)25]<br />
30 min [E(405nm)30]<br />
Aktivität Hemmung<br />
E<br />
1,4<br />
1,2<br />
1,0<br />
0,8<br />
0,6<br />
0,4<br />
0,2<br />
0,0<br />
0<br />
10<br />
Abbildung 3-8: 1) Aktivität der Acetylcholinesterase<br />
2) Hemmung mit DIFP<br />
3) Reaktivierung mit PAM<br />
20<br />
1<br />
3<br />
2<br />
30<br />
Zeit [min]<br />
Werte <strong>für</strong><br />
Reaktivierung
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