Anleitung zum Biochemischen Praktikum für Mediziner Universität zu

ELISA 5-3
Trimeren, während IgM aus Pentameren der Y-förmigen Struktur besteht. Die
Multimere sind dabei sowohl untereinander als auch mit einer sogenannten J-Kette
(J=joining) über Disulfidbrücken verbunden.
In einem direkten ELISA sollen Sie IgG im Plasma nachweisen, als Leerwert dient
TBS. In der Analyse sollen Sie ermitteln, ob in den beiden Proben, die Sie
erhalten, humanes IgG vorhanden ist oder nicht. Dazu werden in einem ersten
Schritt die Plasmaproteine irreversibel an eine ELISA-Mikrotestplatte gebunden.
Nach dem Blockieren unspezifischer Bindungsstellen mit Milchproteinen wird ein
in Kaninchen hergestellter Peroxidase-gekoppelter Antikörper zugegeben, der
gegen humanes IgG gerichtet ist. Der Nachweis der gebundenen Antikörper
erfolgt dann durch die enzymatische Reaktion. Als Substrat dient Tetramethylbenzidin,
dessen Umsatz photometrisch bei 450 nm detektiert werden kann.
Materialien und Geräte:
ELISA-Reader
96er Microtiter-Platte
Pipetten: Precision rot/blau
500 ml Spritzflasche
15 ml Plastikgefäß mit Schraubdeckel
Eppendorf-Reaktionsgefäße
Lösungen:
Plasma (für die Verdünnungsreihe)
Protein-Analysen-Lösungen A und B
TBS
TBS/Tween 20, 0,02 %(Detergenz)
5% Milchpulver in TBS
Kaninchen-Anti-Human-IgG Antikörper (Peroxidase gekoppelt; 1:40000)
Citrat pH 6.0
10 mg/ml Tetramethylbenzidin-Lösung in DMSO (carcinogen)
3% ige H 2O2-Lösung
20%ige H 2SO4
5-4 Immunologie
Durchführung:
1. Beschichten
Die Löcher einer 96-Loch (12x8) Microtiter-Platte werden mit jeweils 100 µl
Antigenlösung beschichtet. Hierzu wird eine Plasma-Verdünnungsreihe in
TBS-Puffer (siehe Tabelle) hergestellt, zusammen mit den unverdünnten
Analysen A und B (ebenfalls je 100µl) wie folgt aufgetragen (alles in
Doppelbestimmung) und eine Stunde bei Raumtemperatur (RT) inkubiert.
Bitte benutzen Sie immer nur 3 nebeneinanderliegende Spalten und vermeiden
Sie Proteinkontaminationen der freien Plätze. Die Platten werden in der
nächsten Woche von Ihren Kommilitonen weiterverwendet. Zur Sicherheit
lassen Sie jede 4. Spalte frei. Bitte markieren Sie die benutzten Spalten mit
Filzstift.
Also zu benutzen: Spalten 1,2,3 oder 5,6,7 oder 9,10,11.
Verdünnung Plasma
(Doppelbestimmung)
Leerwert AX1,
Analysen
1:10 4 AX2 Student X
1:5x10 4 BX1
1:10 5 BX2
1:5x10 5 AY1
1: 10 6 AY2 Student Y
1:5x10 6 BY1
1: 10 7 BY2
2. Waschen
Die Lösungen werden über dem Waschbecken ausgegossen und dann dreimal
mit TBS/T-Puffer gewaschen. Man füllt die Löcher mit dem Waschpuffer aus
einer Polyethylen-Spritzflasche, und schüttet sie ebenfalls über dem
Waschbecken aus. Anhaftende Tropfen können durch Ausklopfen entfernt
werden.