Überlebensfähigkeit von kryokonservierten ... - Dragon IVF
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Aus dem Institut für Tierzucht und Haustiergenetik<br />
der Georg-August-Universität Göttingen<br />
<strong>Überlebensfähigkeit</strong> <strong>von</strong><br />
<strong>kryokonservierten</strong> Mäuseembryonen<br />
nach Zwischenlagerung bei<br />
-18°C oder -79°C<br />
Masterarbeit<br />
im Fachbereich Fortpflanzungsbiologie und Biotechnik<br />
vorgelegt <strong>von</strong> Stephanie Buhtz<br />
Göttingen im Juli 2007
1. Prüfer: Prof. Dr. W. Holtz<br />
2. Prüfer: Prof. Dr. M. Gauly<br />
Tag des Kolloquiums: 26.07.2007
Inhaltsverzeichnis<br />
Abbildungsverzeichnis .................................................................................. IV<br />
Tabellenverzeichnis......................................................................................... V<br />
Abkürzungen................................................................................................... VI<br />
Verwendete Chemikalien ............................................................................. VIII<br />
Verwendete Geräte und Verbrauchsmaterialen ............................................IX<br />
1 Einleitung .......................................................................................................1<br />
2 Literatur ..........................................................................................................3<br />
2.1 Grundlagen der Kryobiologie ........................................................................ 3<br />
2.2 Prozesse beim Gefrieren................................................................................. 4<br />
2.3 Physikalische und chemische Abläufe beim Einfrieren <strong>von</strong> Zellen .... 6<br />
2.4 Kryoprotektiva - Aufgabe und Wirkung ...................................................... 8<br />
2.4.1 Penetrierende Kryoprotektiva ................................................................ 9<br />
2.4.1.1 Glycerol ............................................................................................... 11<br />
2.4.1.2 Dimethylsulfoxid (DMSO) ............................................................... 12<br />
2.4.1.3 Ethylenglycol (EG)............................................................................ 14<br />
2.4.2 Nicht penetrierende Kryoprotektiva.................................................... 16<br />
2.5 Gefrierverfahren .............................................................................................. 19<br />
2.5.1 Standardgefrierverfahren ...................................................................... 20<br />
2.5.2 Langsames Kryokonservieren ............................................................. 22<br />
2.5.3 Schnelles Kryokonservieren................................................................. 23<br />
2.5.4 Ultraschnelles Kryokonservieren........................................................ 24<br />
2.5.5 Vitrifikation ................................................................................................ 25<br />
2.6 Auftauen ........................................................................................................ 27<br />
2.7 Ausverdünnungsmethoden.......................................................................... 29<br />
2.7.1 Schrittweises Ausverdünnen und Ausverdünnen mit nicht<br />
penetrierenden Kryoprotektiva .......................................................... 29<br />
2.7.2 One-Step-Ausverdünnung..................................................................... 30<br />
2.7.3 Direkte Ausverdünnung <strong>von</strong> Ethylenglycol...................................... 32<br />
2.8 Kultivierung <strong>von</strong> Embryonen ....................................................................... 33<br />
I
2.9 Beurteilungsmöglichkeiten für Embryonen............................................. 34<br />
2.9.1 Morphologische Beurteilung ................................................................ 34<br />
2.9.2 Beurteilung nach Fluoreszenzanfärbung mittels FDA................... 35<br />
2.9.3 Beurteilung nach Fluoreszenzanfärbung durch<br />
Hoechst A 33342 .................................................................................... 36<br />
3 Material und Methoden................................................................................37<br />
3.1 Tiermaterial ....................................................................................................... 37<br />
3.2 Haltungsbedingungen.................................................................................... 37<br />
3.3 Medien................................................................................................................ 38<br />
3.3.1 Spülmedium .............................................................................................. 38<br />
3.3.2 Kulturmedium ........................................................................................... 41<br />
3.3.3 Kryoprotektivum ...................................................................................... 42<br />
3.3.4 Auftaumedium .......................................................................................... 43<br />
3.3.5 Überschichtungsöl für Kultivierung- und Waschdrops ................ 43<br />
3.4 Behandlung der Embryonenspender......................................................... 44<br />
3.5 Gewinnung der Embryonen.......................................................................... 46<br />
3.6 Beurteilung der gewonnenen Embryonen................................................ 48<br />
3.7 Einfrieren der Embryonen............................................................................. 49<br />
3.7.1 Standartgefrierverfahren........................................................................ 50<br />
3.7.1.1 Haake ................................................................................................... 50<br />
3.7.1.2 Consartic............................................................................................. 51<br />
3.8 Zwischenlagerung der eingefrorenen Embryonen ................................ 53<br />
3.9 Auftauen der Embryonen.............................................................................. 54<br />
3.10 In vitro Kultivierung der Embryonen ....................................................... 55<br />
3.11 Beurteilung <strong>von</strong> Embryonen ...................................................................... 56<br />
3.11.1 Morphologische Beurteilung.............................................................. 56<br />
3.11.2 Kombinierte FDA-Hoechst-Färbung zur<br />
Zytoplasmaaktivitätsbestimmung und Kernzählung ................... 60<br />
3.12 Geräte und Gerätekontrolle........................................................................ 62<br />
3.13 Photographien ............................................................................................... 64<br />
3.14 Statistische Auswertung............................................................................. 64<br />
II
4 Ergebnisse ...................................................................................................65<br />
4.1 Superovulation................................................................................................. 65<br />
4.2 Embryonengewinnung, -stadium und -qualität....................................... 65<br />
4.3 Zwischenlagerung........................................................................................... 66<br />
4.4 In vitro Kultivierung........................................................................................ 67<br />
4.5 Vitalfärbung mit FDA und Hoechst 33341 ................................................ 69<br />
4.6 Einfluss der Abstammung der Mutterherkunft auf die<br />
Embryonenausbeute............................................................................. 69<br />
4.7 Einfluss der Abstammung der Mutter auf das Entwicklungsstadium<br />
nach 48 Stunden in vitro Kultivierung.............................................. 70<br />
5 Diskussion....................................................................................................71<br />
5.1 Superovulation................................................................................................. 72<br />
5.2 Überleben und Weiterentwicklung unter in vitro Bedingungen ......... 75<br />
5.3 Zwischenlagerungseinfluss auf die Weiterentwicklung der<br />
<strong>kryokonservierten</strong> Embryonen........................................................... 76<br />
6 Zusammenfassung......................................................................................79<br />
7 Literaturverzeichnis.....................................................................................81<br />
Danksagung ..................................................................................................109<br />
Eidesstattliche Erklärung.............................................................................110<br />
III
Abbildungsverzeichnis<br />
Abb. 1: Abhängigkeit der Überlebensrate <strong>von</strong> der Kühlrate..............................23<br />
Abb. 2: Werktisch mit integriertem Wärmebereich (Varolab, Giessen) und<br />
CO2 Kleininkubator C42 (Labotect) ......................................................43<br />
Abb. 3: Ip-Injektion <strong>von</strong> eCG bzw. hCG ............................................................44<br />
Abb. 4: Vaginal-Plaque: 1) positiv und 2) negativ am Morgen nach erfolgter<br />
Bedeckung............................................................................................45<br />
Abb. 5: Zervikale Dislokation ............................................................................47<br />
Abb. 6: Eröffnete Bauchhöhle...........................................................................47<br />
Abb. 7: Einfriersystem Firma HAAKE, Berlin ....................................................49<br />
Abb. 8: Einfriersystem Firma CONSARTIC, Schöllkrippen...............................49<br />
Abb. 9: Befüllungsschema Kunststoffpaillette...................................................51<br />
Abb. 10: Kunststoffpaillette mit Entwicklungsstadium, Spezies, Spültag und<br />
Stückzahl............................................................................................51<br />
Abb. 11: Zwischenlagerung bei -79°C (li.) und -18°C (re.)................................54<br />
Abb. 12: Waschschale mit fünf Medium-Waschdrops unter Öl.........................55<br />
Abb. 13: Kultivierungsschale mit 10 Kultivierungs-Mediumdrops unter Öl........56<br />
Abb. 14: Inkubator C60, Labotect, Göttingen....................................................56<br />
Abb. 15: Embryo a) "Sehr gut", b) "Gut", c) "Mäßig", d) degeneriert,<br />
e) retadiert..........................................................................................59<br />
Abb. 16: a) Schlüpfende Blastovyste, b) Geschlüpfte Blastocyste....................60<br />
Abb. 17: Aktives (a) bzw. inaktives (b) Zytoplasma - Feststellung mittels FDA 61<br />
Abb. 18: Lebende und tote Kerne - Sichtbarmachung mittels<br />
Hoechst H 33342................................................................................61<br />
Abb. 19: Arbeitsplatz mit Kleininkubator C42 (Easy Bench, Varolab, Giessen;<br />
C42, Labotect, Göttingen) ..................................................................62<br />
Abb. 20: Kleininkubator C42 (Labotect, Göttingen)...........................................62<br />
Abb. 21: Messgerät In Control 1051 (Labotect, Göttingen) (Quelle: Labotect,<br />
Göttingen) ..........................................................................................63<br />
Abb. 22: Verwendeter Zeiss Axio Observer A1 (Mitte)<br />
(Quelle: Zeiss, Göttingen) ..................................................................64<br />
IV
Tabellenverzeichnis<br />
Tab. 1: Zusammensetzung Mäusealleinfutter...................................................38<br />
Tab. 2: Zusammensetzung der verwendeten Stammlösungen.........................39<br />
Tab. 3: Zusammensetzung des Spülmediums M2............................................40<br />
Tab. 4: Zusammensetzung des Kulturmediums MediCult Universal<br />
<strong>IVF</strong> Medium ..........................................................................................42<br />
Tab. 5: Behandlungsschema zur Gewinnung <strong>von</strong> Mäuseembryonen...............46<br />
Tab. 6: Schema Gefrierprogramm ....................................................................52<br />
Tab. 7: Entwicklungsstadium und Verteilung gewonnener Eizellen und<br />
Embryonen ...........................................................................................66<br />
Tab. 8: Ergebnisse der in vitro Kultivierung <strong>von</strong> bei -18°C bzw. -79°C<br />
zwischengelagerten <strong>kryokonservierten</strong> Blastocysten..........................68<br />
Tab. 9: Ergebnisse der in vitro Kultivierung <strong>von</strong> bei -18°C bzw. -79°C<br />
zwischengelagerten <strong>kryokonservierten</strong> Morulae ..................................68<br />
Tab. 10: Reaktion des Zytoplasmas auf die FDA-Färbung...............................69<br />
Tab. 11: Embryonengewinnung aus MPI-Mäusen............................................70<br />
Tab. 12: Embryonengewinnung aus institutseigenen Mäusen .......................70<br />
Tab. 13: Mutterherkunft Institutseigen ............................................................70<br />
Tab. 14: Mutterherkunft MPI .............................................................................70<br />
V
Abkürzungen<br />
Bl. Blastocyste<br />
BSA bovines Serumalbumin<br />
bzw. beziehungsweise<br />
ca. circa<br />
Deg. Degeneriert<br />
DMSO Dimethylsulfoxid<br />
DNA Desoxyribonucleic acid<br />
EBSS Earle´s Buffered Saltsolution<br />
eCG equine Chorionic Gonadotropin<br />
EG Ethylenglycol<br />
ER Entwicklungsrate<br />
et al. et altera<br />
Exp. Expandiert<br />
Exp. - Expandiert, mäßig<br />
Exp. ! Expandiert, sehr gut<br />
FDA Fluorescein-3`6`-diacetat<br />
g Gramm<br />
Geschl. Geschlüpft<br />
hCG human Chorionic Gonadotropin<br />
HSA humanes Serum Albumin<br />
IE Internationale Einheiten<br />
ip intraperitoneal<br />
kg Kilogramm<br />
LF Luftfeuchte<br />
LN2<br />
L ! sehr aktiv<br />
L aktiv<br />
flüssiger Stickstoff (-196°C)<br />
L - schwach aktiv<br />
M Mol<br />
mg Milligramm<br />
Mg Molekulargewicht<br />
ml Milliliter<br />
VI
mm Millimeter<br />
Mo Morula<br />
mOsmol<br />
Auf Osmolalität (Osmol/l) o. Osmolarität (Osmol/kg) bezogene Einheit<br />
MPI Max Planck Institut<br />
PBS Phosphate Buffered Saline<br />
PG Propylenglycol<br />
PROH Propandiol<br />
PVA Polyvinylalkohol<br />
PVP Polyvinylpyrrolidon<br />
rel. relativ<br />
RT Raumtemperatur<br />
Schl. Schlüpfend<br />
SR Schlupfrate<br />
T tot<br />
TR Trächtigkeitsraten<br />
ÜR Überlebensrate<br />
UV Ultra violett<br />
VP Vaginal-Plaque<br />
VP+ Vaginal-Plaque positiv<br />
VP- Vaginal-Plaque negativ<br />
z.B. zum Beispiel<br />
µl Mikroliter<br />
VII
Verwendete Chemikalien<br />
Aceton MERCK – Schuchardt, Hohenbrunn<br />
Alkohol SIGMA-ALDRICH, Steinheim<br />
eCG Intergonan; Intervet, Unterschleißheim<br />
Ethylenglycol SIGMA-ALDRICH, Steinheim<br />
FDA FDA-Färbung (3,6-Diacetoxyfluoran); SIGMA-ALDRICH,<br />
Steinheim<br />
Fermacidal ® D IC Products SA, CH-Minusio; Vertrieb Labotect, Göttingen<br />
hCG Ekluton; Intervet, Unterschleißheim<br />
HEPES HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinthansulfonsäure<br />
Hoechst A 33342 B2261-25MG; bisbenzimid; SIGMA-ALDRICH, Steinheim<br />
Kulturmedium Universal <strong>IVF</strong> Medium mit Phenolrot, 60 ml; MediCult a/s,<br />
DK-Jyllinge<br />
M2 eigene Herstellung<br />
Mineralöl Mineral oil; SIGMA-ALDRICH, Steinheim<br />
Reinstwasser Ampuwa ® , Fresenius, Bad Homburg<br />
Saccharose Sucrose, S9378; SIGMA-ALDRICH, Steinheim<br />
Stickstoff flüssiger Stickstoff (LN2)<br />
Vaselin Weißes Vaselin Lichtenstein DAB; Lichtenstein Pharma-<br />
zeutica GmbH & Co., Mülheim-Kärlich<br />
VIII
Verwendete Geräte und Verbrauchsmaterialen<br />
Brutschrank C60 Labotect, Göttingen<br />
Brutschrank CO2 Kleininkubator C42 Labotect, Göttingen<br />
Center-Well Schale (60×15mm) Falcon, Heidelberg<br />
Digital-pH-Meter pH 525 WTW, Weilheim i.OB<br />
Einfriersystem Consartic BV 65/55 Consartic, Schöllkrippen<br />
Einfriersystem Haake Kryosta, Typ F-3Q mit<br />
Programmgeber Typ PG 20<br />
Haake, Berlin<br />
Einmalfilter Filtropur S (0,2 µm) Sarstedt, Nümbrecht<br />
Eppendorfgefäß (1 ml) Eppendorf, Hamburg<br />
Falcon-Röhrchen (50 ml) Sarstedt, Nümbrecht<br />
Feinwaage 2007 MP6 Sartorius, Göttingen<br />
Gefrierpailletten 0,25 ml Kunststoffpailletten Minitüb, Landshut<br />
Kanüle (0,3×1,0 cm, 2R2) Unimed, CH-Lausanne<br />
Kleenex KIMTECH Science, Kimberley-<br />
Clark ® Professional<br />
Luer-Einwegspritze (1 ml/2 ml) B-D Plastipak ® , Becton Dickin-<br />
son, Irland<br />
Magnetrührer Heidolph, Schwabach<br />
Mäusealleinfutter ssniff Spezialdiäten GmbH,<br />
Maus-Polycarbonatkäfig (Typ II: 17×23×14<br />
cm /Typ III: 23×39×15 cm)<br />
Messelektrode WTW pH-Elektrode SenTix<br />
60<br />
Soest<br />
Ebeco, Castrop-Rauxel<br />
WTW, Weilheim i. OB<br />
Messgerät In Control 1050 Labotect, Göttingen<br />
Mikroskop Axio Observer A1 ZeissMicroImaging GmbH,<br />
Göttingen<br />
Mikroskop Axioskop (mit Filtersatz 02 u. 09) Zeiss, Göttingen<br />
Mikroskop Stereomikroskop SZ 11 Olympus, Hamburg<br />
IX
Mikroskop Stereomikroskop M8 Wild, Heerebrugg, Wetzlar<br />
Parafilm American National Can TM ,<br />
Greenwich<br />
Petrischale (35×10mm) Greiner, Frickenhausen<br />
Petrischale (85×15mm) Greiner, Frickenhausen<br />
Software Octax EyeWare Imaging Soft-<br />
ware<br />
Octax, Herborn-MTG Altendorf<br />
Sterilisator U 50 Memmert, Schwabach<br />
Trockenschrank BE 40 Memmert, Schwabach<br />
Versiegelungskitt Hämatokrit Brandt, Wertheim<br />
Wärmeplatte HT 200 Minitüb, Landshut<br />
Wärmeplatte MEDAX SP14 MEDAX Nagel GmbH, Kiel<br />
Wärmeschrank Typ 85 Melag Brutschrank Incubat,<br />
Mikrobiologische Sicherheitswerkbank Typ<br />
MRF<br />
Berlin<br />
Steag Laminarflow-Prozeß-<br />
technik, Pfullingen<br />
Werktisch Easy Bench Varolab, Giessen<br />
X
1 Einleitung<br />
Die Kryokonservierung <strong>von</strong> Embryonen wird bei einigen Säugern bereits prakti-<br />
ziert und hat schon seit langem in der praktischen Rinderzucht Einzug gehalten.<br />
Eine Voraussetzung für eine konventionelle Anwendung der Kryokonservierung<br />
ist, dass die Zellen den Einfrierprozess ohne Folgeschäden überstehen. Nur<br />
dann kann die Tiefgefrierkonservierung innerhalb der Technik weitere Bedeu-<br />
tung erlangen.<br />
Erste erfolgreiche Kryokonservierungsversuche konnten 1972 <strong>von</strong> WHITTING-<br />
HAM, LEIBO und MAZUR für die Maus beschrieben werden. Die Maus wird<br />
häufig, wie auch im Falle der Kryotechnik, als Modell verwendet, da die Gewin-<br />
nung <strong>von</strong> Embryonen größerer landwirtschaftlicher Nutztiere einen wesentlich<br />
größeren Kosten- und Apparateaufwand verursacht.<br />
Unter Berücksichtigung einiger spezies-spezifischer Modifikationen, können die<br />
bei der Maus gewonnenen Erkenntnisse auf die größeren landwirtschaftlichen<br />
Nutztiere übertragen werden.<br />
Die Verwendung flüssigen Stickstoffs ist bisher eine übliche Methode, um tief-<br />
gekühlte Zellen zu lagern oder auch zu transportieren. Da aber der Transport<br />
<strong>von</strong> Behältern mit flüssigem Stickstoff (LN2) den Vorschriften und gesetzlichen<br />
Gegebenheiten für Gefahrguttransporte unterliegt, wäre es speziell für diesen<br />
Bereich eine Vereinfachung, könnten in LN2 konservierte Zellen auch bei weni-<br />
ger niedrigen Temperaturen gelagert werden, ohne dass es dabei zu einer Ver-<br />
ringerung der Überlebensraten käme. Der überregionale Transport <strong>von</strong> Game-<br />
ten und Embryonen könnte somit sehr vereinfacht werden, ohne dass die Kos-<br />
ten für diese Transporte Ausmaße annehmen, die die Ökonomie eines Embryo-<br />
transfers in Frage stellen.<br />
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss einer 1-stündigen Zwischenla-<br />
gerung bei unterschiedlichen Temperaturen deutlich über -196°C (flüssiger<br />
Stickstoff), in Bezug auf die in vitro Überlebens- und Weiterentwicklungsrate zu<br />
ermitteln.<br />
Versuche zu diesem Thema wurden zwar bereits 1973 durch MAURER &<br />
BANK und 1977 durch MAURER et al. durchgeführt. Laut Literaturrecherche<br />
wurde dieses Thema aber erst 2002 wieder durch MATAR aufgegriffen. Im Un-<br />
1
terschied zu der Arbeit <strong>von</strong> MATAR, wurde in dieser Arbeit sowohl auf ein<br />
Refreezing der zwischengelagerten Embryonen als auch auf einen Transfer der<br />
aufgetauten Embryonen auf Empfängertiere verzichtet, da zunächst geklärt<br />
werden sollte, ob die Embryonen generell in der Lage sind eine Zwischenlage-<br />
rung bei Temperaturen <strong>von</strong> -18°C oder -79°C zu überstehen.<br />
2
2 Literatur<br />
2.1 Grundlagen der Kryobiologie<br />
Der Begriff Kryo stammt ursprünglich aus dem Griechischen. Dort bedeutet kry-<br />
os soviel wie Kälte, Eis.<br />
Heutzutage versteht man unter Kryokonservierung die Lagerung <strong>von</strong> Zellen und<br />
Geweben in einem Temperaturbereich <strong>von</strong> unter -130°C mit dem Ziel, eine<br />
möglichst vollständige Erhaltung der ursprünglichen Ausgangseigenschaften<br />
des konservierten biologischen Materials zu erreichen. Ein besonderes Augen-<br />
merk liegt hier auf der Erhaltung der Lebensfähigkeit des Materials (SCHEIWE<br />
& RAU, 1981).<br />
Die Herunterkühlung auf sehr tiefe Temperaturen geschieht in der Regel durch<br />
die Verwendung <strong>von</strong> flüssigem Stickstoff (LN2). Der Einsatz flüssigen Stickstoffs<br />
wurde durch die Entdeckung der Verflüssigung <strong>von</strong> Gasen ermöglicht.<br />
Das Bemerkenswerte an dem Prozeß der Kryokonservierung ist, dass die Vitali-<br />
tät der Zellen erhalten bleibt, obwohl das ganze biologische System der Zellen<br />
in einen Festkörperzustand übergeht. Dadurch kommt der Zellstoffwechsel voll-<br />
ständig zum Stillstand und die biochemischen Abläufe werden unterbrochen.<br />
Bisher ist die Kryokonservierung die einzige Möglichkeit, tierische, pflanzliche<br />
und menschliche Zellen und Zellverbände über eine beinahe unbegrenzte Zeit-<br />
dauer in lebensfähiger Form einzulagern und dann zu gegebenem Zeitpunkt<br />
wieder zu reanimieren. Von ersten erfolgreichen Versuchen zur Kryokonservie-<br />
rung <strong>von</strong> Embryonen berichteten WHITTINGHAM et al. (1972) sowie WILMUT<br />
(1972).<br />
Die einzige bisher bekannte Gefahr für korrekt kryokonservierte Zellen sind<br />
Strahlungsschäden an der DNS durch kosmische Strahlung. Da dieser Schädi-<br />
gungsprozess aber erst nach vielen tausend Jahren eine Schädigung bewirken<br />
würde, ist er als nicht unbedingt relevant anzusehen (ASHWOOD-SMITH &<br />
FRIEDMANN, 1979; MAZUR, 1980; LYON et al., 1981; GLENISTER et al.,<br />
1984).<br />
Für eine längere Lagerungsdauer werden die zu lagernden Zellen in Stahlbe-<br />
hältern aufbewahrt. Diese sind nach dem Dewar-Prinzip konstruiert, bei dem<br />
zwei Behälter unter einem so gering wie möglich gehaltenem Abstand ineinan-<br />
der montiert und durch einen Vakuumbereich <strong>von</strong>einander isoliert werden. Sol-<br />
3
len die Stahlbehälter zur Lagerung verwendet werden, muss der innere Behäl-<br />
ter mindestens zu einem Viertel mit flüssigem Stickstoff gefüllt sein. Die Proben<br />
werden dann in speziellen Metall- oder Plastikeinsätzen in der kalten Gasphase<br />
gehalten bzw., wenn sie festverschlossen sind, in die flüssige Kühlphase einge-<br />
taucht.<br />
Die auf diese Weise konservierten Proben können Jahre, Jahrzehnte und unter<br />
Umständen auch Jahrhunderte lang ohne Einschränkung ihrer Vitalität überste-<br />
hen.<br />
2.2 Prozesse beim Gefrieren<br />
Das Vermögen eines Körpers zur Abkühlung wird durch physikalische Parame-<br />
ter wie zum Beispiel die Fähigkeit zur Wärmeleitung, die Geometrie und auch<br />
die Körpergröße beeinflusst. Dadurch ergibt sich eine zellspezifische Definition<br />
der Abkühlrate.<br />
Eine Kryokonservierung lebender Zellen ohne Kryoprotektiva und ohne, dass<br />
die Zellen Schaden nehmen, ist bisher noch nicht möglich.<br />
Durch die Fähigkeit der Zellen zur Wärmeleitung und die Diffusionsmöglichkeit<br />
der Kryoprotektiva in die Zellen ergeben sich ganz spezielle Temperaturverläufe<br />
während des Einfrierens.<br />
Während des dynamischen Gefrierprozesses kommt es zwischen dem Intra-<br />
und Extrazellulärraum der Zellen zu einer Reihe <strong>von</strong> biophysikalischen Reaktio-<br />
nen. Diese Abläufe werden hauptsächlich <strong>von</strong> den Membraneigenschaften der<br />
zu konservierenden Zellen und <strong>von</strong> den Veränderungen der Temperatur in Ab-<br />
hängigkeit <strong>von</strong> der Zeit beeinflusst (SCHWARTZ & DILLER, 1983).<br />
Von großer Bedeutung für die Zellen sind die während der Tiefgefrierung ablau-<br />
fenden Konzentrationsveränderungen der umgebenden Medien und die me-<br />
chanischen Änderungen in den Zellstrukturen, die durch sich bildende Eiskris-<br />
talle entstehen (HOBBS, 1974). Eine bedeutende Rolle spielt dabei die Größe<br />
der sich bildenden Eiskristalle. Diese wird vor allem durch die Abkühlrate beein-<br />
flusst (MAZUR et al., 1974; MAZUR, 1977). Werden flüssige Lösungen mit ei-<br />
ner schnellen Abkühlrate eingefroren, kommt es infolge einer unvollständigen<br />
Wärmeabfuhr zu einer spontanen Bildung kleiner Eiskristalle. Bei einer langsa-<br />
4
men Abkühlung hingegen kann die Wärme vollständig abgeführt werden und es<br />
entstehen größere Kristalle (MAZUR et al., 1974; DILLER, 1975; FARRANT et<br />
al., 1977).<br />
Trotz einer abgeschlossenen Kristallisation ist es aber biophysikalisch dennoch<br />
möglich, dass kleine Eiskristalle durch Zusammenlagerungen zu größeren Kris-<br />
tallen verschmelzen, ihr Energiepotential erhöhen und durch sogenannte ther-<br />
mische Stöße ihre Position in der Zelle ändern (MAZUR, 1966; LUYET & RA-<br />
PATZ, 1970; MAZUR, 1977; RALL & POLGE, 1984; MEYBERG, 2007).<br />
Ganz allgemein lässt sich der Prozess des Einfrierens in fünf verschiedene Ab-<br />
schnitte unterteilen:<br />
1. Equilibrierungsphase: Die Embryonen werden in der Gefrierschutzlösung<br />
equilibriert.<br />
2. Abkühlungsphase: Sie beginnt bei der Körpertemperatur der Zellen und<br />
endet mit Erreichen der gewählten Lagerungstemperatur. Es müssen<br />
dabei definierte Einfrierraten (°C pro Minute) des jeweiligen Gefriergutes<br />
eingehalten werden.<br />
3. Lagerungsphase: Hier werden die Zellen bei mindestens -130°C, in der<br />
Regel aber bei -196°C aufbewahrt.<br />
4. Auftau- und Wiedererwärmungsphase: In diese Phase werden die Zellen<br />
<strong>von</strong> der Lagerungstemperatur wieder auf Körpertemperatur erwärmt. Die<br />
dabei gewählte Auftaurate ist <strong>von</strong> der zuvor verwendeten Einfrierrate ab-<br />
hängig.<br />
5. Ausverdünnungsphase: In dieser letzten Phase müssen die verwendeten<br />
Kryoprotektiva wieder möglichst vollständig und schnell <strong>von</strong> den Zellen<br />
entfernt werden, da nur dann eine ungestörte Weiterentwicklung im An-<br />
schluss an das Auftauen möglich ist (WILLADSEN et al., 1978; RALL et<br />
al., 1984).<br />
5
2.3 Physikalische und chemische Abläufe beim Einfrieren <strong>von</strong><br />
Zellen<br />
Ganz ähnlich der fünf verschiedenen Prozessphasen beim Einfrieren, können<br />
auch die intra- und extrazellulär ablaufenden Vorgänge während des Einfrierens<br />
in sechs Schritte eingeteilt werden:<br />
1. Im Bereich zwischen 37°C und 20°C befindet sich die Zelle in einem<br />
physiologischen Bereich und die intra- und extrazellulären Prozesse lau-<br />
fen aufeinander abgestimmt ab.<br />
2. In der Temperaturzone <strong>von</strong> 20° bis -2°C ist der Stoffwechsel der Zelle<br />
bereits stark eingeschränkt. Alle Vorgänge in den Zellen laufen deutlich<br />
langsamer ab oder werden sogar gänzlich gestoppt. Aus dem Grunde ist<br />
dieser Temperaturbereich <strong>von</strong> so großer Bedeutung in der Vorbereitung<br />
der Zelle zum eigentlichen Einfrieren.<br />
3. Die Temperaturen sinken <strong>von</strong> -2° auf -15°C ab. Die einsetzende Eisbil-<br />
dung beginnt meistens an Kristallisationskeimen in der extrazellulären<br />
Lösung. Die Temperatur, bei der die Kristallisation einsetzt, wird durch<br />
die chemische Zusammensetzung der verwendeten Kryoprotektivumslö-<br />
sung festgelegt (MAZUR, 1977; LEIBO & MAZUR, 1978). Als Folge des<br />
osmotischen Effektes wird Wasser aus der Zelle herausgezogen. Da-<br />
durch dehydriert die Zelle und beginnt zu schrumpfen. Dieses Schrump-<br />
fen ist möglich, da ca. 90% des Wassers der Blastomeren in ungebun-<br />
dener Form vorliegt (MAZUR, 1963; MERYMAN et al., 1984). Der Emb-<br />
ryo ist in der Lage, bis auf etwa 40% seines ursprünglichen isotonischen<br />
Ausgangsvolumens zu schrumpfen, ohne dass er dabei Schäden erleidet<br />
(SCHNEIDER & MAZUR, 1984). Durch Auswahl möglichst optimaler Ab-<br />
kühlraten kann den Prozess der intrazellulären Eiskristallbildung opti-<br />
miert werden. Die Raten sollen langsam genug sein, um eine ausrei-<br />
chenden Dehydrierung zu ermöglichen und schnell genug um die Zellen<br />
nicht unnötig den Lösungseffekten der Kryoprotektiva auszusetzen.<br />
4. Es erfolgt ein weiteres Absinken der Temperaturen im Bereich <strong>von</strong> -15°<br />
auf -25°C. In diesem Temperaturbereich setzt auch die intrazelluläre<br />
Eisbildung ein. Dabei kommt es zu einer Entmischung und Dislokalisati-<br />
on der Bestandteile des Zytoplasmas. Durch Zugabe <strong>von</strong> Kryoprotektiva<br />
6
kann die Wasserstruktur dahingehend beeinflusst werden, dass statt ei-<br />
niger großer, viele kleine Eiskristalle gebildet werden, die etwas weniger<br />
schädlich für die Zelle sind. Die zunehmende Eiskristallbildung führt zu<br />
einer Konzentrationserhöhung gelöster Stoffe in der restlichen Flüssig-<br />
keit. Das hat zur Folge, dass der Gefrierpunkt der verbleibenden Flüssig-<br />
keit kontinuierlich sinkt (SCHIEWE et al., 1987).<br />
5. Die Temperatur bewegt sich <strong>von</strong> -25° auf -130°C. Dieser Bereich ist<br />
gekennzeichnet durch ein migratorisches Wachstum der großen<br />
Eiskristalle auf Kosten der kleineren. Der Vorgang der Umkristallisation<br />
läuft zwar mit den stetig geringer werdenden Temperaturen immer<br />
langsamer ab, trotzdem hat der Prozess immense Auswirkungen auf die<br />
Zelle. Die Beweglichkeit kleinerer Eiskristalle und die damit verbundene<br />
Dynamik innerhalb der Zelle führt zu einer Erhöhung des<br />
Energiepotentials der Kristalle (Thermische Stösse) und verursacht<br />
demzufolge, dass Wassermoleküle immer noch in der Lage sind ihre<br />
Positionen wechseln. Das hat wiederum zur Folge, dass bereits vorhan-<br />
dene, größere Eisbezirke weiter wachsen und so zu einer Schädigung<br />
der Zellen führen können. Dies ist einer der Gründe warum man<br />
kryokonservierte Proben auch nicht über eine längere Zeit bei -80°C<br />
aufbewahren und diesen Temperaturbereich möglichst schnell<br />
6. In überwinden diesem letzten sollte. Schritt kommen bei Temperaturwerten <strong>von</strong> unter -<br />
130°C alle Vorgänge fast vollständig zum Stillstand. Das ist der Grund,<br />
weshalb heute Langzeiteinlagerungen <strong>von</strong> lebenden Proben bei mindes-<br />
tens -130°C unter Verwendung <strong>von</strong> LN2 als Kühlmittel üblich sind.<br />
Während des Auftauvorganges laufen all diese Prozesse abermals ab, aller-<br />
dings in umgekehrter Weise. Für die Zellen bedeutet dieser Umstand eine er-<br />
neute enorme Belastung und zusätzlichen Stress.<br />
Bis heute ist es, trotz der großen Fortschritte auf dem Sektor der Kryofor-<br />
schung, noch immer nicht möglich, jede Art <strong>von</strong> Zellen mittels Kryokonservie-<br />
rung haltbar zu machen.<br />
7
2.4 Kryoprotektiva - Aufgabe und Wirkung<br />
Um ein Überleben der eingefrorenen Zellen zu erreichen, ist das Vorhanden-<br />
sein <strong>von</strong> Gefrierschutzmitteln (Kryoprotektiva) <strong>von</strong> entscheidender Bedeutung.<br />
Die Gefrierschutzmittel werden in penetrierende, in die Zelle hineingelangende,<br />
und nicht penetrierende, im extrazellulären Raum verbleibende (DOEBBLER,<br />
1966; MERYMAN, 1971; McGANN, 1978; LEIBO, 1981) unterteilt.<br />
Trotz intensiver Forschung besteht noch keine ganz gesicherte, genaue Infor-<br />
mation über die Wirkungsweise der Kryoprotektiva (FAHY, 1986) Es sind aller-<br />
dings einige Schutzmechanismen und -wirkungen in der Diskussion. Als relativ<br />
wahrscheinlich sind die im Folgenden kurz genannten Wirkungen und Mecha-<br />
nismen anzunehmen.<br />
Durch den Einsatz <strong>von</strong> Kryoprotektiva wird eine Verringerung der Temperatur<br />
erreicht, bei der die intrazelluläre Eisbildung einsetzt. Außerdem scheinen sie<br />
die Zellmembranen zu stabilisieren, indem sie Schäden durch intrazelluläre<br />
Kristallbildung sowie Lösungseffekte vermindern (NIEMANN, 1983).<br />
SMITH et al. (1951) vermuteten, dass eine Zugabe <strong>von</strong> Gefrierschutzmitteln<br />
dazu führt, dass vermehrt kleine und weniger große, schädigende Eiskristalle<br />
gebildet werden. Durch die Wasserbindungsfähigkeit der Kryoprotektiva wird<br />
analog der osmolytischen Gegebenheiten eine Verdünnung der Elektrolytkon-<br />
zentration in der extrazellulären Flüssigkeit erreicht (MAZUR, 1970; FARRANT<br />
& MORRIS, 1973), die eine verlangsamte Dehydrierung der Zellen zur Folge<br />
hat. Das bedeutet, dass Zellschäden verursachende Vorgänge langsamer ab-<br />
laufen und extra- und intrazelluläre Ionenkonzentrationen erst ab deutlich tiefe-<br />
ren Temperaturen, und damit zu einem für die Zellen weniger kritischen Zeit-<br />
punkt, auf schädigende Werte ansteigen (LOVELOCK, 1954; LEIBO, 1977;<br />
MERYMAN et al., 1977; LEIBO & MAZUR, 1978; LEHN-JENSEN, 1981;<br />
FRIEDLER et al., 1988). WHITTINGHAM konstatierte 1980, dass Kryoprotekti-<br />
va zwar die Bildung intrazellulären Eises in den Zellen nicht vollständig verhin-<br />
dern, wohl aber schädigende Effekte, verursacht durch zu hohe Ionenkon-<br />
zentrationen, mildern können.<br />
Im Vergleich zu Medien, die keine Kryoprotektiva enthalten, bewirken die penet-<br />
rierenden und nicht penetrierenden Inhaltsstoffe der Kryoprotektiva während<br />
8
der Konservierungsabläufe, dass es in Lösungen mit Gefrierschutzmittelzugabe<br />
zu weniger Zellmembranveränderungen kommt (FARRANT & MORRIS, 1973).<br />
Für die verwendeten Kryoprotektiva ist es elementar, dass sie weder während<br />
der Abkühlungs- noch während der Auftauphase toxische Wirkungen auf die<br />
Zellen ausüben (FARRANT, 1965). FRIEDLER et al. (1988) plädierten trotzdem<br />
dafür, die Kryoprotektiva im Anschluss an das Auftauen schnellstmöglich aus<br />
den Zellen zu entfernen, da sie bei zu langem Verbleib in den aufgetauten Zel-<br />
len eine Schädigung bewirken können.<br />
Als erstes geeignetes Gefrierschutzmittel für eine Tiefgefrierung <strong>von</strong> lebenden<br />
Zellen und Geweben beschrieben POLGE et al. 1949 den Wirkstoff Glycerin.<br />
LOVELOCK & BISHOP entdeckten 1959 Dimethylsulfoxid (DMSO) als Kryopro-<br />
tektivum, welches aber heutzutage wegen seiner, im Vergleich mit anderen<br />
Kryoprotektiva, erhöhten Zelltoxizität weniger Verwendung findet.<br />
Seit dieser Zeit wurden diverse Substanzen auf ihre Eignung als Kryoprotekti-<br />
vum untersucht. So zum Beispiel ein- und mehrfache Alkohole, Amide, Dextra-<br />
ne, Mono- und Disaccharide, Polyvinylpyrrolidon (PVP), Polyvinylalkohol (PVA)<br />
und Serumproteine. Von diesen Stoffen haben sich allerdings nur wenige als<br />
praxistauglich erwiesen.<br />
Die den Gefrierschutzmedien zugesetzten Serumproteine sorgen für einen zu-<br />
sätzlichen Membranschutz der konservierten Zellen, scheinen aber weiter keine<br />
direkten Schutzmechanismen zu erfüllen (FARRANT, 1981).<br />
2.4.1 Penetrierende Kryoprotektiva<br />
Das Kennzeichen penetrierender Gefrierschutzmittel ist das Vermögen, auf<br />
Grund eines geringen Molekulargewichtes, durch die Zellmembranen in die Zel-<br />
len hineinzugelangen (MERYMAN, 1971; LEIBO, 1988). Penetrierende Gefrier-<br />
schutzmittel verhindern eine extreme intrazelluläre Eisbildung und werden des-<br />
halb auch in sehr hohen Konzentrationen <strong>von</strong> ein bis vier Mol verwendet. Gera-<br />
de bei diesen Konzentrationshöhen sollten sie möglichst keine toxischen Aus-<br />
wirkungen auf die Zelle haben.<br />
9
Die penetrierenden Kryoprotektiva müssen die Zellmembran durchdringen, um<br />
eine osmotische Dehydrierung mit daraus resultierender hoher Elektrolytkon-<br />
zentration im Inneren der Zelle zu verhindern (MERYMAN, 1971).<br />
Nach Zugabe der Gefrierschutzsubstanzen besteht zunächst eine Osmolari-<br />
tätsdifferenz zwischen der extra- und der intrazellulären Lösung. Durch das<br />
Kryoprotektivum erhöht sich die Osmolarität in der extrazellulären Lösung. Um<br />
dieses auszugleichen beginnt der Embryo zu schrumpfen. Dies geschieht so<br />
lange, bis die Rate des Ausströmens <strong>von</strong> Wasser der Rate des Einströmens<br />
<strong>von</strong> Kryoprotektivum in den intrazellulären Raum entspricht und so ein Konzent-<br />
rationsausgleich erreicht wird. Das Ausmaß der anfänglichen Schrumpfung des<br />
Embryos steht in Beziehung zur Permeabilität der Zellmembran. Je stärker eine<br />
Penetration möglich ist, desto geringer ist die Schrumpfung, da mit dem Ge-<br />
frierschutzmittel zugleich auch Wasser aufgenommen wird. Beim Schrump-<br />
fungsprozess ist es den Zellen möglich, bis auf etwa ein Drittel ihrer Ausgangs-<br />
größe zu schrumpfen ohne bleibende Schäden zu erleiden (SCHNEIDER &<br />
MAZUR, 1984; LEIBO, 1989). Durch das Wasserbindungsvermögen der penet-<br />
rierenden Kryoprotektiva wird eine zu starke Dehydrierung der Zellen verhin-<br />
dert.<br />
In welchem Umfang ein Gefrierschutzmittel in die Zellen gelangt und auch die<br />
Zeitspanne bis zur abgeschlossenen Equilibrierung, ist <strong>von</strong> verschiedenen Fak-<br />
toren abhängig. Zu diesen Faktoren gehören die Temperatur bei der die Equi-<br />
librierung stattfindet, der Permeabilitätskoeffizient des Kryoprotektivums, der<br />
Unterschied zwischen extra- und intrazellulärer Konzentration und die Beschaf-<br />
fenheit der Zelloberfläche. Außerdem besitzt jede Spezies und jedes Embryo-<br />
nalstadium ganz eigene, individuelle Charakteristika bezüglich der Permeabilität<br />
(MAZUR, 1977; SCHNEIDER & MAZUR, 1984; FRIEDLER et al., 1988; PED-<br />
RO et al., 2005). Die Temperatur hat einen entscheidenden Einfluss auf die<br />
Geschwindigkeit der Equilibrierung, da diese bei höheren Temperaturen schnel-<br />
ler abläuft als bei niedrigeren. In der Praxis hat sich eine Equilibrierung bei 20°C<br />
bis 25°C Raumtemperatur etabliert.<br />
Es wird auch vermutet, dass penetrierende Kryoprotektiva bewirken, dass die<br />
intra- und extrazelluläre Ionenkonzentration der noch ungefrorenen Restflüssig-<br />
keit sich verringert und somit der Gefrierpunkt der intrazellulären Flüssigkeiten<br />
sinkt (LOVELOCK, 1954; LEIBO, 1977; MERYMAN et al., 1977; LEIBO & MA-<br />
10
ZUR, 1978; MAZUR, 1980). Das hat zur Folge, dass unter Verwendung <strong>von</strong><br />
Kryoprotektiva zum Beispiel bei Mäuseblastomeren erst ab -35°C bis -45°C ein<br />
Gefrieren der Intrazellularflüssigkeit eintritt (LEIBO et al., 1977).<br />
Als penetrierende Kryoprotektiva finden Stoffe wie Glycerol, Dimethylsulfoxid<br />
(DMSO), Ethylenglycol (EG), Propandiol (PROH), Ethanol und andere Alkohole<br />
Verwendung. DMSO wird nach neueren Erkenntnissen weniger stark verwendet<br />
als noch vor einigen Jahren, da es eine ausgesprochen hohe Toxizität besitzt.<br />
1983 berichteten RALL et al. <strong>von</strong> sehr guten Ergebnissen bei der Kryokonser-<br />
vierung <strong>von</strong> Mäuseembryonen unter der Verwendung des Alkohols Methanol.<br />
Auch andere höherwertige Alkohole wie Ethylenglycol (EG) und Propylenglycol<br />
(PG) wurden in der Folgezeit auf ihre Embryonenverträglichkeit getestet. Es<br />
zeigte sich sowohl eine gute kryoprotektive Wirkung auf die tierischen Kanin-<br />
chen- und Mausembryonen als auch auf humane Embryonen (KASAI et al.,<br />
1981; MIYAMOTO & ISHIBASHI, 1981, 1983a; NGUYEN et al., 1983; RALL &<br />
POLGE, 1984; RENARD et al., 1984; RENARD & BABINET, 1984; TESTART<br />
et al., 1985). In der Rinderzucht wird heutzutage bei der Kryokonservierung<br />
sehr häufig Ethylenglycol eingesetzt, da dessen Toxizität so gering ist, dass es<br />
möglich ist, kryokonservierte Embryonen auch ohne vorherige Ausverdünnung<br />
zu übertragen.<br />
2.4.1.1 Glycerol<br />
Glycerol als Kryoprotektivum wurde erstmals 1949 <strong>von</strong> POLGE et al. als Ge-<br />
frierschutzmittel für eine Kryokonservierung <strong>von</strong> Geflügelsperma erwähnt. Seit<br />
diesem Zeitpunkt ist die Eigenschaft, Toxizität und Dosierung <strong>von</strong> Glycerol fort-<br />
laufend erforscht worden.<br />
Bereits 1971 vermerkte MERYMAN, dass Glycerol im Gegensatz zu DMSO im<br />
Zellinneren kaum toxische Wirkung hat. BILTON untersuchte 1980 den Einfluss<br />
<strong>von</strong> Glycerol und DMSO auf Rinderembryonen. Es wurden dabei allerdings kei-<br />
ne signifikanten Unterschiede festgestellt. In weiteren Versuchen zu der optima-<br />
len Konzentrationshöhe stellte sich heraus, dass Glycerol in den Konzentratio-<br />
nen <strong>von</strong> 1,3 M bis 1,4 M DMSO mit einer Konzentration <strong>von</strong> 1,3 M bis 1,5 M bei<br />
konventionellen Kryokonservierungsverfahren gegenüber im Vorteil ist. Zu die-<br />
11
sem Schlüssen kamen FALGE et al. (1982), RALL & POLGE (1984), TAKEDA<br />
et al. (1987) nach Versuchen mit Mäuseembryonen sowie BOUYSSON &<br />
CHUPIN (1982) und PRATHER et al. (1987) nach Versuchen mit Rinderembry-<br />
onen. RALL & POLGE (1984) begründeten ihre Ergebnisse mit der Aussage,<br />
dass DMSO-Lösungen eine geringere Viskosität aufwiesen als Glycerol-<br />
Lösungen. Kommt Glycerol in konventionellen Gefrierverfahren zum Einsatz,<br />
wird häufig eine Konzentration <strong>von</strong> ein bis zwei Mol gewählt. 1983 untersuchten<br />
MERRY et al. die Auswirkungen <strong>von</strong> verschiedenen Glycerol-Konzentrationen<br />
auf die in vitro-Entwicklungsraten (ER) nach einer Kryokonservierung und ei-<br />
nem schrittweisen Auftauen. Die verwendeten Konzentrationen (1,0 M, 1,4 M,<br />
1,8 M) führten bei den ermittelten in vitro-ER der Embryonen (49%, 44%, 52%)<br />
allerdings nicht zu signifikanten Unterschieden.<br />
Auch für anderen Tierrassen wurden Versuche zur Höhe der Gefrierschutzmit-<br />
tel-Konzentration durchgeführt. So führten Versuche an Rinderembryonen mit<br />
unterschiedlichen Glycerol-Konzentrationen durch KENNEDY et al. 1983 zu<br />
keinen eindeutigen Unterschieden. Zu ähnliche Ergebnisse kam LEHN-<br />
JENSEN (1986), als er Glycerol in den Konzentrationen 0,5 M, 1,0 M und 1,4 M<br />
einsetzte. Bei 1,0 M und 1,4 Mol kam es zu keinen signifikanten Unterschieden.<br />
Allerdings stellte er bei 0,5 M fest, dass diese Konzentration als nicht ausrei-<br />
chend für einen sicheren Kryoschutz anzusehen ist.<br />
An Schafembryonen testeten WARE & BOLAND 1987 die Auswirkungen ver-<br />
schiedener Konzentrationen auf erfolgreiches Kryokonservieren und Auftauen<br />
im Zusammenhang mit Saccharose. Dabei stellen sie fest, dass sich eine Kon-<br />
zentration <strong>von</strong> 2,8 M Glycerol immer toxisch auswirkt; unabhängig da<strong>von</strong> in<br />
welcher Geschwindigkeit das Ausverdünnen mit Saccharose erfolgte.<br />
Bei den ultraschnellen Gefrierverfahren kommt Glycerol in multimolarer Kon-<br />
zentration und bei der Vitrifikation in Kombination mit weiteren Kryoprotektiva<br />
zum Einsatz.<br />
2.4.1.2 Dimethylsulfoxid (DMSO)<br />
LOVELOCK & BISHOP waren 1959 die ersten, die die kryoprotektiven Eigen-<br />
schaften <strong>von</strong> DMSO bei der Gefrierkonservierung <strong>von</strong> Zellen beschrieben. 1972<br />
12
gelang es WHITTINGHAM et al. erstmals eine erfolgreiche Kryokonservierung<br />
<strong>von</strong> Mäuseembryonen durchzuführen. Dabei schien es, dass DMSO Glycerol in<br />
seinen protektiven Eigenschaften überlegen sei.<br />
In den folgenden Jahren gelang es, weitere Spezies unter Verwendung <strong>von</strong><br />
DMSO erfolgreich tiefzugefrieren. BANK & MAURER (1974) sowie MAURER &<br />
HASEMAN (1976) berichteten <strong>von</strong> positiven Ergebnissen bei der Kryokonser-<br />
vierung <strong>von</strong> Kaninchenembryonen. WILLADSEN et al. (1978) und BILTON<br />
(1980) froren erfolgreich Rinderembryonen ein und TROUNSON & MOHR ge-<br />
lang 1983 die Konservierung <strong>von</strong> Humanembryonen.<br />
Glycerol und DMSO sind auf Grund ihres molekularen Aufbaus in der Lage, Zel-<br />
len schneller zu penetrieren als Wasser. Im direkten Vergleich zwischen Glyce-<br />
rol und DMSO ist DMSO jedoch noch deutlich schneller (TROUNSON &<br />
MOHR, 1983; AGCA et al., 1997). 1971 stellte MERYMAN fest, dass DMSO die<br />
Fähigkeit besitzt, vollständig in die Zelle einzudringen. Laut MIYAMOTO et al.<br />
(1998) ist die vollständige Penetration elementare Voraussetzung für einen<br />
wirksamen Schutz, da ein Vorhandensein <strong>von</strong> DMSO allein in der extrazellulä-<br />
ren Lösung nicht ausreicht, um eine sichere Kryokonservierung zu gewährleis-<br />
ten.<br />
Verschiedene Versuche zur nötigen Konzentrationshöhe <strong>von</strong> DMSO führten<br />
LEIBO & MAZUR 1978 zu der Feststellung, dass eine Verwendung <strong>von</strong> 1 M<br />
DMSO keinen sicheren Schutz bietet. BANK & MAURER (1974), FORGRAVE<br />
et al. (1977) und WILLADSEN (1980) kamen in ihren Versuchen an unter-<br />
schiedlichen Spezies zu dem Schluss, dass DMSO in konventionellen Gefrier-<br />
verfahren erst ab einer Konzentration <strong>von</strong> 1,5 M eine ausreichende Schutzwir-<br />
kung hat.<br />
LEHN-JENSEN stellte 1980 durch Messungen an pH-Wert und Osmolarität<br />
fest, dass DMSO in Konzentrationen, wie sie beim Kryokonservieren zur Ver-<br />
wendung kommen, deutlich größere pH-Wert Veränderungen und wesentlich<br />
größeren osmotischen Stress für die Zellen hervorruft als es bei Glycerol der<br />
Fall ist. Dadurch erklärt sich auch die höhere Toxizität <strong>von</strong> DMSO im Vergleich<br />
zu Glycerol (FRIEDLER et al., 1988).<br />
Allerdings besitzt DMSO eine gute Bereitschaft zu Glasbildung (FRIEDLER et<br />
al., 1988; VALDEZ et al., 1992). und wird aus diesem Grunde häufig als Be-<br />
13
standteil für Vitrifikationslösungen genutzt (ISHIMORI et al., 1992, 1993; VIN-<br />
CENTE & GARCIA-XIMENEZ, 1994).<br />
2.4.1.3 Ethylenglycol (EG)<br />
Im Vergleich zu Glycerol (Mg 91,1), DMSO (Mg 78,1) und Propandiol (Mg 76,1)<br />
besitzt Ethylenglycol mit 62,1 ein geringeres Molekulargewicht (Mg). Aus die-<br />
sem Grunde ist es in der Lage, schneller in die Zelle hinein und wieder heraus<br />
zu diffundieren, als es den anderen penetrierenden Kryoprotektiva möglich ist.<br />
Besonders bei höheren Konzentrationen stellen das erhöhte Permeabilitäts-<br />
vermögen und die sich so ergebende verringerte Toxizität, verglichen mit ande-<br />
ren Kryoprotektiva, bedeutende Vorteile dar (MAHMOUDZADEH et al. 1993;<br />
CSEH et al. 1997).<br />
Dass EG eine kryoprotektive Wirkung besitzt, konnten MIYAMOTO & ISHI-<br />
BASHI 1977 erstmalig anhand kontrollierter Kryokonservierungsversuche an<br />
Ratten- und 8-Zell-Mäuseembryonen zeigen.<br />
In diversen weiteren Versuchen wurden Unterschiede auf die Überlebensraten<br />
(ÜR) <strong>von</strong> Rinder- und Schafembryonen bei Verwendung <strong>von</strong> EG oder Glycerol<br />
als Gefrierschutzmittel bei konventioneller Kryokonservierung untersucht.<br />
Dabei stellte man fest, dass EG im Vergleich zu Glycerol gleiche oder sogar<br />
bessere Überlebensraten erzielte (COCERO et al. 1988; LANGE 1995; KLING<br />
1997; BEAL et al. 1998).<br />
Bei Versuchen zur Ermittlung verträglicher und wirkungsvoller EG-<br />
Konzentrationen verwendeten VOELKEL & HU (1992a; 1992b) Rinderembryo-<br />
nen in den Stadien Morula bis expandierte Blastocyste bei Ethylenglycolkon-<br />
zentrationen zwischen 1,0 M bis 2,0 M. Dabei stellten sie fest, dass eine Ethy-<br />
lenglycolkonzentration in Höhe <strong>von</strong> 1,5 M am besten geeignet war.<br />
1999 equilibrierten SOMMERFELD & NIEMANN in vitro-produzierte Tag 7-<br />
Rinderblastozysten 10 min in Ethylenglycollösungen bei Konzentrationen in Hö-<br />
he <strong>von</strong> 1,8 bis 8,9 M bei Raumtemperatur. Die höchste Schlupfrate (SR) erziel-<br />
ten nach 72 h in vitro-Kultivierung mit 98% diejenigen Embryonen, die bei einer<br />
Konzentration <strong>von</strong> 3,6 M equilibriert worden waren. Auch beim one-step-<br />
Equilibrieren und Ausverdünnen <strong>von</strong> zuvor <strong>kryokonservierten</strong> in vitro-<br />
14
produzierten Rinderembryonen zeigte sich eine 3,6 M Ethylenglycolkonzentrati-<br />
on als beste Konzentrationshöhe.<br />
Versuche zu Auswirkungen <strong>von</strong> unterschiedlich vielen Equilibrierungstufen vor<br />
und Ausverdünnungsstufen während des Auftauens nach Kryokonservierung<br />
führten McGINNIS et al. 1989 durch. Sie stellten fest, dass es nach Kryokon-<br />
servierung mit 1,5 M Ethylenglycol keine Unterschiede in den in vitro-ÜR gab.<br />
In verschiedenen Untersuchungen wurde festgestellt, dass EG in der Lage ist<br />
schneller durch Zellmembranen zu diffundieren als Glycerol. Zusätzlich hat E-<br />
thylenglycol auch bei höheren Temperaturen offensichtlich wesentlich weniger<br />
toxische Auswirkungen als Glycerol. Diese Eigenschaften führen dazu, dass auf<br />
das zeitlich und arbeitstechnisch aufwendige Ausverdünnen des Gefrier-<br />
schutzmittels beim Auftauen verzichtet werden kann.<br />
VOELKER & HU (1992b) stellten in ihren Versuchen fest, dass ein direkter<br />
Transfer <strong>von</strong>, mit Ethylenglycol tiefgefrorenen, Rinderembryonen möglich sei.<br />
Diese verbesserte Handhabung (geringerer Material- und Zeitaufwand), beson-<br />
ders für die praktische Umsetzung in der Routine bedeutsam, wurde in weiteren<br />
Versuchen wiederholt und ebenfalls bestätigt (McINTOSH & HAZELAGER,<br />
1994; BRACKE et al., 1995; DOCHI et al., 1995; JANOWITZ & HERMANNS,<br />
1995; LANGE, 1995). Dieses sogenannte One-Step-Verfahren ist heute in der<br />
Routine weit verbreitet.<br />
Ethylenglycol wird aber nicht nur bei der konventionellen Kryokonservierung,<br />
sondern auch bei der Vitrifikation und dem ultraschnellen Tieffrieren verwendet.<br />
Bei Versuchen zur Vitrifikation zeigte es sich, dass EG weniger toxisch auf die<br />
Embryonen wirkte als andere Kryoprotektiva (MAHMOUDZADEH et al., 1993).<br />
Für Mäuse- und Rinderembryonen wurden auch beim ultraschnellen Tiefgefrie-<br />
ren gute Schutzwirkungen durch Ethylenglycol nachgewiesen. RAYOS et al. er-<br />
hielt 1992 sehr gute in vitro-ÜR, nachdem er Ein-Zell-Mauseembryonen für 10<br />
Minuten in 3 M EG und 0,25 M Saccharose equilibriert hatte. NOWSHARI &<br />
BREM (1998a) stellten deutlich höhere Schlupfraten (SR) bei ultraschnell tiefge-<br />
frorenen, expandierten Mauseembryonen fest, wenn diese nach vorheriger De-<br />
hydrierung mit Saccharose, unter Verwendung <strong>von</strong> 7 M EG anstatt 7 M PROH<br />
kryokonserviert wurden.<br />
15
2.4.2 Nicht penetrierende Kryoprotektiva<br />
Im Gegensatz zu den penetrierenden Kryoprotektiva, dringen die nicht penetrie-<br />
renden Gefrierschutzmittel nicht in die Zelle ein, sondern entfalten ihre schüt-<br />
zenden Wirkung im extrazellulären Raum. Denn auch ohne Penetration scheint<br />
<strong>von</strong> diesen Substanzen eine kryoprotektive Wirkung auszugehen. Mehrere Au-<br />
toren vermuten, dass die Gefrierschutzmittel eine Stabilisierung der Zellmemb-<br />
ranen bewirken (HEBER, 1968; MAZUR, 1970; LEIBO et al., 1974; MERYMAN,<br />
1974; MAZUR, 1976; BARNETT, 1978; UTSUMI, 1978; RALL et al., 1983).<br />
Die in der Kryokonservierung verwendeten nicht penetrierenden Kryoprotektiva<br />
gehören zu den Gruppen der Monosaccharide (Galaktose, Fructose, Glucose),<br />
den Disacchariden (Saccharose, Trehalose, Lactose), Proteinen, Lipoproteinen<br />
sowie Polyvinylpyrrolidon (PVP). Da die Saccharose das in der Praxis am wei-<br />
testen verbreitete Kryoprotektivum ist (LEIBO, 1988) und auch in der vorliegen-<br />
den Arbeit verwendet wurde, wird schwerpunktmäßig auf dieses nicht penetrie-<br />
rende Kryoprotektivum eingegangen.<br />
Es ist ausreichend, die nicht penetrierenden Kryoprotektiva in einem niedrigen<br />
molaren Konzentrationsbereich einzusetzen, wodurch die Toxizität dieser Sub-<br />
stanzen verringert wird (NIEMANN & MEINEKE, 1993). Um die Phase der De-<br />
hydration zu unterstützen, werden die nicht penetrierenden Gefrierschutzmittel<br />
sowohl in der Equilibrierungsphase vor der Kryokonservierung als auch bei der<br />
Ausverdünnung der Kryoprotektiva während des Auftauens eingesetzt, um ein<br />
übermäßiges Anschwellen der Embryonen zu verhindern (FRIEDLER et al.,<br />
1988).<br />
MERYMAN stellt 1971 fest, dass durch den Einsatz <strong>von</strong> nicht penetrierenden<br />
Kryoprotektiva die Zellen in der Lage sind, gelöste Stoffe unter osmotischem<br />
Stress penetrieren zu lassen.<br />
PVP und Acetamid, als für Embryonen hochtoxische Substanzen, werden heut-<br />
zutage in der Regel nur noch bei der Vitrifikation eingesetzt (RALL & FAHY,<br />
1985; RALL et al., 1985). In der assistierten Reproduktion kommt PVP zur Im-<br />
mobilisierung der Spermien bei ICSI zur Verwendung - weniger als Schutzsub-<br />
stanz bei der Kryokonservierung.<br />
16
Dem Gefrierschutzmittel Saccharose selber wird so gut wie keine kryoprotektive<br />
Wirkung zugeschrieben (WHITTINGHAM, 1971; WILMUT, 1972; MIYAMOTO &<br />
ISHIBASHI, 1976; MERYMAN et al., 1977; KASAI et al., 1981). Sie wird aber<br />
als Unterstützung für die Dilution der Kryoprotektiva und bei dem Verfahren der<br />
Vitrifikation zur isothermen Dehydrierung verwendet (TAKEDA et al., 1984;<br />
KRAG et al., 1985a, 1985b; PEURA et al., 1985; RALL & FAHY, 1985; RALL et<br />
al., 1985; WILLIAMS & JOHNSON, 1985).<br />
KASAI et al. (1981, 1983) entdeckten, dass es möglich ist, Embryonen über ei-<br />
nen begrenzten Zeitraum hinweg in saccharosehaltigen Medien bei Temperatu-<br />
ren oberhalb des Gefrierpunktes zu lagern.<br />
SEIDEL (1989) nahm an, dass eine kryoprotektive Wirkung der Saccharose<br />
schon vor dem eigentlichen Kühlprozess einsetzt. Er stellte fest, dass durch<br />
Einsatz <strong>von</strong> 0,2 M bis 0,3 M Saccharose die Zellen soweit vordehydriert wer-<br />
den, dass das Umsetzen in flüssigen Stickstoff (LN2) schon bei deutliche höhe-<br />
ren Temperaturen durchgeführt werden kann, ohne das die Zellen beschädigt<br />
werden. Diese These wurde auch <strong>von</strong> MASSIP et al. (1987) und MERMILLOD<br />
et al. (1992) unterstützt, die ein Umsetzen bereits ab -25°C für möglich erachte-<br />
ten.<br />
Da Saccharose aber als alleiniges Protektivum keine ausreichende Schutzwir-<br />
kung besitzt (LEIBO, 1989), wird sie in der Regel in Konzentrationen <strong>von</strong> 0,1 M<br />
bis 0,3 M kombiniert mit penetrierenden Kryoprotektiva eingesetzt (LEHN-<br />
JENSEN, 1984).<br />
Um auch bei höheren Kühlraten einen ausreichenden Schutz zu gewährleisten,<br />
ist offensichtlich zusätzlich zu den penetrierenden Gefrierschutzmitteln der Ein-<br />
satz nicht penetrierender Kryoprotektiva sinnvoll, da nur so eine notwendige<br />
und schnelle Dehydrierung der Zellen möglich ist (MERYMAN et al., 1977).<br />
Beim Auftauen ist der Embryo im Vergleich zur Equilibrierungsphase in Vorfeld<br />
der Kryokonservierung einer verringerten extrazellulären Kryoprotektiva-<br />
Konzentration ausgesetzt, was zur Folge hat, dass Wasser relativ schnell in den<br />
Embryo einströmt. Dabei kann unter Umständen Wasser so schnell und so<br />
stark einströmen, dass der Embryo bis zu seinem Zerreißen anschwillt. Bleibt<br />
die Volumenzunahme aber innerhalb der maximal tolerierbaren Grenzen, ent-<br />
stehen an den Zellmembranen keine Schäden. Auf Grund der Molekülgröße ist<br />
Saccharose nicht in der Lage, Zellwände zu penetrieren. Sie wird aber als os-<br />
17
motischer Puffer bei der Entfernung penetrierender Gefrierschutzsubstanzen<br />
verwendet, um ein zu starkes Anschwellen zu vermeiden (NIEMANN, 1982;<br />
RENARD et al., 1982; LEIBO, 1984; MASSIP et al., 1987).<br />
In Versuchen stellten SCHNEIDER & MAZUR (1984) fest, dass Mäuseembryo-<br />
nen fähig sind, bei 23°C für 30 Minuten eine 2,7-fache Volumenzunahme zu<br />
überstehen. Wird Saccharose als Puffer verwendet, können die Embryonen bis<br />
auf 25% ihres ursprünglichen Volumens schrumpfen ohne das es zu Schäden<br />
kommt. Nach abgeschlossener Equilibrierung und Umsetzung in zum Beispiel<br />
ein Kulturmedium kehren die Embryonen zu ihrem normalen Volumen zurück<br />
(SZELL & SHELTON, 1986; VOELKEL & HU, 1992a). Ein vollständig ablaufen-<br />
der Schrumpfungs- und Reexpandierungszyklus ist neben der morphologischen<br />
Beurteilung ein zusätzlicher Hinweis auf Unversehrtheit und Vitalität der Zellen<br />
(BIELANSKY et al., 1986).<br />
1989 untersuchten MAPLETOFT et al. die in vitro-Überlebensraten (ÜR) frisch<br />
gespülter Mäuseembryonen in Abhängigkeit unterschiedlicher Saccharose-<br />
Konzentrationen. Dazu wurden die Embryonen für 10 oder 30 Minuten bei 20°C<br />
bzw. 35°C in den Saccharose-Lösungen equilibriert. Bei einer 0,5 M Saccharo-<br />
se-Lösung schienen Zeit und Temperatur nur wenige Auswirkungen zu haben.<br />
Bei 1,0 M Saccharose nahmen die in vitro-ÜR nach Verlängerung der Equi-<br />
librierungsdauer und einer Temperaturerhöhung deutlich ab. Wurden die Mäu-<br />
seembryonen einer 2,0 M Konzentration ausgesetzt, waren die ÜR sehr stark<br />
verringert.<br />
In Versuchen zur Verträglichkeit steigender Saccharose-Konzentrationen (0,0 M<br />
bis 1,3 M) bei mit Glycerol <strong>kryokonservierten</strong> 8-Zell-Mauseembryonen, stellten<br />
TAKEDA et al. 1987 im Anschluss an das Ausverdünnen bei steigenden Sac-<br />
charose-Konzentrationen zunehmend Schäden an der Zona pellucida fest.<br />
Durch die Entwicklung des sogenannten, 1983 <strong>von</strong> LEIBO beschriebenen One-<br />
Step-Verfahrens, bei dem das Ausverdünnen bereits in der Gefrierpaillette statt-<br />
findet, konnte der Arbeits- und Zeitaufwand bei Auftauen deutlich verringert<br />
werden. Dazu werden außer dem Embryo und dem Kryoprotektivum auch zwei<br />
Säulen mit Saccharose aufgezogen, die sich beim anschließenden Auftauen in<br />
der Paillette vermischen und ein direktes Ausverdünnen ermöglichen. Für Rin-<br />
derembryonen untersuchten HOOGENKAMP (1984) sowie SCHUBERT (1984)<br />
18
die Glycerol/Saccharose-Verhältnisse und erzielten die besten ÜR bei einem<br />
Verhältnis <strong>von</strong> 1:2. In 1994 <strong>von</strong> CSEH et al. veröffentlichten Untersuchungen<br />
wurden die höchsten Trächtigkeitsraten nach Transfer (38%) bei einer Mi-<br />
schung <strong>von</strong> 1:9 Glycerol/Saccharose erreicht.<br />
Aber auch bei der ultraschnellen Kryokonservierung und der Vitrifikation wird<br />
Saccharose erfolgreich als nicht penetrierendes Kryoprotektivum zur Unterstüt-<br />
zung der Dehydrierung und als Zellschutz eingesetzt. Bei Untersuchungen zur<br />
ultraschnellen Tiefgefrierung <strong>von</strong> Mäuseembryonen setzten RAYOS et al.<br />
(1992a, b) eine Kombination <strong>von</strong> 0,5 M Saccharose und 3 M EG ein. THOMAS<br />
et al. (1989) verwendeten ebenfalls 0,5 M Saccharose, aber statt EG 3,5 M<br />
Glycerol. Die Ausverdünnung erfolgte unter Verwendung <strong>von</strong> Saccharose.<br />
KASAI et al. (1990) und KASAI (1996) beschrieben eine zur Vitrifikation geeig-<br />
nete Lösung, die als penetrierendes Protektivum Ethylenglycol, als nicht penet-<br />
rierende Schutzsubstanz 0,5 M Saccharose und als Zusatzstoff das Makromo-<br />
lekül Ficoll enthielt. Saccharose und Ficoll bewirken dabei, dass die EG-<br />
Konzentration in den Zellen reduziert wird und die Embryonen schnell schrump-<br />
fen. Das wiederum führt zu einer Verringerung der Toxizität der Lösung und da-<br />
her zu einer besseren Überlebenswahrscheinlichkeit der Zellen.<br />
2.5 Gefrierverfahren<br />
Die heute verwendeten Kryokonservierungsverfahren werden in das konventio-<br />
nelle, kontrollierte Tiefgefrierverfahren - auch als Standardgefrierverfahren be-<br />
zeichnet - das ultraschnelle Kryokonservieren und die Vitrifikation eingeteilt.<br />
Beim konventionellen Tiefgefrieren kommen die Embryonen vor ihrer Konser-<br />
vierung in eine, das Kryoprotektivum enthaltende Lösung und verbleiben in die-<br />
ser bis zur abgeschlossenen Equilibrierung. Im Gegensatz dazu wird den Emb-<br />
ryonen beim ultraschnellen Tieffrieren und bei der Vitrifikation keine Möglichkeit<br />
zur vollständigen Equilibrierung gegeben. Es handelt sich hierbei um eine so-<br />
genannte Nonequilibrium-Kryokonservierung. Vor der Kryokonservierung erfolgt<br />
eine Dehydrierung der Embryonen, indem sie für einen kurzen Moment in eine<br />
Mischung aus nicht penetrierenden und hochkonzentrierten penetrierenden<br />
Kryoprotektiva kommen (LEIBO, 1989).<br />
19
Zur Aufbewahrung der <strong>kryokonservierten</strong> Embryonen wurden in den Anfangs-<br />
zeiten der Kryokonservierung Glasampullen verwendet, die im Laufe der Zeit<br />
dann allerdings durch die heute gebräuchlichen Kunststoffpailletten ersetzt<br />
wurden. BIELANSKY et al. (1985) stellten in ihren Untersuchungen fest, dass<br />
es keine Unterschiede zwischen den Embryoüberlebensraten <strong>von</strong> Glasampul-<br />
len und Kunststoffpailletten gab. Die Kunststoffpailletten erwiesen sich aber in<br />
der Handhabung <strong>von</strong> Kryokonservierung, Lagerung und spätere Transfers als<br />
vorteilhafter und haben sich daher durchgesetzt (MASSIP et al., 1982).<br />
2.5.1 Standardgefrierverfahren<br />
Das Hauptmerkmal des Standardgefrierverfahrens ist, dass Embryonen und<br />
Kryoprotektiva nach festgelegten und kontrollierten Schemata auf Lagerungs-<br />
temperatur heruntergekühlt werden. Auf diese Weise wird versucht, irreparable<br />
Schäden durch unkontrollierte intrazelluläre Eiskristallbildung und Lösungsef-<br />
fekte zu verhindern, die zum Zelltod und damit zum Absterben des Embryos<br />
führen können. Deshalb werden spezielle, optimierte Kühlraten verwendet, die<br />
auf die unterschiedlichen Spezies und Entwicklungsstadien sowie verwendeten<br />
Kryoprotektiva genau zugeschnitten sind. Zur Steuerung der Abkühlraten wer-<br />
den programmierbare Temperaturregler verwendet, an denen die jeweils benö-<br />
tigten Kühlraten eingestellt werden können.<br />
Beim Standardgefrierverfahren wird bei einer Temperatur <strong>von</strong> -6°C oder -7°C<br />
manuell oder automatisch die Kristallisation der extrazellulären Medien ausge-<br />
löst. Durch diesen als „Seeding“ bezeichneten Vorgang wird die Bildung kleiner<br />
intrazellulärer Eiskristalle unterstützt und es soll durch diesen Vorgang ebenso<br />
verhindert werden, dass es zu einer für den Embryo schädlichen Unterkühlung,<br />
dem Supercooling, kommt. Häufig wird die Temperatur im Anschluss an das<br />
Seeding noch für einige Minuten auf Seeding-Temperatur gehalten, bevor sie<br />
mit definierter langsamer Kühlrate bis auf etwas -32°C weiter abgesenkt und<br />
erneut für einige Minuten dort gehalten wird. Im letzten Schritt werden die Zel-<br />
len durch schnelles Einfrieren, welches in der Regel durch direktes Umsetzen in<br />
LN2 erfolgt, auf die Lagerungstemperatur <strong>von</strong> -196°C gebracht.<br />
20
Würde kein manuelles, oder das durch neuere Technik ermöglichte, automati-<br />
sche Seeding erfolgen, wäre eine willkürliche, spontane Kristallbildung der Me-<br />
dien die Folge. In Abhängigkeit vom verwendetem Kryoprotektivum tritt diese<br />
spontane Eiskristallbildung ab etwa -10°C im extrazellulären und bei etwa -35°C<br />
bis -45°C im intrazellulären Raum ein (MAZUR, 1970; BANK, 1973; LEIBO et<br />
al., 1978; LEHN-JENSEN & RALL, 1983; RALL & POLGE, 1984; TONER et al.,<br />
1991). Im Zuge dieser spontanen Kristallisation innerhalb der Zellen und des<br />
Mediums kommt es zu einer Wärmefreisetzung und damit zu einem kurzfristi-<br />
gen Temperaturanstieg. Die dabei entstehenden intrazellulären Eiskristalle<br />
würde auf Grund ihrer Größe unweigerlich zum Tod der Embryonen führen<br />
(WILLADSEN, 1980; PAVEL, 1985; SEIDEL, 1989; NIEMANN, 1991; STREI-<br />
CHER, 1998; SEIBT, 2003).<br />
SOMMERFELD (1997) war es möglich, eine Abhängigkeit <strong>von</strong> Seeding-<br />
Temperatur und Kryoprotektivums-Konzentration festzustellen. Nach einer Er-<br />
höhung der Ethylenglycol-Konzentration auf 3,6 M sank die Gefriertemperatur<br />
auf -11°C ab. Wurde die Temperatur erhöht, konnte die Kristallisation nicht auf-<br />
rechterhalten werden.<br />
Der Umstieg <strong>von</strong> Glasampullen auf Kunststoffpailletten hatte auch für das er-<br />
folgreiche Seeding Vorteile. Wegen des geringeren Paillettendurchmessers und<br />
die dünnere Wand der Kunststoffpailletten ist das manuelle Seeding deutlich<br />
schneller und präziser möglich, wodurch die Überlebenswahrscheinlichkeit der<br />
Embryonen steigt (NIEMANN, 1983).<br />
Um für den Embryo unnötigen Stress zu vermeiden, sollte der Kristallisations-<br />
kern nicht direkt an der den Embryo enthaltenden Säule gesetzt werden, son-<br />
dern es sollte dafür eine, durch eine Luftblase getrennte, zweite Mediumsäule<br />
gewählt werden (DE PAZ et al., 1994).<br />
Das Herunterkühlen auf Seeding-Temperatur kann mit unterschiedlichen Kühl-<br />
raten erfolgen. Je nach Spezies werden die Kühlraten eingestellt. Bei humanen<br />
Embryonen wird häufig eine Kühlrate <strong>von</strong> 2°C/min gewählt. Mäuseembryonen<br />
hingegen können offensichtlich auch ohne nachteilige Effekte auf die spätere<br />
Vitalität direkt in Seeding-Temperaturen eingesetzt werden. Arbeitstechnisch<br />
bedeutet dieses eine deutliche Erleichterung, da die Dauer des Kryokonservie-<br />
rungsprogramms verkürzt werden kann (WILLADSEN, 1980; SCHNEIDER &<br />
MAZUR, 1984; PAVEL, 1985).<br />
21
Die Unterscheidung zwischen dem langsamen und dem schnellen Verfahren<br />
definiert sich in den Kühlraten im Anschluss an das Seeding.<br />
2.5.2 Langsames Kryokonservieren<br />
Das Kennzeichen der langsamen Konservierung sind die Kühlraten <strong>von</strong><br />
0,1°C/min bis 0,3°C/min, mit der die Temperatur auf -60 bis -120°C herabge-<br />
kühlt wird (LEIBO et al., 1974; FALGE et al., 1982; NIEMANN, 1983; LEHN-<br />
JENSEN, 1984).<br />
WHITTINGHAM et al. (1972) sowie WILMUT (1972) gelang es erstmals auf<br />
diese Weise ein Überleben <strong>von</strong> Mauseembryonen zu erreichen.<br />
Diese niedrigen Kühlraten wurden gewählt, damit den Zellen die Möglichkeit zur<br />
Dehydrierung und osmotischen Equilibrierung gegeben ist. Durch die beinahe<br />
vollständige Dehydrierung der Zellen ist es möglich, die unerwünschte intrazel-<br />
luläre Kristallisation zu umgehen (MAZUR, 1966; MAZUR & SCHNEIDER,<br />
1986). Die Rate der Auftaugeschwindigkeit für dieses Verfahren liegt bei<br />
2°C/min bis 10°C/min (NIEMANN, 1991).<br />
Bei graphischer Darstellung <strong>von</strong> Kühlrate und Überlebensrate zeigt sich das<br />
Bild einer Parabel (Abb. 1). Mit steigender Kühlrate steigt auch die Überlebens-<br />
rate (ÜR). Bei einer mittleren Kühlrate erreicht die ÜR ihr Maximum, um an-<br />
schließend wieder abzusinken. Als optimalste Kühlrate wird eine Rate angese-<br />
hen, die langsam genug ist, der intrazellulären Eisbildung entgegenzuwirken,<br />
aber wiederum schnell genug ist damit die Zellen nicht länger als unbedingt<br />
notwendig den Lösungseffekten ausgesetzt sind (MAZUR, 1970, 1980)<br />
22
Überlebensrate (%)<br />
Kühlrate (°C/min)<br />
Abb. 1: Abhängigkeit der Überlebensrate <strong>von</strong> der Kühlrate<br />
2.5.3 Schnelles Kryokonservieren<br />
Mit dem schnellen oder auch 2-stufigen Kryokonservierungsverfahren ist eine<br />
Methode entwickelt worden, die deutlich schneller und so für die Routine we-<br />
sentlich praktikabler ist.<br />
Als erste konnten WOOD & FARRANT 1980 <strong>von</strong> erfolgreichen Versuchen mit<br />
Mäuseembryonen berichten, die eine langsame Kühlung auf -20°C bzw. -25°C<br />
und eine daran direkt anschließende Überführung in flüssigen Stickstoff (LN2)<br />
überlebt hatten.<br />
In Versuchen mit in DMSO <strong>kryokonservierten</strong> Rinderblastocysten stellen LEHN-<br />
JENSEN & GREVE 1980 fest, dass es keinen Unterschied machte, ob die Emb-<br />
ryonen nach dem langsamen oder dem schnellen Tiefgefrierverfahren eingefro-<br />
ren wurden. Nach NIEMANN (1982) erklärt sich das dadurch, dass die Embryo-<br />
nen noch weiterhin die Möglichkeit haben, ihr Zellwasser in das noch nicht<br />
komplett gefrorene, sie umgebene extrazelluläre Medium abzugeben. Bei einer<br />
Temperatur <strong>von</strong> -42°C sind erst ungefähr 74% der Lösung kristallisiert. Schließt<br />
sich hier eine sehr schnelle Temperatursenkung auf bis -150°C an, führt das zu<br />
einer Viskositätszunahme der Restflüssigkeit. Weitere Eiskristallbildungen sind<br />
dann nicht mehr möglich und die Restflüssigkeit vitrifiziert (RALL, 1981; RALL<br />
et al., 1984).<br />
23
Diverse Untersuchungen beschäftigten sich damit, die optimale Temperatur<br />
zum Umsetzen zu ermitteln. Dabei zeigte sich, dass der beste Umsetztempera-<br />
turbereich in LN2 offensichtlich zwischen -30°C und -35°C liegt (BILTON, 1980;<br />
LEHN-JENSEN & GREVE, 1982; FARRANT et al., 1985; SCHIEWE et al.,<br />
1985).<br />
MASSIP et al. (1987) sowie NIBART & HUMBLOT (1997) konnten <strong>von</strong> guten<br />
Trächtigkeitsraten berichten, nachdem sie die Embryonen bei -25°C umgesetzt<br />
hatten. Als Kryoprotektivum verwendeten sie Glycerol und Saccharose und e-<br />
quilibrierten die Embryonen bei Raumtemperatur. Durch die Verwendung <strong>von</strong><br />
Saccharose dehydrieren die Embryonen soweit, dass es möglich ist, das Küh-<br />
len auch schon bei höheren Temperaturen zu beenden.<br />
MAZUR (1990) sah die anschließende Auftaugeschwindigkeit als Vorausset-<br />
zung für ein Überleben <strong>von</strong> bei -20°C bis -40°C umgesetzten Embryonen an.<br />
Nur wenn die Auftaurate schnell genug ist, um eine Rekristallisation zu verhin-<br />
dern, haben die Embryonen eine Überlebenschance.<br />
2.5.4 Ultraschnelles Kryokonservieren<br />
Bei diesem Verfahren werden die Embryonen direkt in LN2 getaucht. Dabei bil-<br />
den sich kleinere intra- und extrazelluläre Eiskristalle. Als verwendete Gefrier-<br />
schutzsubstanzen kommen recht hoch dosierte penetrierende (2,0 M bis 3,5 M)<br />
und nicht penetrierende (0,2 M bis 0,5 M) Kryoprotektiva zum Einsatz (NIE-<br />
MANN, 1991b). Die nicht penetrierenden Kryoprotektiva, wie zum Beispiel Sac-<br />
charose, bewirken, dass die Embryonen bereits vor dem Tiefgefrieren relativ<br />
weit dehydrieren und dadurch das Risiko intrazellulärer Eisbildung sehr stark<br />
reduziert wird (MAZUR, 1990).<br />
Zu Beginn der Entwicklung des ultraschnellen Tiefgefrierens war es nur möglich<br />
Mäuseembryonen tiefzugefrieren. Inzwischen ist es aber auch möglich weitere<br />
Spezies nach diesem Verfahren zu konservieren.<br />
Aber auch die Wahl des penetrierenden Kryoprotektivums hat bei diesem Ver-<br />
fahren offensichtlich Auswirkungen auf die Überlebensraten der konservierten<br />
Embryonen. So untersuchten GUTIERREZ et al. (1993) den Einfluss <strong>von</strong> Glyce-<br />
rol, EG und Propandiol in der Konzentration <strong>von</strong> 3,0 M in Verbindung mit jeweils<br />
24
0,25 M Saccharose auf die Überlebensrate <strong>von</strong> Mäusemorulae. Dabei stellte sie<br />
signifikante Unterschiede zwischen Glycerol (76,1%) und EG (79,5%) im Ver-<br />
gleich zu Propandiol mit 43,6% in vitro-Weiterentwicklungsrate fest.<br />
NOWSHARI & BREM (1998a) verglichen in ihren Versuchen mit expandierten<br />
Mäuseembryonen die Entwicklungsraten bei der ausschließlichen Verwendung<br />
<strong>von</strong> EG bzw. Propandiol in unterschiedlich hohen Konzentrationen. Es zeigte<br />
sich, dass eine Konzentration <strong>von</strong> 7,0 M den effektivsten Schutz bietet und dass<br />
die Schlupfrate nach Verwendung <strong>von</strong> EG höher lag als nach Propandiolver-<br />
wendung (84% zu 78%).<br />
In wie weit die Equilibrierungsdauer Einfluss auf die Entwicklungsraten hat, un-<br />
tersuchten RAYOS et al. (1992b). Sie ermittelten die optimalste Zeitdauer für in<br />
3,0 M Ethylenglycol und 0,25 M Saccharose equilibrierte Mäuseembryonen. 10<br />
Minuten führten zu den höchsten in vitro-Entwicklungsraten, während bei länge-<br />
ren Zeitspannen <strong>von</strong> 20 bzw. 30 Minuten die Entwicklungsraten wieder absan-<br />
ken.<br />
LEIBO (1989) erklärte das damit, dass es durch die längere Equilibrierung zu<br />
einer erhöhten intrazellulären EG-Konzentration kommt, die beim Ausverdün-<br />
nen des Kryoprotektivums durch das schnelle Einströmen <strong>von</strong> Wasser zur os-<br />
motischen Zellschädigung führt.<br />
2.5.5 Vitrifikation<br />
Ebenso wie bei dem ultraschnellen Tiefgefrieren erfolgt auch bei der Vitrifikation<br />
ein direktes Umsetzung in LN2.<br />
Bei der Vitrifikation wandelt sich die hochkonzentrierte Kryoprotektivums-<br />
Lösung durch sehr schnelle Kühlraten <strong>von</strong> der flüssigen Phase in einen stabi-<br />
len, glasartigen Zustand. Zunächst wird sie bei diesem Prozess zunehmend<br />
visköser, bevor sie schließlich ganz erstarrt.<br />
Ist die Vitrifikation korrekt verlaufen, kommt es zu keiner Eiskristallbildung im<br />
Vitrifikationsmedium und auch im Anschluss an die Umsetzung in flüssigen<br />
Stickstoff bleibt das Medium klar und durchsichtig. Da die Lösung beim Gefrie-<br />
ren nicht durch die Bildung <strong>von</strong> Eiskristallen aufkonzentriert wird, können neben<br />
den Schäden durch intrazelluläres Gefrieren auch Schäden durch Lösungsef-<br />
25
fekte umgangen werden (FAHY et al., 1984; FRIEDLER et al., 1988; NIEMANN,<br />
1991a; DOBRINSKY, 1996; STREICHER, 1998).<br />
Im Gegensatz zu den anderen Kryokonservierungsverfahren, ist bei der Vitrifi-<br />
kation keine programmierbare Gefriereinheit zwingend notwendig, da durch das<br />
direkte Eintauchen in LN2 die sehr schnelle notwendige Kühlrate <strong>von</strong> bis zu<br />
2000°C/min erreicht wird. Allerdings haben gesteuerte Geräte eine sehr viel ge-<br />
nauere Abkühlrate und eine höherer Abkühlleistung <strong>von</strong> bis zu 130000°C/Min,<br />
was wiederum den Einsatz der hochtoxischen Gefrierschutzmittel auf ein Mini-<br />
mum reduzieren kann (Vitmaster).<br />
Denn ein großes Problem stellt bei dem Verfahren der Vitrifikation die Toxizität<br />
der sehr hoch konzentrierten Kryoprotektiva dar, die sowohl während der Equi-<br />
librierung als auch beim Ausverdünnen während des Auftauprozesses bei<br />
Raumtemperatur starke Schäden an den Embryonen verursachen können<br />
(FRIEDLER et al., 1988; DE LEEUW et al., 1991; ISHIMORI et al., 1992; RALL,<br />
1992).<br />
Von entscheidender Bedeutung für eine gelungene Vitrifikation ist es, diejenige<br />
Konzentration an Protektiva zu finden, die maximalen Kryoschutz bei minimalen<br />
toxischen Auswirkungen ermöglicht. Aus diesem Grunde hat es sich als positiv<br />
erwiesen, Mischungen <strong>von</strong> verschiedenen Kryoprotektiva zu verwenden, da die<br />
vitrifizierenden, aber unter Umständen sehr toxischen Eigenschaften des einen<br />
Kryoprotektivums mit den weniger toxischen Eigenschaften eines anderen Kry-<br />
oprotektivums ausgeglichen werden können (MASSIP et al., 1987).<br />
RALL & FAHY waren 1985 die ersten, die <strong>von</strong> einer erfolgreichen Vitrifikation<br />
an Mäuseembryonen berichteten. Als Vitrifikationslösung verwendeten sie eine<br />
Mischung aus den Komponenten DMSO, Acetamid, Propandiol sowie Polyethy-<br />
lenglycol und konnten nach einer 48-stündigen in vitro-Kultivierung eine Ent-<br />
wicklungsrate <strong>von</strong> 87,8% vermerken.<br />
Zum Gelingen einer erfolgreichen Vitrifikation tragen, neben der Kombination<br />
der Kryoprotektiva, entscheidend die Equilibrierungsdauer der Embryonen in<br />
der Vitrifikationslösung und die Temperatur bei der die Equilibrierung stattfindet<br />
bei. In gewissem Masse lässt sich die Toxizität beeinflussen, indem man die<br />
Equilibrierungstemperatur und auch die Verweilzeit der Embryonen in der Vitri-<br />
fikationslösung auf ein Minimum reduziert.<br />
26
Deshalb kommen die Embryonen in einem ersten Schritt zunächst in eine nied-<br />
riger konzentrierte Lösung zum Equilibrieren und anschließend in einem zwei-<br />
ten Schritt für einen sehr kurzen Moment (wenige Sekunden bis etwa eine hal-<br />
be Minute) bei geringerer Temperatur (4°C) in die eigentliche, hochkonzentrier-<br />
te Vitrifikationslösung (FRIEDLER et al., 1988; NIEMANN & MEINECKE, 1993).<br />
Saccharose wurde erstmals durch KASAI et al. 1990 als Vitrifikationslösungs-<br />
Bestandteil verwendet. Sie benutzten eine Mischung aus 40% Ethylenglycol,<br />
30% Ficoll und 0,5 M Saccharose. In seiner Eigenschaft als schnell penetrie-<br />
rendes Kryoprotektivum gelangt EG bei der Equilibrierung rasch in ausreichen-<br />
der Konzentration in die Zellen und auch beim Ausverdünnen ist EG in der La-<br />
ge, die Zellen schnell wieder zu verlassen. Das bedeutet, dass die Toxizität<br />
deutlich gesenkt werden kann, was wiederum dazuführt, dass höhere Überle-<br />
bensraten erreicht werden.<br />
In den Versuchen <strong>von</strong> KASAI et al. (1990) erfolgte die Embryonenequilibrierung<br />
bei Raumtemperatur in einem Schritt <strong>von</strong> zwei bzw. fünf Minuten. Die Entwick-<br />
lungsraten zu expandierten Blastocysten erreichten dabei Werte <strong>von</strong> bis zu 97<br />
bzw. 98%.<br />
2.6 Auftauen<br />
Während zum Einfrier- und Gefriervorgang die drei Phasen Vorbereitungspha-<br />
se, Seeding und Gefrierphase sowie im weiteren Sinne noch die beiden Phasen<br />
Schädigungsprozesse und Lagerungsphase gehören, ist der Auftauvorgang<br />
selber und die Gefrierschutzmittelausverdünnung dem Prozess des Auftauvor-<br />
ganges zuzuordnen.<br />
Der Auftaurate kommt für die spätere Vitalität der Embryonen eine ebenso gro-<br />
ße Bedeutung zu wie der Kühlrate.<br />
WHITTINGHAM et al. (1972) haben Mäuseembryonen mit -0,3°C/min auf -78°C<br />
bis -269°C nach dem langsamen Verfahren eingefroren und tauten sie an-<br />
schließend mit Raten <strong>von</strong> 4, 25, 215, 450°C/min wieder auf. Die besten Überle-<br />
bensraten erzielten diejenigen Embryonen, die mit den Auftauraten <strong>von</strong> 4°C/min<br />
bzw. 25°C/min aufgetaut worden waren.<br />
27
Vergleichbare Ergebnisse erhielten WILMUT (1972) aus Untersuchungen mit<br />
Mausembryonen und WILLADSEN et al. (1976) nach Versuchen mit Schafemb-<br />
ryonen. LEIBO & MAZUR (1978) stellten fest, dass langsam eingefrorene Emb-<br />
ryonen auch sehr langsam wieder aufgetaut werden müssen, um eine möglichst<br />
große <strong>Überlebensfähigkeit</strong> der Embryonen zu erreichen. Das erklärt auch, wa-<br />
rum schnell kryokonservierte, ultraschnell tiefgefrorene und Embryonen nach<br />
Vitrifikation Auftauraten <strong>von</strong> über 300°C/min benötigen. Bei zu langsamen Auf-<br />
tauraten käme es andernfalls zur intrazellulären Kristallisation und damit zum<br />
Zelltod.<br />
RALL & POLGE führten 1984 Untersuchungen an 8-Zell-Mauseembryonen<br />
durch. Sie equilibrierten die Embryonen in 1,5 M Glycerol und tauten sie nach<br />
vorangegangenem Einfrieren mit unterschiedlichen Raten wieder auf. Dabei<br />
überlebten die Embryonen, die langsam auf -20°C bis -40°C heruntergekühlt,<br />
anschließend direkt in LN2 überführt und mit 2°C/min aufgetaut wurden eine<br />
48-stündige in vitro-Kultivierung nur zu 4 bis 25%. Bei denjenigen Embryonen<br />
aber, die ebenfalls langsam auf -25°C heruntergekühlt wurden, um mit<br />
500°C/min schnell wieder aufgetaut zu werden, überlebten 74% der Embryonen<br />
die in vitro-Kultivierung.<br />
Eine Erklärung für die Abhängigkeit der Überlebensrate <strong>von</strong> Kühl- und Auftaura-<br />
te liegt in der Fähigkeit der Eiskristalle zur Rekristallisation. Beim schnellen und<br />
ultraschnellen Tiefgefrieren bilden sich viele kleine Eiskristalle, die eine geringe<br />
Oberflächenenergie besitzen und aus diesem Grunde thermisch instabil sind.<br />
Diese verschmelzen beim langsamen Auftauen in wenige aber größere und da-<br />
durch schädigende Eiskristalle. Erfolgt das Auftauen aber ausreichend schnell,<br />
schmelzen die kleinen Kristalle, bevor sie untereinander verschmelzen können<br />
(MAZUR, 1965; BANK, 1973; RALL et al., 1980).<br />
Zum schnellen Auftauen werden die eingefrorenen Pailletten in der Regel in ein<br />
warmes Wasserbad getaucht. ELSDEN et al. (1982) tauten Rinderembryonen<br />
im 25°C bzw. 37°C warmen Wasserbad auf und verglichen anschließend die<br />
Trächtigkeitsraten im Anschluss an einen Transfer dieser Embryonen. Die<br />
Trächtigkeitsraten der bei 37°C aufgetauten Embryonen lagen mit 36,5 % über<br />
den Resultaten der bei 25°C aufgetauten Embryonen (23,5%). 1990 konservier-<br />
ten SEIDEL et al. Rinderembryonen mit einem Kryoprotektivum, dem sie zu-<br />
sätzlich ein Makromolekül zugesetzt hatten. Embryonen, die vor dem Auftauen<br />
28
im Wasserbad sechs Sekunden an der Luft angetaut wurden, ergaben bessere<br />
Trächtigkeitsraten als die Embryonen, die ausschließlich im Wasserbad aufge-<br />
taut worden waren.<br />
WHITTINGHAM berichtete 1981, dass nach Kryokonservierung <strong>von</strong> 8-Zell-<br />
Mauseembryonen und einem schnellen Auftauen die besten Ergebnisse erzielt<br />
werden, wenn beim Einfrieren das langsame Kühlen bei -40°C durch Umsetzen<br />
in LN2 gestoppt wird.<br />
2.7 Ausverdünnungsmethoden<br />
Nahezu alle Kryoprotektiva wirken bei wärmeren Temperaturen toxisch auf den<br />
Embryo und müssen aus diesem Grunde vor einer in vitro-Kultivierung oder ei-<br />
nem Transfer möglichst vollständig wieder aus den Zellen entfernt werden. Je<br />
nach verwendetem Kryoprotektivum und Equilibrierungsdauer enthalten die<br />
aufgetauten embryonalen Zellen höhere Konzentrationen an Kryoprotektiva.<br />
Kommen die Zellen aus dem Gefrierschutzmedium in physiologische Medien<br />
oder Kulturmedien zurück, schwellen sie wegen des osmotischen Gradienten<br />
nach Wassereinstrom an. Versuche zu Überlebensrate und maximal tolerierba-<br />
re Volumenzunahme <strong>von</strong> Mausembryonen ergaben, dass Ausverdünnungsver-<br />
fahren gewählt werden sollten, bei denen das Embryonenvolumen zwischen<br />
50% und 200% des isotonischen Volumens liegt (MAZUR & SCHNEIDER,<br />
1986).<br />
2.7.1 Schrittweises Ausverdünnen und Ausverdünnen mit nicht<br />
penetrierenden Kryoprotektiva<br />
Um übermäßiges Anschwellen zu vermeiden kann auf zwei unterschiedliche<br />
Verfahren ausverdünnt werden. Die erste Variante ist das schrittweise Ausver-<br />
dünnen. Dabei reduziert man die den Embryo umgebende extrazelluläre Kon-<br />
zentration des Kryoprotektivums immer weiter indem der Embryo fortlaufend in<br />
Lösungen mit absteigender Konzentration des Kryoprotektivums umgesetzt<br />
29
wird. So kann das Anschwellen des Embryonen in einem, für die Zellen tolerier-<br />
baren Rahmen gehalten werden.<br />
Ein anderes Verfahren verhindert das Überschreiten des isotonischen Volu-<br />
mens, indem zum Ausverdünnen nicht penetrierende Kryoprotektiva verwendet<br />
werden. Durch die nicht penetrierenden Stoffe wird die extrazelluläre Osmolari-<br />
tät konstant gehalten. Das intrazelluläre Kryoprotektivum kann aus den Zellen<br />
herausströmen, ohne dass es zu einem zerstörenden Anschwellen des Zellvo-<br />
lumens kommt. Hat auf diese Weise genügend Kryoprotektivum die Zellen ver-<br />
lassen, kann der Embryo, ohne weitere Schäden durch übermäßiges Anschwel-<br />
len zu nehmen, in isotonisches physiologisches (Kultur-)Medium verbracht wer-<br />
den (LEIBO & MAZUR, 1978; MAZUR, 1985).<br />
Das Ausverdünnen mit nicht penetrierenden Kryoprotektiva wie zum Beispiel<br />
Saccharose bietet zudem die Möglichkeit zu kontrollieren, ob der Embryo die<br />
Kryokonservierung überlebt hat.<br />
Ein vitaler Embryo schwillt in einer Saccharose-Lösung nicht übermäßig stark<br />
an, schrumpf dafür aber fortlaufend, solange das Kryoprotektivum aus dem<br />
Embryo herausdiffundiert. Dieses anfängliche Schrumpfen und anschließende<br />
Anschwellen ist ein Zeichen dafür, dass die Funktionen der Zellmembranen<br />
noch intakt sind (SCHNEIDER & MAZUR, 1984).<br />
2.7.2 One-Step-Ausverdünnung<br />
In diversen Untersuchungen konnte nachgewiesen werden, dass das penetrie-<br />
rende Kryoprotektivum Glycerin mit Hilfe des nicht penetrierenden Kryoprotekti-<br />
vum Saccharose auch in einem Schritt ausverdünnt werden kann. Die beste<br />
Überlebensrate <strong>von</strong> Embryonen wurde bei Konzentrationen <strong>von</strong> 1 M Saccharo-<br />
se erzielt. Mit Konzentrationen, die kleiner als 0,8 M Saccharose waren, konn-<br />
ten hingegen keine zufriedenstellenden Überlebensraten mehr erreicht werden<br />
(MERRY et al., 1983; HERNANDEZ-LEDEZMA et al., 1988b; DEL CAMPO et<br />
al., 1990; SUZUKI et al., 1990).<br />
BIELANSKY et al. (1985) untersuchten, inwieweit sich die Überlebensraten <strong>von</strong><br />
Rinderembryonen nach Ausverdünnen in einem Schritt mit Saccharose oder in<br />
30
mehreren Schritten ohne Saccharose <strong>von</strong> einander unterschieden. Sie konsta-<br />
tierten, dass die Überlebensrate bei der Ein-Schritt-Methode höher war.<br />
MAPLETOFT et al. (1987) verglichen die Auswirkungen der Ein-Schritt-<br />
Methode mit dem schrittweisen Ausverdünnen mit Saccharose bei Mäuseemb-<br />
ryonen. LANDSVERK et al. (1992) und ARRESEIGOR et al. (1998) untersuch-<br />
ten die Auswirkungen dieser beiden Methoden auf Rinderembryonen. Dabei<br />
stellten sie fest, dass die zeitaufwendigere Methode der schrittweisen Ausver-<br />
dünnung in mehreren Schritten keinerlei Vorteile gegenüber der One-Step-<br />
Methode aufwies.<br />
Eine erneute Vereinfachung des Ausverdünnens in einem Schritt ist die <strong>von</strong><br />
LEIBO (1983) und RENARD et al. (1983) entwickelte One-Step-Methode. Bei<br />
diesem Verfahren wird der in Glycerol kryokonservierte Embryo vor dem Trans-<br />
fer direkt in der Paillette ausverdünnt.<br />
CHUPIN et al. (1984) und HOOGENKAMP (1984) zogen dazu in der Gefrier-<br />
paillette vor dem Kryokonservieren drei unterschiedliche Säulen auf. Die mittle-<br />
re Säule enthielt in einer Glycerolmenge den Embryo. Diese Säule wurde durch<br />
jeweils eine Luftblase <strong>von</strong> den beiden äußeren Säulen getrennt. Diese äußeren<br />
Säulen bestanden entweder alle beide aus einer Saccharose-Lösung oder die<br />
eine Säule aus einer Saccharose-Lösung und die zweite Säule aus Medium.<br />
CHUPIN et al. (1984) stellten zwischen den Trächtigkeitsraten nach direktem<br />
Transfer bei den beiden verschiedenen Varianten keine signifikante Unter-<br />
schiede fest. HOOGENKAMP (1984) jedoch erreichte mit denjenigen Embryo-<br />
nen, deren Pailletten zwei Säulen Saccharose enthielten, höhere Trächtigkeits-<br />
raten (46%) als mit Embryonen, deren Pailletten eine Säule Medium und eine<br />
Säule Saccharose enthielten (21%).<br />
In Versuchen zu eventuellen Einflüssen der Verweildauer, mit denen die Emb-<br />
ryonen dem Gemisch beider Medien bei 37°C bis zum Transfer konfrontiert<br />
wurden, warteten PAVEL (1985) und NOHNER (1986) nach dem Auftauen und<br />
Schütteln der Pailletten, welches eine Durchmischung der Medien erreichen<br />
sollte, unterschiedlich lange. Bei PAVEL (1985) betrug die Trächtigkeitsrate<br />
nach einer weniger als zehnminütigen Wartezeit nur 18,5%. Nach einer Warte-<br />
zeit <strong>von</strong> mehr als 10 Minuten stieg die Trächtigkeitsrate auf 100% an. NOHNER<br />
(1986) dagegen stellte fest, dass die Trächtigkeitsrate mit zunehmender Warte-<br />
zeit nach dem Ausverdünnen sank. Erzielte er bei 5 bis 15 min Wartezeit noch<br />
31
eine Trächtigkeitsrate <strong>von</strong> 44,4%, waren es nach 30 bis 60 Minuten Wartezeit<br />
lediglich noch 28,6%.<br />
Trotz recht guter Trächtigkeitsergebnisse (<strong>von</strong> 25% bis über 45%) in Feldversu-<br />
chen hat sich die One-Step-Methode in der Routine des Embryonentransfers<br />
noch nicht flächendeckend durchsetzten können (VOELKEL & HU 1992a;<br />
STREICHER 1998).<br />
2.7.3 Direkte Ausverdünnung <strong>von</strong> Ethylenglycol<br />
Ethylenglycol hat im Vergleich zu Glycerol den Vorteil, dass es auch bei höhe-<br />
ren Temperaturen eine deutlich geringere toxische Wirkung auf Zellen besitzt.<br />
Zusätzlich diffundiert Ethylenglycol wesentlich schneller als Glycerol durch die<br />
Zellmembranen hindurch. VOELKEL & HU (1992a) untersuchten die in vitro-<br />
Überlebensraten <strong>von</strong> Rinderembryonen nach konventionellem Tiefgefrieren in<br />
Abhängigkeit <strong>von</strong> vier verschiedenen Kryoprotektiva bzw. direktem Ausverdün-<br />
nen nach Auftauen in PBS. Dabei zeigte sich, dass die Überlebensraten <strong>von</strong> in<br />
Ethylenglycol <strong>kryokonservierten</strong> Embryonen die Überlebensraten <strong>von</strong> in Glyce-<br />
rol, DMSO oder Propandiol tiefgekühlten Embryonen überstiegen.<br />
Diese Ergebnisse zeigten, dass das Zeit- und Materialaufwendige schrittweises<br />
Ausverdünnen der Kryoprotektiva nach dem Auftauen nicht unbedingt notwen-<br />
dig ist. JANOWITZ & GÖRLACH (1994) hielten fest, dass die Möglichkeit gege-<br />
ben ist, die Embryonen im Anschluss an das Auftauen ohne Schäden direkt zu<br />
übertragen.<br />
Untersuchungen <strong>von</strong> ARRESEIGOR et al. (1998) kamen zu dem Ergebnis,<br />
dass die Trächtigkeitsraten (TR) nach einem Direkttransfer <strong>von</strong> in Ethylenglycol<br />
<strong>kryokonservierten</strong> Rinderembryonen mit denen in Glycerol tiefgefrorenen<br />
Embryonen, die dann allerdings in drei Schritten ohne Saccharose oder einem<br />
Schritt mit Saccharose ausverdünnt worden waren (47,4% TR gegenüber 45,9<br />
bzw. 47,2% TR), zu vergleichen waren.<br />
Durch die guten Trächtigkeitsergebnisse und die stark vereinfachte Handha-<br />
bung ist dieses One-Step-Verfahren <strong>von</strong> der Routine in größerem Masse ange-<br />
nommen worden.<br />
32
2.8 Kultivierung <strong>von</strong> Embryonen<br />
Das Weiterentwicklungsvermögen <strong>von</strong> Embryonen unter Kulturbedingungen ist<br />
ein gutes Kriterium, um die Vitalität <strong>von</strong> Embryonen zu bewerten (SCHNEIDER<br />
et al., 1974; TROUNSON et al., 1978b; NIEMANN, 1980).<br />
POLGE & WILLADSEN (1978) wie auch LEHN-JENSEN et al. (1981) stellten<br />
nach einer 24-stündigen in vitro Kultivierung <strong>von</strong> <strong>kryokonservierten</strong> und an-<br />
schließend wieder aufgetauten Rinderembryonen bei 37°C keine signifikanten<br />
Unterschiede zwischen in vitro und in vivo Entwicklungsraten. TROUNSON et<br />
al. (1976a, 1978) und MASSIP et al. (1979) hingegen stellten fest, dass die<br />
Trächtigkeitsraten deutlich verringert waren, wurden die Embryonen vor dem<br />
Transfer einer in vitro Kultivierung ausgesetzt.<br />
Eine erste erfolgreiche Kultivierung <strong>von</strong> Mäuseembryonen gelang HAMMOND<br />
1949. Er kultivierte in seinen Versuchen Mäuseembryonen vom 8-Zellstadium<br />
bis zur Blastocyste in einem biologischen Medium, das aus den anorganischen<br />
Salzen NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2 und NaH2PO4 bestand. Desweiteren setzte er<br />
noch Glucose, 5 % Hühnereiweiß sowie Hühnereidotter zu.<br />
WHITTEN (1956) war der erste, der über einen erfolgreichen Einsatz eines<br />
chemischen Mediums berichtete. Bei dem Medium handelte es sich um eine<br />
Krebs-Ringer-Lösung, in der das Hühnereiweiß durch bovines Serumalbumin<br />
(BSA) ersetzt worden war. McLAREN & BIGGERS (1958) bewiesen, dass sich<br />
in diesem Medium kultivierte Embryonen nach einem Transfer auf Empfänger-<br />
tiere zu ganz normalen Föten weiterentwickelten.<br />
BRINSTER (1963) stellte fest, dass es nach Zusatz <strong>von</strong> Laktat und Pyruvat zum<br />
Kulturmedium sogar möglich ist Embryonen ab dem 2-Zellstadium zu kultivie-<br />
ren.<br />
Ebenfalls BRINSTER (1965) beschrieb, dass ein Wachstum <strong>von</strong> Mäuseembry-<br />
onen vom 2-Zellstadium bis zum Stadium Blastocyste in einem Bereich <strong>von</strong> 200<br />
bis 354 mOsmol und einem pH-Wert <strong>von</strong> 5,87 bis 7,78 möglich sei. Als opti-<br />
malste Bedingungen ermittelte er eine Osmolalität <strong>von</strong> 276 mOsmol und einen<br />
pH-Wert <strong>von</strong> 6,82.<br />
33
Für eine in vitro Kultivierung <strong>von</strong> Embryonen wird am häufigsten die Mikrotrop-<br />
fenmethode unter Öl angewandt. Dabei werden ein bis mehrere Mikrotropfen<br />
Kultivierungsmedium (ca. 50 bis 100 µl) in einer Petrischale platziert und mit<br />
Mineralöl überschichtet. Durch das Öl wird das Medium vor einer Verdunstung<br />
geschützt; ein Gasaustausch mit der umgebenden Gasphase ist weiterhin mög-<br />
lich (BRINSTER, 1963).<br />
Während einer in vitro Kultivierung müssen laufend die folgenden Parameter<br />
kontrolliert werden: Temperatur, Luftfeuchtegehalt und CO2-Gehalt in der Gas-<br />
phase. Als optimale Werte für eine Mäuse- und Kanincheneizellen-Kultivierung<br />
wurden <strong>von</strong> ALLISTON et al. (1965), ADAMS (1968) und BRINSTER (1969) ei-<br />
ne Temperatur <strong>von</strong> 37°C, eine nahezu 100 %ige rel. Luftfeuchte sowie ein CO2-<br />
Partialdruck <strong>von</strong> 5 % angesehen.<br />
2.9 Beurteilungsmöglichkeiten für Embryonen<br />
Es gibt die unterschiedlichsten Verfahren, um Embryonen in ihrem Erschei-<br />
nungsbild zu beurteilen. Die einfachste und häufigste Methode ist die morpho-<br />
logische Beurteilung, in der Regel unter zu Hilfenahme eines Mikroskopes. Wei-<br />
terhin sind verschiedene Arten der Anfärbung <strong>von</strong> Embryonen und Zellen ent-<br />
wickelt worden, durch die die Möglichkeit besteht auch morphologisch nicht<br />
sichtbare, aber die Qualität beeinflussende Kriterien, sichtbar zu machen.<br />
2.9.1 Morphologische Beurteilung<br />
Die morphologische Beurteilung ist die wahrscheinlich am wenigsten aufwendi-<br />
ge Methode Zellen und Zellkomplexe zu beurteilen. Eine Klassifizierung der<br />
Embryonenqualität erfolgt mit mikroskopischer Hilfe durch eine subjektive Beur-<br />
teilung in Anlehnung an die Verfahren <strong>von</strong> LINDNER & WRIGHT (1983) sowie<br />
KAUFFHOLDT & THAMM (1985).<br />
Die subjektive Beurteilung ist dabei der kritische Punkt in diesem Verfahren, da<br />
eine genügend große Erfahrung im Erkennen <strong>von</strong> guten und schlechten Emb-<br />
ryonen und deren verschiedener Stadien notwendig ist.<br />
34
Entscheidende Kriterien bei der Bewertung sind Faktoren wie die Unversehrt-<br />
heit der Zona pellucida, das Größenverhältnis der Blastomeren untereinander,<br />
die Anzahl und Kompaktheit der Blastomeren. Auch sollte ein Entwicklungssta-<br />
dium, das dem Zeitpunkt der Gewinnung entspricht, vorgefunden werden. Ist<br />
dieses nicht der Fall, sollten die Embryonen als retardiert und damit als ein ge-<br />
schädigter, nicht zu verwendender Embryo angesehen werden (MAURER, &<br />
HASEMANN, 1976; TROUNSON et al., 1976a/b; ELSDEN et al., 1978; BO-<br />
LAND et al., 1978).<br />
2.9.2 Beurteilung nach Fluoreszenzanfärbung mittels FDA<br />
Um eine Vitalitätsbestimmung <strong>von</strong> Embryonen mit Farbstoffen durchführen zu<br />
können, ist es notwendig, dass der verwendete Farbstoff eine exakte Beurtei-<br />
lung erlaubt und die Entwicklungsfähigkeit der Embryonen nicht verringert wird.<br />
Ein fluoreszierender Farbstoff der dieses gewährleisten soll ist Fluorescein-3`6`-<br />
diacetat, bekannt als FDA. Erste Berichte über die Verwendung <strong>von</strong> FDA zur<br />
Überprüfung der Zellvitalität wurden 1966 durch ROTMAN & PAPERMASTER<br />
veröffentlicht. Ende der siebziger Jahre beschrieben SCHILLING et al. die Mög-<br />
lichkeiten einer Bestimmung der Vitalität durch FDA (SCHILLING & DÖPKE,<br />
1978; SCHILLING et al., 1979; SCHILLING & SMIDT, 1979). Anhand des FDA-<br />
Verfahrens kann einerseits die Integrität der Plasmamembranen, andererseits<br />
auch eine positive zytoplasmatische Enzymaktivität nachgewiesen werden. Im<br />
Anschluss an eine relativ kurze Inkubationsdauer im Fluoreszenzfarbstoff wei-<br />
sen lebende Embryonen nach einer UV-Anregung eine leuchtende, hellgrüne<br />
Farbe auf. Tote Embryonen dagegen lassen keine Reaktionen mehr erkennen.<br />
Nach Meinung der zu diesem Thema veröffentlichten Berichte, besteht nach ei-<br />
ner Färbung keine Verringerung der in vitro-Weiterentwicklungsrate, verursacht<br />
durch Färbung und kurzfristige UV-Bestrahlung.<br />
35
2.9.3 Beurteilung nach Fluoreszenzanfärbung durch Hoechst A<br />
33342<br />
Hinter dem Namen Hoechst A 33342 steht der Fluoreszenzfarbstoff Benzimid,<br />
genauer 2`-[4Hydroxyphenyl]-5-[4-methyl-1-piperazinyl]-2,5´bi-1H-bizimidazole.<br />
Das Fluorochrome Hoechst A 33342 ist ein DNA-spezifischer Farbstoff, mit dem<br />
es möglich ist, das Chromatin in Oozyten und Embryonen sichtbar zu machen.<br />
Durch diese Färbemethode kann im Anschluss an eine morphologische Beurtei-<br />
lung eine Aussage über die Anzahl aktiver Kerne und damit die Vitalität der<br />
Embryonen gemacht werden (VIUFF et al., 1991). Bei UV-Bestrahlung werden<br />
mitotisch aktive Kerne als leuchtend hellblaue und scharf umrandete Komplexe<br />
erkennbar. Kerne ohne Aktivität sind nur undeutlich und ohne klare Konturen<br />
schwach erkennbar.<br />
36
3 Material und Methoden<br />
3.1 Tiermaterial<br />
Die vorliegenden Untersuchungen wurden unter Verwendung dreier verschie-<br />
dener Mäuseherkünfte durchgeführt:<br />
1. 24 weibliche Tiere entstammten der Linie C57/B6 (Black) aus der Zucht<br />
des Max-Planck-Instituts für experimentelle Medizin.<br />
2. 36 weibliche Tiere entstammten der Linie NMRI (Albino) aus der Zucht<br />
des Max-Planck-Instituts für experimentelle Medizin.<br />
3. 72 weibliche Tiere entstammten der Linie NMRI (Albino) aus institutseige-<br />
ner Zucht.<br />
3.2 Haltungsbedingungen<br />
Die Tiere wurden in einem 10 m 2 großen klimatisierten Raum gehalten, in dem<br />
mittels Heizung und Klimaanlage die Temperatur bei 22°C bis 25°C gehalten<br />
wurde. Durch einen Luftbefeuchter und offene Wasserwannen wurde eine rela-<br />
tive Luftfeuchte <strong>von</strong> 50 - 60 % erreicht. Das Lichtprogramm <strong>von</strong> je 12 Stunden<br />
Hell-/Dunkelphase wurde durch eine Zeitschaltuhr überwacht (Lichtphase <strong>von</strong><br />
7.00 bis 19.00 Uhr).<br />
Die für Versuchszwecke benötigten weiblichen Tiere wurden in Gruppen <strong>von</strong><br />
mindestens zwei bis maximal zehn Tieren in Polycarbonatkäfigen <strong>von</strong><br />
17×23×14 cm Größe (Typ II) bzw. 23×39×15 cm Größe (Typ III) mit Stahldraht-<br />
deckeln (Ebeco, Castrop-Rauxel) gehalten.<br />
Die männlichen Tiere wurden einzeln in entsprechenden Käfigen (17×23×14<br />
cm) gehalten.<br />
Mindestens einmal wöchentlich wurden alle Tiere in frisch gereinigte Käfige mit<br />
frischer Sägespäne-Einstreu umgesetzt.<br />
Als ad-libitum-Fütterung war ein pelletiertes Mäusealleinfutter (Tab. 1, ssniff<br />
Spezialdiäten GmbH, Soest) verfügbar. Trinkwasser erhielten die Tiere aus 25<br />
ml Plastikflaschen mit Tränkdeckel, die mindestens einmal wöchentlich ausge-<br />
tauscht wurden.<br />
37
Tab. 1: Zusammensetzung Mäusealleinfutter<br />
Inhaltsstoff % Zusatzstoffe Menge<br />
Rohprotein 19,00 Vit.A 15.000 IE/kg<br />
Rohfett 3,30 Vit.D3 1.000 IE/kg<br />
Rohfaser 4,90 Vit.E 100 IE/kg<br />
Rohasche 6,70 CU 12 mg/kg<br />
3.3 Medien<br />
Alle Chemikalien wurden, soweit in der Arbeit nicht anders ausgewiesen, <strong>von</strong><br />
der Firma Sigma-Aldrich, Steinheim, bezogen und waren zellkulturgetestet.<br />
3.3.1 Spülmedium<br />
Die zur Herstellung und anschließenden Aufbewahrung des Embryonenspül-<br />
mediums M2 benötigten Glasgefäße wurden vor ihrer Verwendung zuerst mit<br />
70 %igem Alkohol gereinigt und danach 5 x mit destilliertem Wasser aus- und<br />
abgespült und im Trockenschrank (BE 40, Memmert, Schwabach) bei 55°C ge-<br />
trocknet. Nach vollständiger Trocknung wurden sie mit Alufolie fest verschlos-<br />
sen und unter trockener Hitze im Sterilisator (U 50, Memmert, Schwabach) für<br />
mindestens 2h bei 200°C sterilisiert.<br />
Zur Herstellung des Spülmediums M2 wurden verschiede Anteile der Stammlö-<br />
sungen A, B, C, D, E (Tab. 2) und Reinstwasser (Ampuwa ® , Fresenius, Bad<br />
Homburg) verwendet.<br />
38
Tab. 2: Zusammensetzung der verwendeten Stammlösungen<br />
Stammlösung A<br />
(10-fach konzentriert) Komponente Menge g/100 ml<br />
Stammlösung B<br />
NaCl<br />
KCl<br />
KH2PO4<br />
MgSO4 × 7 H2O<br />
Natriumlactat<br />
Glucose<br />
Penicillin (10.000 IE/ml)<br />
Streptomycin (10.000 IE/ml)<br />
5,534<br />
0,356<br />
0,162<br />
0,293<br />
4,349<br />
1,000<br />
1 ml<br />
1 ml<br />
(10-fach konzentriert) Komponente Menge g/100 ml<br />
Stammlösung C<br />
NaHCO3<br />
Phenolrot<br />
2,101<br />
0,010<br />
(100-fach konzentriert) Komponente Menge g/100 ml<br />
Stammlösung D<br />
Natriumpyruvat 0,036<br />
(100-fach konzentriert) Komponente Menge g/100 ml<br />
Stammlösung E<br />
CaCl2 × 2 H2O 0,252<br />
(10-fach konzentrier) Komponente Menge g/100 ml<br />
HEPES<br />
Phenolrot<br />
5,958<br />
0,010<br />
Quelle: HOGAN et al., 1986; WHITTEN & BIGGERS, 1968; WHITTEN, 1971; WHITTINGHAM,<br />
1971<br />
39
Fertige Stammlösungen wurden unter der sterilen Werkbank (Mikrobiologische<br />
Sicherheitswerkbank Typ MRF, Steag Laminarflow-Prozeßtechnik, Pfullingen)<br />
in 100 ml-Flaschen mit einem Einmalfilter steril filtriert (Filtropur S 0,2 µm, Sar-<br />
stedt, Nümbrecht) und die ersten 5 ml der Filtrationen jeweils verworfen. An-<br />
schließend wurden die Stammlösungen in sterile 1 ml-Eppendorfgefäße (Ep-<br />
pendorf, Hamburg) pipettiert und bei -18°C im Gefrierschrank gelagert.<br />
Die Stammlösungen A, D und E hielten sich aufgetaut bei +4°C über einen Zeit-<br />
raum <strong>von</strong> drei Monaten, die Stammlösungen B und C jedoch nur eine Woche.<br />
Daraus ergab sich eine maximale Haltbarkeit des gebrauchsfertig angesetzten<br />
M2-Spülmediums <strong>von</strong> einer Woche bei +4°C.<br />
Den benötigten Stammlösungsanteilen entsprechend wurde das M2-Medium<br />
am Tag vor Gebrauch unter der sterilen Werkbank angesetzt und bis zur Ver-<br />
wendung bei +4°C aufbewahrt.<br />
Tab. 3: Zusammensetzung des Spülmediums M2<br />
Komponenten Menge je 50 ml M2<br />
Stammlösung A (5-fache Konzentration) 10,0 ml<br />
Stammlösung B (10-fache Konzentration) 0,80 ml<br />
Stammlösung C (100-fache Konzentration) 0,50 ml<br />
Stammlösung D (100-fache Konzentration) 0,50 ml<br />
Stammlösung E (10-fache Konzentration) 4,20 ml<br />
H2O (Ampuwa ® ) 34,0 ml<br />
BSA (Hitzeinaktiviert) 0,20 g<br />
Nach Ansetzten des Mediums wurde die Osmolalität ermittelt. Dabei soll die<br />
Osmolalität zwischen 270-302 mOsmol/kg -1 liegen (BOXBERGER, 2007).<br />
(Dieser Wert gibt bei Flüssigkeiten die Teilchenzahl der osmotisch aktiven Sub-<br />
stanzen pro Kilogramm Lösemittel an. Die Osmolalität, also das dynamische<br />
Gleichgewicht <strong>von</strong> Wasser und Salzen ist <strong>von</strong> entscheidender Bedeutung für<br />
die Aufrechterhaltung der Zellstruktur, die Anregung der Zellproliferation und<br />
muß daher möglichst genau eingehalten werden (BOXBERGER, 2007). Sie er-<br />
rechnet sich nach der Formel:<br />
X = Q × (a-b) × a (KOPF, 1988)<br />
40
wobei Q = Mediummenge (ml)<br />
a = gemessene Osmolalität (mOsmol/kg -1 )<br />
b = gewünschte Osmolalität (mOsmol/kg -1 )<br />
X = Mediummenge (ml), die zur Korrektur entnommen und verworfen werden<br />
muß und durch hochreines Wasser ersetzt wird.)<br />
Fertiges M2-Medium (HEPES-gepuffert) wurde unter dem Laminarflow in sterile<br />
Flaschen filtriert (Filtropur S 0,2 µm, Sarstedt, Nümbrecht), mit autoklavierten<br />
Gummistopfen und Parafilm (American National Can TM , Greenwich) versiegelt<br />
und im Kühlhaus bei +4°C bis zur Verwendung am nächsten Tag aufbewahrt.<br />
(HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinthansulfonsäure) besitzt eine gute Puf-<br />
ferkapazität, hat allerdings in höheren Konzentrationen zytotoxische Effekte und<br />
ist stark <strong>von</strong> der Temperatur abhängig (BOXBERGER, 2007))<br />
Vor der Verwendung wurde am Versuchstag mittels einer Glas-Elektrode (WTW<br />
pH-Elektrode SenTix 60, WTW, Weilheim i. OB) der pH-Wert des M2-Mediums<br />
gemessen (Digital-pH-Meter pH 525, WTW, Weilheim i.OB) und durch Zufü-<br />
gung <strong>von</strong> HCl bzw. NaOH auf pH 7,3 bis 7,4 eingestellt. Anschließend wurde<br />
das gebrauchsfertige Medium erneut in sterile 50ml-Glasflaschen filtriert, dann<br />
erst die BSA Komponente hinzugefügt und mit autoklavierten Gummistopfen<br />
und Parafilm verschlossen und im Wärmeschrank (Typ 85, Melag Brutschrank<br />
Incubat, Berlin) ohne CO2 Begasung auf 37°C erwärmt.<br />
3.3.2 Kulturmedium<br />
Zur Kultivierung der aufgetauten Embryonen wurde gebrauchsfertig bezogenes<br />
Universal <strong>IVF</strong> Medium mit Phenolrot (Medicult a/s, DK-Jyllinge, Fa. Stefan<br />
Gück) verwendet.<br />
41
Tab. 4: Zusammensetzung des Kulturmediums MediCult Universal <strong>IVF</strong> Medium<br />
Komponenten<br />
Earle’s Balanced Salts Solution (EBSS)<br />
Synthetic Serum Replacement (SSR ® ) (USA: ART Sup-<br />
plement)<br />
Human serum albumin (HSA)<br />
Glucose<br />
Sodium pyruvate<br />
Sodium bicarbonate<br />
Penicillin 50.000 IE/l<br />
Streptomycin 50 mg/l<br />
Phenolrot<br />
3.3.3 Kryoprotektivum<br />
(Quelle: Fa. MediCult; Jyllinge; DK)<br />
Um Gefrierschäden an den Embryonen so gering wie möglich zu halten, wurde<br />
ein Gefrierschutzmedium mit den Substanzen Ethylenglycol (EG) (Sigma-<br />
Aldrich, Steinheim) und Saccharose (Sigma-Aldrich, Steinheim) verwendet. E-<br />
thylenglycol, als sehr leicht penetrierendes Protektivum, wurde in einer Kon-<br />
zentration <strong>von</strong> 1,5 Mol, Saccharose, als nicht penetrierendes Protektivum, in<br />
der Konzentration <strong>von</strong> 0,25 Mol zugefügt.<br />
Die nötigen Mengen an EG und Saccharose wurden unter dem Laminarflow zu<br />
M2-Medium zugegeben, mit einem Magnetrührer (Heidolph, Schwabach) ge-<br />
löst, anschließend steril in Glasfläschen (20ml) filtriert (Filtropur S 0,2 µm, Sar-<br />
stedt, Nümbrecht) und mit autoklavierten Gummistopfen und Parafilm ver-<br />
schlossen.<br />
Die Haltbarkeit des Kryoprotektivum beträgt bei +4°C maximal eine Woche, es<br />
wurde aber vor jeder Verwendung neu angesetzt.<br />
Bis zum Gebrauch wurde das Medium bei Raumtemperatur (RT) gehalten.<br />
42
3.3.4 Auftaumedium<br />
Als jeweils frisch angesetztes Auftaumedium diente Universal <strong>IVF</strong> Medium (Me-<br />
diCult, DK-Jyllinge, Fa. Stefan Gück) versetzt mit 0,5 Mol Saccharose (Sigma-<br />
Aldrich, Steinheim).<br />
Die Menge an Saccharose wurde auf einer Feinwaage (2007 MP6, Sartorius,<br />
Göttingen) abgewogen und unter Rühren mit einem Magnetrührer in Universal<br />
<strong>IVF</strong> Medium gelöst. Das Auftaumedium wurde unter dem Laminarflow steril in<br />
20ml Mediumflaschen filtriert. Gleich im Anschluss an den Filtrationsprozess<br />
wurden 350µl Auftaumedium in die Mitte einer Center-Well Schale (60×15mm,<br />
Falcon, Heidelberg) pipettiert; diese wurden auf dem 37°C warmen Werktisch<br />
(Easy Bench, Varolab, Giessen) (Abb. 1) erwärmt.<br />
Abb. 2: Werktisch mit integriertem Wärmebereich (Varolab, Giessen) und CO2<br />
Kleininkubator C42 (Labotect)<br />
3.3.5 Überschichtungsöl für Kultivierung- und Waschdrops<br />
Als Überschichtungsöl für das verwendete Kulturmedium diente Mineral-Öl<br />
(Sigma-Aldrich, Steinheim). Auf diese Weise wurde vermieden, dass Mikro-<br />
Medium-Drops austrocknen. Weiterhin können Kontaminationen durch die Öl-<br />
barriere reduziert werden. Es erfolgte 24 Stunden vor der Verwendung des Öles<br />
eine Ölwaschung zur Equilibrierung des Öles mit dem Medium. Das hatte zur<br />
Folge, dass eventuell vorhandene Schadstoffe im Öl in das Medium ausgewa-<br />
schen wurden und gleichzeitig eine Anreicherung der fettlöslichen Vitamine aus<br />
dem Medium in das Öl erfolgte, so dass während der Kultivierungsphase die Vi-<br />
43
tamine und essentiellen Aminosäuren tatsächlich den Embryonen zur Verfü-<br />
gung standen. Dazu wurde ein steriles 50ml Falcon-Röhrchen (Sarstedt, Nüm-<br />
brecht) mit 20ml MediCult Universal <strong>IVF</strong> Medium und 30ml Mineral-Öl unter ste-<br />
rilen Bedingungen befüllt. Anschließendes behutsames Schwenken des Röhr-<br />
chens führte zu einer Vermischung beider Substanzen. Bis zum Gebrauch des<br />
Öles wurde das Röhrchen mit lockerem Deckel zur Equilibrierung und Entmi-<br />
schung der Phasen in den Brutschrank (C60, Labotect, Göttingen) bei 37°C, 6%<br />
CO2 und gesättigter Luftfeuchte (LF) gestellt.<br />
3.4 Behandlung der Embryonenspender<br />
Zur Embryonengewinnung wurden die Spendertiere hormonell einer Superovu-<br />
lation unterzogen. Dazu wurde den Weibchen im Alter <strong>von</strong> fünf bis 16 Wochen<br />
47 Stunden vor dem Zusammensetzten der männlichen und weiblichen Tiere<br />
zur Auslösung einer Superovulation 7,5 IE eCG (equine chorionic gonadotropin,<br />
Intergonan, Intervet, Unterschleißheim) intraperitoneal (ip) an der Linea alba zur<br />
Follikelstimulation injiziert (Abb. 2). 5,0 IE hCG (human chorionic gonadotropin,<br />
Ekluton, Intervet, Unterschleißheim) wurden direkt vor dem Zusammensetzen<br />
der Tiere ip injiziert.<br />
Zu Beginn des Versuches wurde 24 Spendertieren um 17.00 Uhr eCG und 47<br />
Stunden später um 16.00 Uhr hCG injiziert. Bei allen restlichen Tieren wurde<br />
die eCG-Gabe auf 15.00 Uhr und die hCG-Gabe auf 14.00 Uhr vorgezogen.<br />
Abb. 3: Ip-Injektion <strong>von</strong> eCG bzw. hCG<br />
44
Da nach EDWARDS & GATES (1959) die Ovulation ungefähr 12 Stunden nach<br />
Verabreichung des hCG erfolgt, wurden die Embryonenspender im direkten An-<br />
schluss an die ip Injektion <strong>von</strong> 5,0 IE hCG einzeln zu einem Bock im Alter <strong>von</strong><br />
drei bis elf Monaten zur Verpaarung gesetzt. Bei allen weiblichen Tieren kamen<br />
Böcke der NMRI-Linie aus MPI-Herkunft oder institutseigener Zucht zum Ein-<br />
satz. Die Verpaarung erfolgte in der anschließenden Nacht.<br />
Am folgenden Morgen konnte als Beweis für eine erfolgreiche Bedeckung bei<br />
den gedeckten Weibchen ein Ejakulationspfropf (Vaginal-Plaque, VP) gefunden<br />
werden. Für diese Kontrolle wurden die Spendertiere auf das Käfiggitter gesetzt<br />
und am Schwanz angehoben. Der VP zeichnete sich als weißlich-gelblicher,<br />
harter Pfropf im vorderen Abschnitt der Vagina ab (Abb. 3).<br />
1) 2)<br />
Abb. 4: Vaginal-Plaque: 1) positiv und 2) negativ am Morgen nach erfolgter Be-<br />
deckung<br />
Ein VP bildet sich etwa 20 bis 30 Minuten nach dem Deckakt, ist für ca. 12<br />
Stunden sichtbar und besteht aus Seminalplasma und abgeschilferten Zellen<br />
der Vaginalschleimhaut (HEINEKE & KLAUS, 1975). Da der Deckakt in der Re-<br />
gel in der zweiten Hälfte der Dunkelphase stattfindet, ist der VP bis zum nächs-<br />
ten Morgen zu erkennen. Beim vorliegenden Versuch fand die VP-Kontrolle und<br />
Markierung der 'VP+'-Tiere im Zeitraum <strong>von</strong> 8.00 bis 9.00 Uhr an dem auf die<br />
Verpaarung folgenden Morgen statt.<br />
Als Tag 1 der Embryonalentwicklung wurde der Tag gewertet, am dem der VP<br />
zu erkennen war (Tab. 5). Alle Tiere, sowohl VP+ also auch VP-, wurden bis zur<br />
Embryonenspülung drei Tage später in ihren gewohnten Gruppen gehalten, um<br />
für die Tiere keinen unnötigen Stress zu erzeugen.<br />
45
Tab. 5: Behandlungsschema zur Gewinnung <strong>von</strong> Mäuseembryonen<br />
Tag Behandlung<br />
-2 eCG<br />
-1 ―<br />
0 hCG + ♂<br />
Entwicklungsstadium der<br />
Embryonen<br />
Lokalisation der Embry-<br />
onen<br />
+1 VP- Kontrolle 1- Zeller Eileiterampulle<br />
+2 2- bis 4- Zeller Eileiter<br />
+3 8- Zeller bis frühe Morula Eileiter und Uterushorn<br />
+4 OP (Spülen) Morula bis Blastocyste Uterushorn<br />
3.5 Gewinnung der Embryonen<br />
In Abhängigkeit vom gewünschten Entwicklungszustand der Embryonen sind<br />
unterschiedliche Spülzeiten und -orte zu beachten (s. Tab. 5). Um eine hohe<br />
Überlebensrate der Embryonen nach dem Auftauen zu gewährleisten, sollten<br />
die Stadien späte Morula bis späte Blastocyste verwendet werden (TAO et al.,<br />
2001). Aus diesem Grund erfolgte die Embryonengewinnung am vierten Träch-<br />
tigkeitstag zwischen 10.00 und 12.00 Uhr.<br />
Die Tiere wurden durch zervikale Dislokation getötet (Abb. 4) und auf einer<br />
37°C warmen Wärmeplatte (MEDAX SP14, MEDAX Nagel GmbH, Kiel) in Rü-<br />
ckenlage positioniert. Das Operationsfeld wurde mit 70%igem Alkohol desinfi-<br />
ziert, auch um zu verhindern, dass Fellbestandteile in die Operationsöffnung<br />
gelangen (RAFFERTY, 1970).<br />
Durch einen quer zur Linea alba in Höhe der Kniegelenke verlaufenen Haut-<br />
schnitt wurde der Bauchraum geöffnet und durch manuelles Reißen großflächig<br />
eröffnet (Abb. 5).<br />
46
Abb. 5: Zervikale Dislokation<br />
Abb. 6: Eröffnete Bauchhöhle<br />
Darm und Bauchfett wurden seitlich verlagert, die beiden Uterushörner, als<br />
weißlich bis rötliche Stränge erkennbar, freipräpariert und mit einer zweiten ste-<br />
rilen Schere und sterilen Pinzette angehoben. Fettgewebe wurde vorsichtig ab-<br />
getrennt und die Uterushörner mit der Schere zwischen Ovidukt und Ovar, so-<br />
wie an der Bifurcatio uteri, entfernt. Anschließend wurden die Uterushörner in<br />
einer Petrischale (35×10mm, Greiner, Frickenhausen) in 2 ml frischem, sterilfilt-<br />
riertem Spülmedium M2 auf einer 37°C warmen Wärmeplatte (MEDAX Nagel<br />
GmbH, Kiel sowie HT 200, Minitüb, Landshut) gelagert.<br />
Direkt vor dem Spülprozeß wurden die Uterushörner zweimal in frischem M2-<br />
Medium gespült, um eventuell noch anhaftende Verunreinigungen zu entfernen.<br />
Der Eileiter wurde unter dem Stereomikroskop (M8, Wild, Heerebrugg, Wetzlar)<br />
47
ei 100- bis 200-facher Vergrößerung mit einer sterilen Pinzette fixiert und mit<br />
einer Skalpellklinge abgetrennt.<br />
Das Ausspülen der Embryonen erfolgte dann in einer Petrischale (35×10mm,<br />
Greiner, Frickenhausen) unter Kontrolle des Stereomikroskops auf der auf 37°C<br />
eingestellten Heizplatte bei 300-facher Vergrößerung. Dazu wurde das zu spü-<br />
lende Uterushorn mit einer Pinzette fixiert und nach Einführung der, auf eine 2-<br />
ml Einwegspritze (B-D Plastipak ® , Becton Dickinson, Irland) aufgesetzten Kanü-<br />
le (0,3×1,0 cm, 2R2, Unimed, CH-Lausanne), <strong>von</strong> der Hornspitze in Richtung<br />
Uteruskörper mit 1,0ml M2-Medium durchspült. Die Spülflüssigkeit wurde in ei-<br />
ner Petrischale (35×10mm, Greiner, Frickenhausen) aufgefangen und nach ei-<br />
ner kurzen Verweildauer unter dem Stereomikroskop bei 200- bis 500-facher<br />
Vergrößerung auf vorhandene Embryonen durchsucht.<br />
Alle gewonnenen Embryonen wurden nach morphologischen Kriterien (Kap.<br />
2.9.1) beurteilt und die als gefriertauglich befundenen anschließend in einer mit<br />
2 ml frischem Spülmedium (37°C) gefüllten Petrischale gesammelt und bis zum<br />
Einfrieren im Wärmeschrank (Typ 85, Melag Brutschrank Incubat, Berlin) bei<br />
37°C und gesättigter LF verwahrt.<br />
Während des gesamten Versuches dienten zur Handhabung der Embryonen,<br />
über einem Bunsenbrenner fein ausgezogene, sterile Pasteurpipetten, die an<br />
einen etwa 50 cm langen Mundschlauch aus Silikon und zwischengeseztem<br />
Einmalfilter adaptiert wurden.<br />
3.6 Beurteilung der gewonnenen Embryonen<br />
Da nach ATTRODT (1985) die Qualität der Embryonen ein wichtiges Kriterium<br />
für die späteren Trächtigkeits- und Überlebensraten ist, sollten nach Möglichkeit<br />
nur gute und sehr gute Embryonen kryokonserviert werden.<br />
Im Anschluss an eine Kontrolle unter dem Stereomikroskop bei 500-facher Ver-<br />
größerung erfolgte, je nach Erscheinungsbild, die Klassifizierung der gefunde-<br />
nen Embryonen (Morulae und Blastozysten) in:<br />
1. „gefriertauglich“: Embryonen, die im gewünschten Entwicklungsstadium<br />
waren und intakte Morphologie, intakte Zona pellucida, gleichmäßige<br />
Form und Struktur und gleichmäßiger Färbung aufwiesen.<br />
48
oder<br />
2. „nicht gefriertauglich“: Embryonen, entweder nicht im gewünschten Ent-<br />
wicklungsstadium und/oder mit morphologisch erkennbaren Abweichun-<br />
gen (z.B. Vakuolenbildung, defekte Zona pellucida, Unterschiede in den<br />
Blastomeren).<br />
3.7 Einfrieren der Embryonen<br />
Für das Einfrieren der Embryonen fanden zwei programmgesteuerte Gefrierau-<br />
tomaten Verwendung. Zu Beginn der Versuche wurde die Anlage der Firma<br />
Haake (Kryosta, Typ F-3Q, Haake, Berlin) mit angeschlossenem Programmge-<br />
ber (Typ PG 20, Haake, Berlin) (Abb. 6) verwendet. Als Kühlflüssigkeit diente<br />
für dieses Gerät 70%iges Ethanol. Im weiteren Verlauf des Versuches wurde<br />
auf Grund der vereinfachten Handhabung auf das Einfriersystem BV 65/55<br />
(Consartic, Schöllkrippen), bestehend aus Temperaturregler CL 5500, Gefrier-<br />
kammer FC5AT und Cryobad (alle Einheiten: Consartic, Schöllkrippen), ge-<br />
wechselt (Abb. 7). Als Kühlflüssigkeit wurde in diesem Fall flüssiger Stickstoff<br />
(LN2) verwendet.<br />
Abb. 7: Einfriersystem Firma HAAKE, Berlin<br />
Abb. 8: Einfriersystem Firma CONSARTIC, Schöllkrippen<br />
49
3.7.1 Standartgefrierverfahren<br />
Mittels des Standartgefrierverfahrens wurden die als gefriertauglich eingeordne-<br />
ten Embryonen unter Verwendung des Kryoprotektivums (1,5 Mol EG und 0,25<br />
Mol Saccharose in M2-Medium) eingefroren<br />
Dazu wurde die Embryonen mit der Mundpipette unter dem Stereomikroskop<br />
aus dem M2-Medium herausgenommen und in 10er-Gruppen in eine mit 350 µl<br />
Gefrierschutzmedium gefüllte Center-well-Schale (60×15mm, Falcon, Heidel-<br />
berg) umgesetzt.<br />
3.7.1.1 Haake<br />
Bei Verwendung des HAAKE-Einfrierautomaten verblieben die Embryonen für<br />
20 Minuten bei Raumtemperatur (RT) auf der 37°C warmen Wärmeplatte (HT<br />
200, Minitüb, Landshut) zum Equilibrieren im Kryoprotektivum. Kurz vor Ablauf<br />
dieser Frist erfolgte das Aufziehen der equilibrierten Embryonen auf mit Ent-<br />
wicklungsstadium, Spezies, Spültag und Stückzahl gekennzeichnete 0,25 ml<br />
Kunststoffpailletten (Minitüb, Landshut) (Abb. 9). Dazu wurde zunächst eine<br />
Mediumssäule <strong>von</strong> etwa 2cm, gefolgt <strong>von</strong> einer 1cm langen Luftsäule aufge-<br />
nommen. Als nächstes kam das die Embryonen beinhaltende Kryoprotektivum,<br />
wiederum gefolgt <strong>von</strong> einer 1cm langen Luftblase und einer abschließenden<br />
Mediumssäule. Die letzte Kryoprotektivumssäule wurde solange aufgezogen,<br />
bis am oberen Ende der Stopfen erreicht war. Die Luftblasen übernehmen da-<br />
bei die Funktion eines Puffers und verhindern dadurch sowohl das Ansaugen<br />
der Embryonen in den Stopfen, als auch ein versehentliches Kristallisations-<br />
punktsetzen im Embryonen beinhaltenden Medium (Abb. 8).<br />
50
Versiegelungskitt<br />
Abb. 9: Befüllungsschema Kunststoffpaillette<br />
Abb. 10: Kunststoffpaillette mit Entwicklungsstadium, Spezies, Spültag und<br />
Stückzahl<br />
Die Pailletten wurden abschließend am unteren Ende mit Hämatokrit-<br />
Versiegelungskitt (Brandt, Wertheim) fest verschlossen und anschließend senk-<br />
recht in das auf -6°C vorgekühlte Alkoholbad des Einfrierautomaten gegeben.<br />
Nach fünf Minuten erfolgte manuell die Kristallisationsauslösung (Seeding).<br />
Dieses geschah am oberen Ende der Paillette, am zwischen Stopfen und Luft-<br />
blase eingeschlossenen Gefriermediumssegment, durch kurzes Berühren mit<br />
einer in LN2 gekühlten Metallpinzette. Als Kontrolle für korrektes Seeding war<br />
eine sich vom Berührungspunkt ausgehende Kristallisation zu beobachten. Im<br />
Anschluß an das Seeding wurde die Temperatur noch für fünf weitere Minuten<br />
bei -6°C gehalten. Nach dem Umstellen auf den externen Programmgeber und<br />
starten desselben wurde das Alkoholbad mit einer konstanten Kühlrate <strong>von</strong><br />
0,3°C/min nun auf -32°C heruntergekühlt und nach Erreichen dieser Tempera-<br />
turstufe für 10 Minuten dort gehalten. Danach erfolgte mit einer in LN2 gekühl-<br />
ten Metallpinzette die direkte Umsetzung der Embryonen in LN2 zur weiteren<br />
Lagerung.<br />
3.7.1.2 Consartic<br />
Medium mit Embryonen<br />
. . . . . . .<br />
Luftblase Luftblase<br />
Kristallisationskeim<br />
setzen<br />
Stopfen<br />
Bei Verwendung des CONSARTIC-Einfrierautomaten verblieben die Embryo-<br />
nen für 7 Minuten bei Raumtemperatur (RT) auf der 37°C warmen Wärmeplatte<br />
51
(HT 200, Minitüb, Landshut) zum Equilibrieren im Kryoprotektivum. Kurz vor Ab-<br />
lauf dieser Frist erfolgt auch hier nach dem gleichen Prinzip das Aufziehen der<br />
equilibrierten Embryonen auf mit Entwicklungsstadium, Spezies, Spültag und<br />
Stückzahl gekennzeichnete 0,25 ml Kunststoffpailletten. Die Pailletten wurde<br />
ebenfalls mit Hämatokrit-Versiegelungskitt verschlossen und in die, auf 20°C<br />
gehaltene, Gefrierkammer gegeben. Durch drücken der Taste „Run“ am Pro-<br />
grammgeber startete das Gefrierprogramm. Die Temperatur wurde mit konstant<br />
2°C/min <strong>von</strong> +20°C auf -6°C abgesenkt. Nach Erreichen <strong>von</strong> -6°C und Halten<br />
dieser Temperatur für fünf Minuten erfolgte das manuelle Seeding durch Berüh-<br />
rung mit einer in LN2 gekühlten Metallpinzette und anschließendes Halten der<br />
Temperatur auf -6°C für weitere fünf Minuten. Im Folgenden wurde bei einer<br />
konstanten Kühlrate <strong>von</strong> 0,3°C/min die Temperatur im Inneren der Gefrierkam-<br />
mer auf -32°C heruntergekühlt und nach Erreichen dieser Temperaturstufe für<br />
zehn Minuten dort gehalten. Danach wurde die Temperatur im freien Fall auf<br />
-163°C abgesenkt; <strong>von</strong> dieser Stufe aus fand die direkte Umsetzung der Emb-<br />
ryonen in LN2 statt.<br />
Bei allen folgenden Handgriffen wurden die Kunststoffpailletten ausschließlich<br />
mit einer in LN2 gekühlten Metallpinzette am Verschlussstopfen angefasst, um<br />
so eine Erwärmung zu vermeiden.<br />
Tab. 6: Schema Gefrierprogramm<br />
Programmschritt Haake Consarctic<br />
Equilibrieren Embr. RT 20 Min. 7 Min.<br />
Einsetzen in Kryostat ― ×<br />
Kühlen auf -6°C × -2°C/min<br />
Einsetzen in Kryostat × ―<br />
Halten bei -6°C 5 Min. 5 Min.<br />
Seeding × ×<br />
Halten bei -6°C 5 Min. 5 Min.<br />
Kühlen auf -32°C -0,3°C/min -0,3°C/min<br />
Halten bei -32°C 10 Min. 10 Min.<br />
Umsetzen in LN2 × ―<br />
Freier Fall auf -163°C ― ×<br />
Umsetzen in LN2 ― ×<br />
52
3.8 Zwischenlagerung der eingefrorenen Embryonen<br />
Es wurden insgesamt 573 Embryonen eingefroren. Diese Summe teilte sich in<br />
413 Blastocysten und 160 Morulae auf. Die Unterteilung erfolgte in drei Grup-<br />
pen (Kontrolle, -18°C, -79°C), die verschiedenen Versuchstemperaturen zu ge-<br />
ordnet waren. So weit es Mengenmäßig möglich war, wurden den jeweiligen<br />
Gruppen pro Versuchsdurchgang sowohl Blastocysten als auch Morulae eines<br />
Embryonen-Spültages zugeordnet.<br />
Gruppe Kontroll-Embryonen: Diese Embryonen wurden als Kontrollgruppe ver-<br />
wendet. Sie verblieben bis zu dem Zeitpunkt, an dem auch die übrigen<br />
Embryonen des Durchganges kultiviert wurden in LN2.<br />
Gruppe -18°C-Embryonen: Embryonen aus dieser Gruppe lagerten für die Zeit-<br />
spanne <strong>von</strong> 60 Minuten bei -18°C in der Gefrierzelle. Dazu wurden die<br />
Pailletten in einem mit LN2 gefüllten Styroporbehälter in die Gefrierzelle<br />
gebracht, mit einer in LN2 gekühlten Metallpinzette herausgenommen<br />
und in einen temperierten offenen Styroporkasten gelegt. Hier verblie-<br />
ben sie ab Ablegungszeitpunkt für 1 Stunde.<br />
Gruppe -79°C-Embryonen: In dieser Gruppe überdauerten die Embryonen für<br />
eine Stunde in Trockeneis bei -79°C. Dazu wurden mit einer heißen<br />
Zange Rillen in die, in einem vorgekühlten Styroporkasten mit Deckel,<br />
gelagerten Trockeneisplatten hineingebrannt. Um ein gleichmäßiges<br />
Liegen der Pailletten zu gewährleisten, waren die Rillen geringfügig<br />
länger als die Pailletten. Anschließend wurden die Pailletten mit der in<br />
LN2 gekühlten Metallpinzette angefasst und in den fertigen Rillen abge-<br />
legt. Eine zweite Trockeneisplatte übernahm die Funktion eines De-<br />
ckels. So sollte erreicht werden, dass die Pailletten, ohne gequetscht<br />
zu werden, <strong>von</strong> allen Seiten gleichmäßig bei -79°C lagerten. Ab dem<br />
Moment des Auflegens der oberen Trockeneisplatte lief die Zwischen-<br />
lagerungsdauer <strong>von</strong> 60 Minuten. Um ein schnelles Verdunsten des<br />
Trockeneises zu verhindern wurde dieses ebenfalls in die auf -18°C<br />
gekühlte Gefrierzelle gebracht.<br />
53
Nach Ablauf der Zwischenlagerung <strong>von</strong> 60 Minuten wurden die Pailletten zum<br />
Auftauen aus dem jeweiligen Lagerungsumfeld entfernt. Im Falle der Gruppe K<br />
erfolgte die Herausnahme aus dem flüssigen Stickstoff.<br />
Abb. 11: Zwischenlagerung bei -79°C (li.) und -18°C (re.)<br />
3.9 Auftauen der Embryonen<br />
Das Auftauen der Embryonen erfolgte nach einer Stunde Zwischenlagerung bei<br />
-18°C bzw. -79°C oder im Falle der Kontrollgruppe ohne Zwischenlagerung di-<br />
rekt aus -196°C kaltem flüssigen Stickstoff (LN2) heraus.<br />
Dazu wurden die Pailletten zunächst für ca. fünf Sekunden bei Raumtemperatur<br />
in der Luft geschwenkt und dann vorsichtig für 20 bis 30 Sekunden in ein<br />
36,6°C bis 37,0°C warmes Wasserbad getaucht. Anschließend wurden die Pail-<br />
letten mittels eines Kleenex (KIMTECH Science, Kimberley-Clark ® Professio-<br />
nal) trockengewischt.<br />
Über einer Petrischale (35×10mm, Greiner, Frickenhausen) wurde zunächst mit<br />
einer Schere das untere Ende der aufgetauten Paillette abgeschnitten, an-<br />
schließend unter leichter Schräghaltung der Paillette das obere Ende. Das Ge-<br />
friermedium mit den Embryonen konnte dadurch herauslaufen. Der in der Pail-<br />
lette verbleibende Rest wurde unter Zuhilfenahme einer 1ml-Luer-Einwegspritze<br />
(B-D Plastipak ® , Becton Dickinson, Irland) mit aufgesetzter Pipettenspitze vor-<br />
sichtig herausgeblasen.<br />
Die wiedergefundenen Embryonen wurden unter dem Stereomikroskop (SZ 11,<br />
Olympus, Hamburg) bei 110-facher Vergrößerung mit einer ausgezogenen ste-<br />
54
ilen Glaspipette aufgenommen und schnellstmöglich aus dem Gefriermedium<br />
heraus in das Auftaumedium umgesetzt. In diesem verblieben sie bei Raum-<br />
temperatur für fünf Minuten zum equilibrieren.<br />
3.10 In vitro Kultivierung der Embryonen<br />
Alle gewonnenen und <strong>kryokonservierten</strong> Embryonen wurden im Anschluss an<br />
das Auftauen und Ausverdünnen des Kryoprotektivums für 48 Stunden bei<br />
37°C, 6% CO2 und gesättigter LF kultiviert.<br />
Nach Entnahme aus dem Auftaumediummedium erfolgte ein fünfmaliges Wa-<br />
schen in Mineralöl überschichteten MediCult Universal <strong>IVF</strong> Medium-Drops (Abb.<br />
11), die zuvor für 24 Stunden bei 37°C, 6% CO2 und gesättigter LF im Brut-<br />
schrank (C60, Labotect, Göttingen) equilibriert worden waren. Im Anschluss<br />
daran wurden die Embryonen einzeln oder maximal zu zweit in die Drops der<br />
endgültigen Kultivierungspetrischalen (85×15mm, Greiner, Frickenhausen)<br />
(Abb. 12) übergesetzt. Diese waren ebenso wie das Waschmedium vorher zur<br />
24-stündigen Equilibrierung bei 37°C, 6% CO2 und gesättigter LF in den Brut-<br />
schrank (C60, Labotect, Göttingen) (Abb. 13) gegeben worden. In diesem fand<br />
auch die sich anschließende in vitro Kultivierung statt.<br />
Abb. 12: Waschschale mit fünf Medium-Waschdrops unter Öl<br />
55
Abb. 13: Kultivierungsschale mit 10 Kultivierungs-Mediumdrops unter Öl<br />
Abb. 14: Inkubator C60, Labotect, Göttingen (Quelle: Labotect, Göttingen)<br />
Die Embryonen wurden jeweils im Abstand <strong>von</strong> 12 Stunden auf die Weiterent-<br />
wicklung kontrolliert. Dieses Schema ermöglichte eine gute Verfolgung der wei-<br />
teren Entwicklung.<br />
3.11 Beurteilung <strong>von</strong> Embryonen<br />
3.11.1 Morphologische Beurteilung<br />
In dieser Arbeit wurden Embryonen in der ersten Phase lediglich lichtmikrosko-<br />
pisch beurteilt, am Ende zusätzliche einer fluoreszenzmikroskopischen Unter-<br />
suchung mit FDA und Hoechst unterzogen. Die erste morphologische Beurtei-<br />
lung erfolgte gleich bei der Gewinnung der Embryonen. Für die Versuche zuge-<br />
56
lassen wurden die Stadien Morula und Blastozyste. Als nicht zulässig galten<br />
jüngere Stadien, degenerierte Embryonen sowie unbefruchtete Eizellen.<br />
Die nächsten morphologischen Klassifizierungen der Embryonen erfolgten be-<br />
reits während der Rehydrierungsphase im Auftaumedium sowie während des<br />
Waschens.<br />
Die Weiterentwicklung der Embryonen in vitro bei 37°C, 6% CO2 und gesättig-<br />
ter LF im Brutschrank C60 (Labotect, Göttingen) wurden nach 12/24/36/48<br />
Stunden unter dem Stereomikroskop (SZ 11, Olympus, Hamburg sowie Axio<br />
Observer. A1, ZeissMicroImaging GmbH, Göttingen) 50- bis 200-facher Ver-<br />
größerung kontrolliert.<br />
Die Morula- Embryonen wurden eingeteilt in:<br />
Grade I<br />
• „Sehr gut“: Embryonen mit guter Morphologie und Entwicklungsgeschwindig-<br />
keit. Die Blastomeren sind gleichmäßig in Form und Farbe und haben eine<br />
hervorragende Erscheinung mit intakter Zona pellucida.<br />
Grade II<br />
• „Gut“: Dem Entwicklungsstand entsprechende Embryonen mit geringfügigen<br />
Abweichungen und Unregelmäßigkeiten in der morphologischen Beschaffen-<br />
heit (z.B. einzelne ausgeschleuste Blastomeren, geringe Vesikelbildung, un-<br />
regelmäßige Zellformen, Farbveränderungen).<br />
Grade III<br />
• „Mäßig“: gewisser Grad an Veränderungen (z.B. Schäden an der Zona pellu-<br />
cida, mehrere ausgeschleuste Blastomere, geringe Vakuolenbildung in den<br />
Blastomeren).<br />
Grade IV<br />
• „Degeneriert und retardiert“: Embryonen mit starken Abweichungen in der<br />
morphologischen Beschaffenheit ((keine Rehydrierung, starke Zelllysis, zerfal-<br />
lene Blastomere mit Vakuolen sowie dunklen Punkten, verlorene Zona pellu-<br />
cida, kollabierte Embryonen).<br />
57
Die Blastozysten – Embryonen wurde eingeteilt in:<br />
Grade I<br />
• „Sehr gut“: Gut expandierte Embryonen mit gut cavertiertem Blastocoel sowie<br />
sehr guter Differenzierung zwischen ICM und Tropfektoderemzellen, die eine<br />
sichelförmige Struktur haben. Die Zona pellucida ist ausgedünnt (Abb. 14a).<br />
Grade II<br />
• „Gut“: Embryonen mit geringerem Durchmesser und reduzierter Blastocoelbil-<br />
dung und kaum verdünnter Zona pellucida (Abb. 14b).<br />
Grade III<br />
• „Mäßig“: Embryonen ohne Ausdünnung der Zona pellucida und einem insge-<br />
samt dunklen Erscheinungsbild durch beginnende Degenerationen der Zellen<br />
(Abb. 14c).<br />
Grade IV<br />
• „Degeneriert und retardiert“: Embryonen mit starken Abweichungen in der<br />
morphologischen Beschaffenheit (keine Rehydrierung, starke Zelllysis, zerfal-<br />
lene Blastomere mit Vakuolen sowie dunklen Punkten, verlorene Zona pellu-<br />
cida, kollabierte Embryonen) (Abb.14d+e).<br />
58
a) b)<br />
c) d) e)<br />
Abb. 15: Embryo a) "Sehr gut", b) "Gut", c) "Mäßig", d) degeneriert, e) retardiert<br />
Zusätzlich erfolgte während der gesamten Kultivierungsdauer die Einteilung des<br />
Entwicklungsverlaufes in die Gruppen<br />
1. „kompaktierend“: Übergangsstadium <strong>von</strong> Morula zu Blastocyste<br />
2. „expandierend, Beginn“: beginnende Expandierung der Blastocyste<br />
3. „expandierend“: deutliche, aber noch nicht abgeschlossene Expandie-<br />
rung der Blastocyste<br />
4. „expandierend - “: deutliche, aber weniger stark ausgeprägte oder<br />
gleichmäßige Expandierung der Blastocyste<br />
5. „expandierend ! “: deutliche, nahezu abgeschlossene Expandierung der<br />
Blastocyste<br />
6. „schlüpfend“: sich öffnende Zona pellucida mit Freisetzung Embryo (Abb.<br />
15a)<br />
7. „geschlüpft“: Embryo der die Zona pellucida verlassen hat (Abb. 15b)<br />
8. „kollabiert“: zusammengefallener Zellverband der Blastocyste<br />
9. „degeneriert“: zerfallene Blastomere, sehr viele degenerierte Zellen, sehr<br />
stark geschrumpfte innere Zellmasse oder Vakuolenbildung, Zelllysis<br />
59
a) b)<br />
Abb. 16:a) Schlüpfende Blastocyste, b) Geschlüpfte Blastocyste<br />
3.11.2 Kombinierte FDA-Hoechst-Färbung zur Zytoplasmaaktivi-<br />
tätsbestimmung und Kernzählung<br />
Die FDA-Färbung (3,6-Diacetoxyfluoran, SIGMA-ALDRICH, Steinheim) ist eine<br />
Möglichkeit, tote <strong>von</strong> lebenden Embryonen zu unterscheiden. Lebende Embry-<br />
onen leuchten in einem sehr hellen Grün (Abb. 16a), während tote Embryonen<br />
keine oder nur noch kaum sichtbare Signale aussenden (Abb. 16b) (SCHIL-<br />
LING & DÖPKE, 1978; SCHILLING et al., 1979; SCHILLING & SMIDT, 1979).<br />
Die zu färbenden Embryonen wurden zunächst dreimal in 37°C warmen Medi-<br />
Cult Universal <strong>IVF</strong> Medium gewaschen und dann in FDA-haltiges MediCult Uni-<br />
versal <strong>IVF</strong> Medium gegeben. Für die FDA-Lösung wurde zunächst eine FDA-<br />
Stammlösung <strong>von</strong> 5mg FDA/ml Aceton (Merck, Darmstadt) angesetzt. Diese<br />
wurde auf eine Verdünnung <strong>von</strong> 2µl/2ml MediCult Universal <strong>IVF</strong> Medium ge-<br />
bracht (DIDION et al., 1990). Von der Verdünnung wurden anschließend 10µl<br />
abgenommen und in einen Mediumdrops <strong>von</strong> 50µl eingeben. Die Embryonen<br />
wurden darin für jeweils 1,5 Minuten auf der 37°C warmen Werkbank inkubiert.<br />
Daran anschließend erfolgte eine erneute dreimalige Waschung in MediCult U-<br />
niversal <strong>IVF</strong> Medium.<br />
Im nächsten Schritt wurden die Embryonen zur Anfärbung der mitotisch aktiven<br />
Kerne in eine Hoechst-Farbstoff H 33342 (Sigma-Aldrich, Steinheim) enthalten-<br />
de Lösung umgesetzt. Aktive Kerne strahlen daraus folgend in leuchtendem<br />
Hellblau. Inaktive tote Kerne zeigen keine Antwort mehr (Abb. 17) (VIUFF et al.,<br />
1991).<br />
Auch hier wurde zunächst eine Stammlösung in der Dosierung <strong>von</strong> 1mg<br />
Hoechst H 33342/ml Aqua dest. (PURSEL et al., 1985) angesetzt. Diese wurde<br />
60
dann auf 10µl/50µl MediCult Universal <strong>IVF</strong> Medium verdünnt. Zum Inkubieren<br />
blieben die Embryonen im Hoechst-Farbstoff zwei Minuten auf der 37°C war-<br />
men Werkbank. An diesen Schritt schloss sich wiederum ein dreimaliges Wa-<br />
schen in MediCult Universal <strong>IVF</strong> Medium an.<br />
Zur nachfolgenden mikroskopischen Beurteilung wurden die Embryonen auf ei-<br />
nen Objektträger, auf den vorher zwei Vaseline-Streifen (Weißes Vaselin Lich-<br />
tenstein DAB, Lichtenstein, Mülheim-Kärlich) aufgebracht waren, mittig positio-<br />
niert und mittels eines Deckgläschens fixiert. Dabei war darauf zu achten, dass<br />
die Embryonen nur leicht angequetsch wurden.<br />
Die FDA-Beurteilung wurde bei 100-facher (für Photographien) bzw. 400-facher<br />
Vergrößerung mit einem Axioskop (Axioskop, Zeiss, Göttingen), Filtersatz 09<br />
(Zeiss, Göttingen), einer Anregung <strong>von</strong> 450-490nm (BP Erregerfilter) und einer<br />
Emission <strong>von</strong> 520nm (Interferenzfilter FT 510, Sperrfilter LP 520) vorgenom-<br />
men.<br />
Die Klassifizierung durch Hoechst-Färbung erfolgte ebenfalls bei 100-facher<br />
bzw. 400-facher Vergrößerung auf dem Axioskop (Axioskop, Zeiss, Göttingen)<br />
unter Verwendung des Filtersatzes 02 (Zeiss, Göttingen), der Anregung <strong>von</strong><br />
365nm (Erregerfilter G 365) und einer Emission <strong>von</strong> 420nm (Interferenzfilter FT<br />
395, Sperrfilter LP 420).<br />
a) b)<br />
Abb. 17: Aktives (a) bzw. inaktives (b) Zytoplasma - Feststellung mittels FDA<br />
Abb. 18: Lebende und tote Kerne - Sichtbarmachung mittels Hoechst H 33342<br />
61
3.12 Geräte und Gerätekontrolle<br />
Der für die Kontrollen genutzte Arbeitsplatz zeichnet sich durch eine Edelstahl-<br />
werkbank mit großem integriertem Wärmefeld aus (Easy Bench, Varolab, Gie-<br />
sen).<br />
Abb. 19: Arbeitsplatz mit Kleininkubator C42 (Easy Bench, Varolab, Giessen;<br />
C42, Labotect, Göttingen)<br />
Ein kleiner Brutschrank (C 42, Labotect, Göttingen) mit 6% CO2, 37°C und ge-<br />
sättigter LF sorgte auch in diesem Bereich für eine adäquate Zwischenkultur, so<br />
dass die Embryonen kaum einem Kultivierungstress unterlagen.<br />
Abb. 20: Kleininkubator C42 (Labotect, Göttingen)<br />
62
Alle Werte der Inkubatoren und Wärmefelder wurde in dreitägigem Rhythmus<br />
mit dem Messgerät In Control 1050 (In Control1050, Labotect, Göttingen) auf<br />
Genauigkeit kontrolliert.<br />
Abb. 21: Messgerät In Control 1051 (Labotect, Göttingen) (Quelle: Labotect, Göttingen)<br />
Zur Temperaturmessung wurde der Temperaturfühler in den Innenraum des<br />
Brutschrankes gehängt, die innere und äußere Tür geschlossen und das Mess-<br />
programm gestartet. Nach gleicher Verfahrensweise erfolgte auch die Messung<br />
des CO2-Gehalts. Zur Überprüfung der relativen Luftfeuchte wurde an dem für<br />
externe Probenentnahmen vorgesehenen Anschluss (Sample port) ein Silikon-<br />
schlauch mit zwischengeschalteter Kondensationsfalle angeschlossen und das<br />
Messprogramm gestartet. Bei Abweichungen des Istwertes <strong>von</strong> Sollwert erfolg-<br />
te die entsprechende Korrektur in der Programmierung des Brutschrankes.<br />
Einmal wöchentlich erfolgte die Reinigung der Inkubatoren um möglichen<br />
Keimbefall zu eliminieren. Dazu wurden die zuvor ausgeräumten Geräte innen<br />
mit Fermacidal ® D (Fermacidal ® D, IC Products SA, CH-Minusio, Vertrieb Labo-<br />
tect, Göttingen) ausgewischt. Der Inkubator C42 wurde mit neuem, zweifach<br />
destilliertem Wasser aufgefüllt, in das vier Hübe Fermacidal ® D gegeben wur-<br />
den. Bei dem mit aktiver Sterilbefeuchtung ausgestatteten Brutschrank C60<br />
wurde der externe Wasservorratsbehälter auf seinen Füllstand kontrolliert und<br />
gegebenenfalls aufgefüllt.<br />
63
3.13 Photographien<br />
Die Bilder während der Entwicklungskontrollen wurden mit dem Zeissmikroskop<br />
Axio Observer. A1 (ZeissMicroImaging GmbH, Göttingen) (Abb. 22) bei 200- bis<br />
400-facher Vergrößerung und bei den Fluoreszenzaufnahmen mit dem Axi-<br />
oskop (Zeiss, Göttingen) bei 100-facher Vergrößerung unter Verwendung <strong>von</strong><br />
Octax EyeWare Imaging Software (Octax, Herborn-MTG Altendorf) aufge-<br />
nommen.<br />
Abb. 22: Verwendeter Zeiss Axio Observer A1 (Mitte) (Quelle: Zeiss, Göttingen)<br />
3.14 Statistische Auswertung<br />
Die Ergebnisse und Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und den Ver-<br />
suchsgruppen (-18°C und -79°C) hinsichtlich Überlebens- und Weiterentwick-<br />
lungsrate wurden mit Hilfe des SAS-Programms 9.1 berechnet und auf Signifi-<br />
kanzen mit dem Chi-Tests überprüft.<br />
64
4 Ergebnisse<br />
4.1 Superovulation<br />
Es wurden 132 weibliche Mäuse im Alter <strong>von</strong> vier bis neun Wochen mittels der<br />
Hormone eCG und hCG stimuliert.<br />
83 Tiere (62,9 %) wiesen am Morgen nach der Zusammensetzung mit dem<br />
Bock bei der Kontrolle auf eine erfolgte Bedeckung einen Vaginal-Plaque (VP)<br />
auf.<br />
Unabhängig da<strong>von</strong> ob die Tiere einen VP aufgewiesen hatten, wurden sie drei<br />
Tage nach der Bedeckung getötet und die Embryonen gespült. Dieses Vorge-<br />
hen wurde gewählt, da Erfahrungen der Arbeitsgruppe ergeben hatten, dass<br />
auch Tiere ohne VP verwendbare Embryonen liefern können.<br />
Von den 132 Spendermäusen hatten 80 ovuliert, das entspricht 60,6 % der<br />
hormonell stimulierten und 96,4 % der positiv auf einen VP kontrollierten Tiere.<br />
4.2 Embryonengewinnung, -stadium und -qualität<br />
Die 132 gespülten Mäuse ergaben insgesamt 1023 Eizellen und Embryonen.<br />
Das ergibt ein Mittel <strong>von</strong> 7,8 Eizellen und Embryonen je gespülter Maus (SD<br />
12,2; Spanne: 0 bis 57).<br />
Wurden nur die Mäuse zur Berechnung herangezogen, die ovuliert hatten, er-<br />
gab sich ein Mittelwert <strong>von</strong> 12,8 Eizellen und Embryonen pro Maus (SD 13,49;<br />
Spanne 0 bis 57).<br />
Die zahlenmäßige Verteilung der insgesamt gewonnenen Eizellen und Embryo-<br />
nen ist Tabelle 7 zu entnehmen.<br />
65
Tab. 7: Entwicklungsstadium und Verteilung gewonnener Eizellen und Embryonen<br />
Entwicklungsstadium Anzahl %<br />
Blastocyste 531 51,9<br />
Morula 279 27,3<br />
Degenerierter Embryo 91 8,9<br />
Unbefruchtete Eizelle 88 8,6<br />
Sonstiges Stadium 34 3,3<br />
Summe 1023 100<br />
Von den insgesamt 531 gewonnenen Blastocysten wurden 410 (77,2 %) als ge-<br />
friertauglich bewertet. Von den 279 Morulae wurden 167 (59,9 %) als gefrier-<br />
tauglich beurteilt. Das bedeutet, dass pro behandelter Maus 3,1 gefriertaugliche<br />
Blastocysten und 1,3 gefriertaugliche Morulae gewonnen wurden. Pro ovulierter<br />
Maus ergab das im Mittel 5,1 gefriertaugliche Blastocysten sowie 2,1 gefrier-<br />
taugliche Morulae. Insgesamt wurden 577 Embryonen kryokonserviert.<br />
4.3 Zwischenlagerung<br />
Die Kontrollgruppe umfasste 164 Embryonen, die sich aufteilten auf 109 Blasto-<br />
cysten (Bl.) und 55 Morulae (Mo.).<br />
Insgesamt 172 Embryonen (127 Bl., 45 Mo.) wurden bei -18°C zwischengela-<br />
gert, weitere 170 (130 Bl., 40 Mo.) bei -79°C.<br />
Überdies wurden 55 Embryonen (31 Bl., 24 Mo.) einer Zwischenlagerung <strong>von</strong><br />
72 Stunden bei -18°C, bzw. -79°C ausgesetzt oder als Kontrollgruppe verwen-<br />
det.<br />
Sechzehn Embryonen (13 Bl., 3 Mo.) waren bereits im Vorfeld aufgetaut wor-<br />
den, um an ihnen die Technik des Auftauens zu üben.<br />
66
4.4 In vitro Kultivierung<br />
Für die Untersuchungen wurden insgesamt 430 Embryonen (309 Bl., 121 Mo.)<br />
kultiviert. Diese teilten sich in 140 Embryonen (91 Bl., 49 Mo.) der Kontrollgrup-<br />
pe, 142 (107 Bl., 35 Mo.) bei -18°C und 148 (111 Bl., 37 Mo.) bei -79°C gela-<br />
gerte Embryonen auf.<br />
Die Ergebnisse der in vitro Kultivierung <strong>von</strong> bei -18°C bzw. -79°C zwischenge-<br />
lagerten Embryonen sowie für die Embryonen der Kontrollgruppe sind den Ta-<br />
bellen 8 und 9 zu entnehmen.<br />
67
Tab. 8: Ergebnisse der in vitro Kultivierung <strong>von</strong> bei -18°C bzw. -79°C zwischengelagerten <strong>kryokonservierten</strong> Blastocysten<br />
Gruppe<br />
Anzahl<br />
Wiederfindungsrate Morphologischer Zustand nach in vitro Kultivierung (%)<br />
Embryonen Anzahl %<br />
Nach 12 h Nach 24 h Nach 48 h<br />
Deg. Exp. Exp.! Schl. Geschl. Deg. Exp. Exp.! Schl. Geschl. Deg. Exp. Exp.! Schl. Geschl.<br />
Kontrolle 109 91 83,5 60,4 18,7 20,9 - - 59,3 12,1 28,6 - - 73,6 4,5 15,4 3,3 2,2<br />
-18°C 127 107 84,3 74,8 16,8 8,4 - - 79,4 5,6 15,0 - - 86,9 3,7 8,5 0,9 -<br />
-79°C 130 111 85,4 74,8 13,5 11,7 - - 80,2 7,2 12,6 - - 85,6 4,5 8,1 0,9 0,9<br />
Tab. 9: Ergebnisse der in vitro Kultivierung <strong>von</strong> bei -18°C bzw. -79°C zwischengelagerten <strong>kryokonservierten</strong> Morulae<br />
Gruppe<br />
Anzahl<br />
Wiederfindungsrate Morphologischer Zustand nach in vitro Kultivierung (%)<br />
Embryonen Anzahl %<br />
Nach 12 h Nach 24 h Nach 48 h<br />
Deg. Exp. Exp.! Schl. Geschl. Deg. Exp. Exp.! Schl. Geschl. Deg. Exp. Exp.! Schl. Geschl.<br />
Kontrolle 55 49 89,1 65,3 22,5 10,2 2,0 - 69,4 24,5 4,1 2,0 - 85,7 4,1 6,1 - 4,1<br />
-18°C 45 35 77,8 65,7 25,7 8,6 - - 71,4 11,8 17,1 - - 85,7 5,7 8,6 - -<br />
-79°C 40 37 92,5 64,9 18,9 13,5 2,7 - 70,3 5,4 18,9 0,9 0,9 75,7 5,4 10,8 5,4 2,7<br />
68
4.5 Vitalfärbung mit FDA und Hoechst 33341<br />
Im Anschluss an die abschließende morphologische Beurteilung nach 48 Stun-<br />
den in vitro Kultivierung wurden alle als expandiert sowie gut expandiert klassi-<br />
fizierten Embryonen angefärbt. Das entsprach 131 der insgesamt 430 kultivier-<br />
ten Embryonen.<br />
Je nach Intensität der Reaktion des Zytoplasmas auf den FDA-Farbstoff wurde<br />
dabei unterschieden in tot (T), schwach aktiv (L -), aktiv (L) und sehr aktiv (L !).<br />
Die Ergebnisse sind Tabelle 10 zu entnehmen.<br />
Als Reaktion auf Hoechst 33341 ließen sich im UV-Licht noch bei 120 Embryo-<br />
nen Zellkerne erkennen. Im Mittel waren dies 13,1 sichtbare Zellkerne pro an-<br />
gefärbtem Embryo (SD 13,0; Spanne 0 bis 65).<br />
Tab. 10: Reaktion des Zytoplasmas auf die FDA-Färbung<br />
T L - L L !<br />
Anzahl % Anzahl % Anzahl % Anzahl %<br />
80 61,1 25 19,1 10 7,6 16 12,2<br />
4.6 Einfluss der Abstammung der Mutterherkunft auf die Emb-<br />
ryonenausbeute<br />
Da bei der Gewinnung der Embryonen aufgefallen war, dass die Mäuse, die<br />
<strong>von</strong> einem MPI-Herkunft bezogen worden waren deutlich mehr und auch mor-<br />
phologisch bessere Embryonen lieferten als die im Institutsbestand gezogenen,<br />
wurden die Ergebnisse zusätzlich noch nach Herkunft der Mütter (MPI = M, In-<br />
stitut = I) aufgeschlüsselt. Die Ergebnisse sind in Tabellen 11 und 12 angeben.<br />
69
Tab. 11: Embryonengewinnung aus MPI-Mäusen<br />
Stadium Mittelwert SD Min. Max.<br />
Blastocyste 11,8 13,6 1 48<br />
Morula 7,3 5,8 1 27<br />
Degeneriert 2,7 1,3 1 5<br />
Unbefruchtet 2,6 2,1 1 10<br />
Tab. 12: Embryonengewinnung aus institutseigenen Mäusen<br />
Stadium Mittelwert SD Min. Max.<br />
Blastocyste 9,4 6,2 1 22<br />
Morula 5,9 4,2 1 13<br />
Degeneriert 3,1 2,9 1 11<br />
Unbefruchtet 3,2 2,9 1 12<br />
4.7 Einfluss der Abstammung der Mutter auf das Entwicklungs-<br />
stadium nach 48 Stunden in vitro Kultivierung<br />
Da sich die morphologische Entwicklung nach 48stündiger in vitro Kultivierung<br />
unterschied, je nachdem welche Mutterherkunft die Embryonen hatten, wurden<br />
die Ergebnisse danach differenziert (Tabelle 13 und 14).<br />
Tab. 13: Mutterherkunft Institutseigen<br />
Gruppe<br />
Morphologischer Zustand nach 48 h in vitro Kultivierung in %<br />
Deg. Exp. Exp.! Schl. Geschl.<br />
Kontrolle 83,2 10,5 6,3 - -<br />
-18°C 86, 9,6 3,7 - -<br />
-79°C 93,0 4,7 1,6 - 0,7<br />
Tab. 14: Mutterherkunft MPI<br />
Gruppe<br />
Morphologischer Zustand nach 48 h in vitro Kultivierung in %<br />
Deg. Exp. Exp.! Schl. Geschl.<br />
Kontrolle 59,9 8,6 26,4 2,7 2,4<br />
-18°C 79,6 6,7 13,2 0,5 -<br />
-79°C 75,6 6,9 15,1 1,5 0,9<br />
70
Der Einfluss der Mutterherkunft hatte einen hoch signifikanten Einfluss<br />
(p0,05) auf die Entwick-<br />
lung ausübte. Bei den Gruppen Kontrolle sowie -79°C zeigte sich allerdings ein<br />
hoch signifikanter Einfluss (p
5 Diskussion<br />
Das Ziel dieser Arbeit war es, festzustellen ob es möglich ist kryokonservierte<br />
und in flüssigem Stickstoff gelagerte Mäuseembryonen über einen Zeitraum <strong>von</strong><br />
einer Stunde bei Temperaturen <strong>von</strong> -18°C oder -79°C z.B. für Transportzwecke<br />
zwischenzulagern.<br />
Dafür wurden Morulae und Blastocysten <strong>von</strong> superovulierten Spendern gewon-<br />
nen, kryokonserviert und anschließend für eine Stunde bei -18°C bzw. -79°C<br />
zwischengelagert<br />
5.1 Superovulation<br />
Wie schon <strong>von</strong> HOGAN et al. 1986 berichtet und <strong>von</strong> OZGUNEN et al. (2001)<br />
bestätigt, hängt bei Mäusen eine erfolgreiche Superovulation maßgeblich <strong>von</strong><br />
dem Alter und Körpergewicht der Mäuse, der gespritzten Hormonmenge, der<br />
Zuchtlinie sowie den Haltungsbedingungen ab.<br />
HOOGENKAMP & LIWING (1982) gaben an, dass die optimale Hormonmenge<br />
für jede Linie separat ermittelt werden muss, da das Optimum zwischen den un-<br />
terschiedlichen Zuchtlinien teilweise stark schwankt.<br />
Die anfangs in diesem Versuch angewandte Hormondosierung (7,5 IE eCG und<br />
5,0 IE hCG) wurde auf Grund der positiven Ergebnisse der Arbeitsgruppe<br />
Reischl & Al Yakoub (2006) gewählt. Wegen der teilweise sehr geringen Erfolge<br />
der Superovulation wurde nach Erfahrungsaustausch mit anderen, ebenfalls<br />
superovulierte Mäuse verwendenden Arbeitsgruppen (WOLF, 2006; NOWS-<br />
HARI, 2006) auf eine leicht verringerte Hormondosierung (5,0 IE eCG und 5,0<br />
IE hCG) gewechselt.<br />
Der zum Kontrollzeitpunkt durch einen VP als gedeckt gekennzeichnete Anteil<br />
Mäuse lag mit 62,9 Prozent bei einem eher unbefriedigenden Niveau. HOO-<br />
GENKAMP & LEWING (1982) erreichten eine Deckrate <strong>von</strong> 85 %, SMORAG et<br />
al. (1981) <strong>von</strong> 61 %, SCHMIDT et al. (1985) <strong>von</strong> 59 % und MATAR (2002) <strong>von</strong><br />
76 %, wobei allerdings andere Hormondosierungen und Mäuselinien verwendet<br />
wurden.<br />
72
Als nur bedingt zufriedenstellend anzusehen war der Anteil der gewonnenen<br />
Eizellen und Embryonen mit 7,8 pro Spender auf die Gesamtheit der gespülten<br />
Tiere bezogen. Die zur Weiterzucht verwendeten Vergleichstiere erreichten oh-<br />
ne Hormonstimulation Wurfgrößen <strong>von</strong> bis zu 16 Jungen.<br />
Zufriedenstellend war der Anteil der Mäuse die ovuliert hatten, bezogen auf die<br />
als gedeckt gekennzeichneten Tiere mit 96,4 %.<br />
Nur bedingt zufriedenstellend war die Höhe der gewonnenen Menge an Eizellen<br />
und Embryonen mit im Mittel 12,8 je Tier. Gleiches gilt für die Höhe der Rate an<br />
gewonnenen Morulae (27,3 %) und Blastocysten (51,9 %) aus den Spendertie-<br />
ren die ovuliert hatten.<br />
Die zuweilen nur bedingt akzeptablen Ergebnisse nach Superovulationsindukti-<br />
on bei der Gewinnung der Embryonen könnten auf dem Alter und Gewicht, den<br />
Haltungsbedingungen sowie dem Inzuchtgrad der verwendeten Mäuse beru-<br />
hen.<br />
GATES beobachtete 1971, dass das Alter, die physische Verfassung und auch<br />
ein möglichst optimales Gewicht (13 bis 14 g) in großem Ausmaß die Anzahl<br />
gewonnener Embryonen nach einer Superovulation beeinflusst. Auch MINTZ<br />
(1967) gab an, dass es wichtig ist, präpuberale Mäuse zu verwenden, da Tiere<br />
mit einem eigenen Zyklus nach einer Hormonbehandlung deutlich schlechtere<br />
Ergebnisse liefern. HOOGEN (1968) gab als das geeignetste Alter für eine er-<br />
folgreiche Superovulation den Zeitraum zwischen dritter und sechster Lebens-<br />
woche an. Dieses wurde 1993 durch KOVACS et al. bestätigt, die ebenfalls<br />
festgestellt hatten, dass postpuberale Tiere nach einer Hormonbehandlung we-<br />
niger Eizellen ovulierten und auch eine geringere Embryonengewinnungsrate<br />
aufwiesen. Das ist insofern interessant, als Mäuse in der Regel drei bis vier<br />
Wochen nach der Geburt abgesetzt werden und mit etwa sechs bis acht Wo-<br />
chen geschlechtsreif werden.<br />
Die Tatsache, dass präpuberale Weibchen besser auf eine Hormongabe an-<br />
sprechen als geschlechtsreife, konnte auch in der vorliegenden Untersuchung<br />
beobachtet werden. Die bei Versuchsbeginn zur Verfügung stehenden bereits<br />
geschlechtsreifen Weibchen wiesen nach einer hormonellen Stimulation deut-<br />
lich weniger Embryonen bei der Spülung auf, als die zum Vergleich herangezo-<br />
73
genen Wurfgrößen der ohne Hormonbehandlung zur Weiterzucht genutzten<br />
Weibchen des selben Wurfes oder der gleichen Altersklasse verpaart mit den<br />
identischen Zuchtböcken wie bei den gespülten Tieren.<br />
Als optimales Haltungsklima wird für Mäuse eine Raumtemperatur (RT) zwi-<br />
schen 22°C bis 25°C und eine rel. Luftfeuchte (LF) <strong>von</strong> 50 bis 60 % angenom-<br />
men.<br />
Ellendorf et al. (1970) berichteten, dass sowohl deutlich niedrigere oder höhere<br />
Temperaturen als auch vom Optimalwert abweichende rel. LF sich deutlich ne-<br />
gativ auf die Fruchtbarkeit der Mäuse auswirken. Auf Grund der baulichen und<br />
technischen Gegebenheiten im Mäusehaus des Institutes waren die zu den<br />
Versuchen herangezogenen Mäuse mitunter suboptimalen Haltungsbedingen<br />
ausgesetzt. So waren die als optimal anzusehenden Werte nicht zu jeder Zeit<br />
erfüllbar. Dieses könnte ein weiterer Grund für die schlechteren Ergebnisse bei<br />
der Embryonengewinnung sein.<br />
HOGAN et al. veröffentlichten 1986, dass die Linien CBA, C57 und BALB und<br />
deren Kreuzungen sehr gute Ovulationsrate hervorbringen. Die im Versuch ein-<br />
gesetzte NMRI-Linie wird häufig als Rezipient bei Transferversuchen einge-<br />
setzt; sie ist aber eigentlich ebenfalls für eine gute Vitalität bekannt, die nach<br />
einer Superovulation mit einer größeren Anzahl gewonnener Embryonen ein-<br />
hergeht. Insofern ist die doch recht geringe Reaktion auf die Superovulations-<br />
behandlung etwas verwunderlich.<br />
Es ist allgemein bekannt, dass sich Inzucht auf bestimmte Merkmale wie z.B.<br />
Wurfgröße und damit auf die Anzahl ovulierter Eizellen positiv auswirken kann.<br />
Bei einer zu stark steigenden Homozygotie kann es jedoch zu einer Verände-<br />
rung züchterisch relevanter Merkmale wie z.B. der Fruchtbarkeit, des Wachs-<br />
tums oder der Vitalität im Allgemeinen kommen (KÖHLER, 1989).<br />
Das kann dazu führen, dass die Tiere eher auf Krankheiten ansprechen und<br />
damit unter Umständen eine geringere Lebenserwartung haben (WEIß et al.,<br />
1996). SMIDT & MONZAVIFAR (1969) berichteten, dass es häufig in Folge <strong>von</strong><br />
zunehmender Inzucht zu einem Sinken der Fruchtbarkeit kommt.<br />
74
Da der institutseigene Mäusebestand starke Inzucht aufwies, könnte dieser<br />
Umstand auch eine Erklärung dafür sein, dass es nach Austausch der Mäuse-<br />
population zu einem deutlichen Anstieg der gewonnenen und als tauglich beur-<br />
teilten Embryonen kam.<br />
5.2 Überleben und Weiterentwicklung unter in vitro Bedingun-<br />
gen<br />
Ein recht zuverlässiges und einfaches Beurteilungsverfahren für die Überprü-<br />
fung der Unversehrtheit <strong>von</strong> Embryonen im Anschluss an das Auftauen ist die<br />
Beobachtung der Weiterentwicklungsrate in vitro unter Verwendung eines ge-<br />
eigneten Kulturmediums und geeigneter Kulturbedingungen (SCHNEIDER et<br />
al., 1974; BILTON & MOORE, 1976a; TROUNSON et al., 1978; AL-HASANI et<br />
al., 1986; LEIBO, 1990).<br />
Das in den Versuchen zur Kultivierung verwendet verbrauchsfertige Medicult<br />
Universal <strong>IVF</strong>-Medium ist ein im Bereich der humanen Reproduktion verwende-<br />
tes Medium auf Basis Earle´s Gepufferter Salzlösung (EBSS). Bevor Medien im<br />
humanen Bereich zum Einsatz kommen, müssen sie am Mausmodell erfolg-<br />
reich getestet worden sein und dort gute Ergebnisse gebracht haben. Das in<br />
den vorliegenden Versuchen verwendete Medium war zu Beginn der eigentli-<br />
chen Untersuchung in Vorversuchen, die dem Erlernen der Techniken dienen<br />
sollen, zur Kultivierung frischer wie auch kryokonservierter Mäuseembryonen<br />
eingesetzt worden. Durch die dabei beobachteten guten bis sehr guten Ergeb-<br />
nisse führten zu der Entscheidung dieses Medium auch für die eigentlichen<br />
Versuche zu nutzen.<br />
Bei dem Medium war, da es kein HEPES enthielt, eine CO2-Begasung in Höhe<br />
<strong>von</strong> mindestens 5% notwendig. Die Einstellung des Brutschrankes wurde im<br />
Abgleich mit dem dazugehörigen Messgerät InContol 1050 sehr genau justiert.<br />
Dieser Brutschrank zeichnet sich besonders durch den sterile Wasserzufuhr<br />
aus, die eine absolut kontaminationsfreie Atmosphäre durch ein neuartiges<br />
Wassereinspritzsystem gewährleistet. Im Unterschied zu den sonst häufig in<br />
den in vitro Kultivierungen muriner Embryonen eingesetzten Medien, enthielt<br />
75
das verwendete Medium als Serumkomponente humanes Serum Albumin<br />
(HSA). Das könnte ein Grund sein, warum weniger Blastocysten schlüpften als<br />
es auf Grund ihrer Entwicklung anzunehmen war.<br />
LADD et al. stellt 1982 in Versuchen fest, dass Mäuseembryonen in absteigen-<br />
der Reihenfolge offensichtlich die besten Weiterentwicklungsraten bei Verwen-<br />
dung <strong>von</strong> fetalem Kälberserum (FCS), Lämmerserum sowie bovinem Serumal-<br />
bumin (BSA) aufweisen. ARIFF et al. (1988) dagegen erzielten bei Verwendung<br />
<strong>von</strong> BSA als Serumkomponente eine Weiterentwicklungsrate <strong>von</strong> 90 % wäh-<br />
rend einer in vitro Kultivierung <strong>von</strong> 2-Zell-Mäuseembryonen hin zum Blasto-<br />
cystenstadium.<br />
Beim Auftauen der Embryonen wurde sehr großer Wert auf eine vollständige<br />
Entfernung des Kryoprotektivums gelegt, da wie SCHNEIDER & MAZUR (1984)<br />
und CHUPIN (1986) feststellten, eine unzureichende Ausverdünnung <strong>von</strong> Kry-<br />
oprotektiva zu einer verringerten Entwicklungsrate der aufgetauten Embryonen<br />
führen kann.<br />
5.3 Zwischenlagerungseinfluss auf die Weiterentwicklung der<br />
<strong>kryokonservierten</strong> Embryonen<br />
Anders als erwartet, entwickelten sich nach einer Stunde Zwischenlagerung<br />
nicht nur Embryonen aus der Kontrollgruppe (ohne Zwischenlagerung) weiter,<br />
sondern auch Embryonen aus den Zwischenlagerungstemperaturen -18°C und<br />
-79°C. Auch fiel der erwartete Unterschied in Bezug auf überlebende und tote<br />
Embryonen zwischen den Versuchsgruppen -18°C und -79°C erstaunlich gering<br />
aus. Das lässt vermuten, dass es bei einer Temperaturerhöhung über den Zeit-<br />
raum <strong>von</strong> einer Stunde zu weniger Schäden an den Embryonen kommt als<br />
weithin angenommen wird. MAURER & Bank (1973) sowie MAURER et al<br />
(1977) lagerten kryokonservierte 8-Zell-Mäuse-embryonen bei -44°C, -88°C und<br />
-196°C ein. Dabei stellten sie nach anschließender in vitro Kultivierung fest,<br />
dass je höher die Lagertemperatur ist, desto geringer die Überlebens- und Wei-<br />
terentwicklungsrate der Embryonen ausfällt.<br />
Die Ursachen für diese Beobachtungen können nicht definitiv benannt werden,<br />
wahrscheinlich ist aber, dass viele einzelne Faktoren Einfluss haben. So könnte<br />
76
einerseits die bei höheren Temperaturen stärker wirkende Toxizität der Kry-<br />
oprotektiva sich negativ auswirken (KASAI et al., 1981), andererseits könnte<br />
auch eine eventuell ablaufende Umkristallisation der beim schnellen Einfrieren<br />
auf -196°C gebildeten kleinen intrazellulären Eiskristalle in größere schädliche<br />
Eiskristalle Einfluss haben. Beim Prozess des schnellen Einfrierens bilden sich<br />
viele kleine, für die Zellen unschädliche intrazelluläre Eiskristalle (LEIBO et al.,<br />
1974; FARRANT et al., 1977; RALL, 1981; JONDET et al., 1984), die aber beim<br />
Auftauvorgang ebenfalls eine schnelle Auftaurate (350°C bis 500°C/min) benö-<br />
tigen, damit es nicht zu einer Umkristallisation in größere und damit schädigen-<br />
de Kristalle kommt (WILLADSEN et al., 1978; WOOD et al., 1978; BILTON,<br />
1980). Physikalischen Gesetzen nach, muss je nach verwendeter Lösung bis zu<br />
einer Temperatur <strong>von</strong> etwa -80°C mit einer Positionsverschiebung der Eiskris-<br />
talle gerechnet werden, die ein Zusammenschmelzen einzelner Kristalle in grö-<br />
ßere Komplexe bewirkt (MEYBERG, 2007) und eine gewisse Dynamik in der<br />
Zelle zu Schädigungen führt.<br />
Ein zusätzlich weiterer, beeinflussender Faktor könnte die Qualität der kryokon-<br />
servierten Embryonen sein. So stellte zum Beispiel MAHABIR (2000) fest, dass<br />
je besser die Spendertiere auf eine Superovulation reagiert hatten, desto bes-<br />
ser auch die Qualität der gewonnenen Embryonen ausfiel. Das würde sich mit<br />
den Beobachtungen in diesem Versuch decken, die sich bei allen Behandlun-<br />
gen (Kontrollgruppe, -18°C, -79°C) ein deutlich besseres Überleben derjenigen<br />
Embryonen zeigen, die an Spültagen gewonnen worden waren, bei denen die<br />
Spenderinnen eine sehr gute Reaktion auf die Superovulation gezeigt hatten.<br />
Nicht ohne positiven Effekt könnte auch der Einsatz des moderneren Einfrier-<br />
systems der Firma Consartic gewesen sein. Durch die Computerchip gesteuer-<br />
te Programmierung des Ablaufes des Programmes ist eine extrem genaue Ein-<br />
haltung der Einfrierraten gewährleistet, sowie auch die einheitliche Wiederhol-<br />
barkeit der verschiedenen Kryozyklen.<br />
Die Verwendung des Kleininkubators C42 wird sich ebenfalls positiv auf die Er-<br />
haltung der Vitalität der Embryonen ausgeübt haben, denn alle Embryonen<br />
wurden immer nur kurz zu Waschvorgängen aus der optimalen Atmosphäre he-<br />
rausgenommen und waren somit nur ganz geringen Zellkulturstress unterwor-<br />
fen. Die Gewinnung der Embryonen wurde sehr steril und temperaturstabil<br />
77
durchgeführt, da die Werkbank aus gut zu säuberndem Edelstahl mit integrier-<br />
tem Wärmefeld bestand.<br />
Ähnliche Untersuchungen wie die der vorliegenden Untersuchungen waren<br />
2002 durch MATAR durchgeführt worden, die allerdings eine 72-stündige Zwi-<br />
schenlagerung bei -5°C, -18°C und -79°C mit sofort anschließendem Refree-<br />
zing und im nächsten Schritt einen Transfer auf Empfängertiere bzw. in vitro<br />
Kultivierung beinhalteten. Aus ihren Ergebnissen schlussfolgerte sie, dass eine<br />
Versuchswiederholung mit der Temperaturstufe -79°C nur dann sinnvoll ist,<br />
wenn ein optimiertes Kryoprotektivum, reduzierte Lagerungsdauer und anstatt<br />
einem sofortigen Refreezing zuvor ein vollständiges Auftauen und danach er-<br />
neutem Einfrieren eventuell sinnvoll wäre.<br />
Die in dem eigenen Versuch gewonnenen Resultate lassen vermuten, dass die<br />
<strong>kryokonservierten</strong> Embryonen in der Lage sind, eine kurzfristige Erhöhung der<br />
Temperatur mit direkt anschließender in vitro Kultivierung zu tolerieren. Um die-<br />
se Beobachtungen noch einmal zu überprüfen und gegebenenfalls zu festigen<br />
wäre es sinnvoll, die Versuche mit Embryonen, ausschließlich <strong>von</strong> gut supero-<br />
vulierten Spenderinnen gewonnen, zu wiederholen. In diesem Zusammenhang<br />
wäre es auch interessant festzustellen, wie sich eine Verlängerung der Zwi-<br />
schenlagerungsdauer auf das Überleben der Embryonen auswirken würde und<br />
ob eine Übertragung der Technik auch auf andere Spezies möglich ist.<br />
78
6 Zusammenfassung<br />
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Einflüsse einer 60-minütigen Zwi-<br />
schenlagerung auf die Entwicklungsrate <strong>von</strong> bei -18°C und -79°C auf zuvor in<br />
flüssigem Stickstoff (-196°C) kryokonservierte Mäuseembryonen zu untersu-<br />
chen.<br />
Um bei den Spendertieren ein Erhöhung der zu gewinnenden Embryonen pro<br />
Tier zu erreichen wurden insgesamt 132 Spendertiere mit zu Beginn der Versu-<br />
che 7,5 IE eCG und 5,0 IE hCG und im weiteren Verlauf der Versuche mit 5,0<br />
IE eCG und 5,0 IE hCG hormonell behandelt. Von diesen Tieren wurden nach<br />
Spülung der Eileiter und Uterushörner insgesamt 1023 Eizellen und Embryonen<br />
gewonnen. 410 Blastocysten und 167 Morulae wurden als gefriertauglich ange-<br />
sehen und mittels des Standartgefrierverfahrens folgendermaßen kryokonser-<br />
viert:<br />
Im Anschluss an eine 20-minütige Equilibrierung im Kryoprotektivum (1,5 M EG<br />
und 0,25 M Saccharose) bei Raumtemperatur, bei der bereits ein Aufziehen der<br />
Embryonen auf die Kryopailletten stattfand, wurden die Pailletten in ein auf -6°C<br />
gekühltes Alkoholbad (Gerät Haake) bzw. in die auf -6°C gekühlte Gefrierkam-<br />
mer (Gerät Consartic) gegeben und fünf Minuten bei dieser Temperatur gehal-<br />
ten. Nach Ablauf der fünf Minuten erfolgte das Seeding durch eine in LN2 ge-<br />
kühlte Metallpinzelle. Nach dem Seeding erfolgte ein weiteres Halten der Tem-<br />
peratur für fünf Minuten bei -6°C. Anschließend wurde die Temperatur mit einer<br />
Kühlrate <strong>von</strong> 0,3°C/min bis auf -32°C abgesenkt und dort für noch einmal zehn<br />
Minuten gehalten, bevor ein direktes Umsetzen in LN2 (Gerät Haake) bzw. die<br />
Absenkung der Temperatur in der Gefrierkammer in freiem Fall auf -196°C (Ge-<br />
rät Consartic). Bis zum Beginn der Versuche verblieben die Embryonen zur La-<br />
gerung in LN2.<br />
Für die Versuche wurden die Embryonen zu gleichen Gruppen in Kontrollgrup-<br />
pe, Lagerung bei -18°C und Lagerung bei -79°C aufgeteilt.<br />
Nach Lagerung und Auftauen bzw. bei der Kontrollgruppe nur nach dem Auf-<br />
tauen wurden die Embryonen unter in vitro Bedingungen über die Zeitspanne<br />
<strong>von</strong> 48 Stunden auf ihre Entwicklungsraten beobachtet.<br />
79
Die Kultivierung fand unter Verwendung des MediCult-Universal-<strong>IVF</strong>-Mediums<br />
bei 37°C, 6% CO2 und gesättigter LF im Brutschrank (C60, Labotect, Göttingen)<br />
statt.<br />
Am Ende der 48-stündigen in vitro Kultivierung waren in der Kontrollgruppe<br />
73,6 % der Blastocysten degeneriert und 26,4 % lebend. Bei dem ursprüngli-<br />
chen Stadium Morula waren 85,7 % degeneriert und 14,3 % lebend.<br />
Bei der Versuchsgruppe mit einer -18°C Zwischenlagerung waren aus der<br />
Gruppe der Blastocysten 86,9 % degeneriert und 13,1 % lebend. Bei den Moru-<br />
lae waren 85,7 % degeneriert und 14,3 % lebend.<br />
In der Versuchsgruppe -79°C Zwischenlagerung waren nach 48 Stunden<br />
85,6 % der Blastocysten degeneriert, 14,4 % lebend und bei den Morulae wa-<br />
ren 75,7 % degeneriert und 24,3 % lebend.<br />
Die Ergebnisse lassen vermuten, dass die Embryonen bei dem Prozess der<br />
Zwischenlagerung zwar deutlich geschädigt werden, ein Überleben aber den-<br />
noch möglich zu sein scheint. Eine Möglichkeit der Schädigung wäre eventuell<br />
in der Veränderung der Eiskristallstruktur <strong>von</strong> kleinen zu größeren Kristallen<br />
durch die Lagerung bei höheren Temperaturen zusehen und oder eine Toxizi-<br />
tätszunahme der Kryoprotektiva, ebenfalls durch die Erhöhung der Temperatur<br />
hervorgerufen. Es könnte als Überlegung ebenso noch hinzugezogen werden,<br />
ob eventuell eine nicht optimale Embryonenqualität - verursacht durch eine<br />
schlechte Reaktion der Spendertiere auf die Superovulationsbehandlung - wie<br />
auch die mit Blastocyste und Morula schon relativ weit fortgeschrittene Embry-<br />
onalentwicklung die insgesamt schlechten Ergebnisse zusätzlich gefördert ha-<br />
ben.<br />
Insofern wäre es interessant, die durchgeführten Ergebnisse noch einmal mit<br />
Embryonen aus Spülvorgängen mit besseren Reaktionen auf eine Superovula-<br />
tionsbehandlungen, früheren Embryonalstadien und eventuell auch anderen<br />
Kryokonservierungsmethoden wie zum Beispiel der Vitrifikation durchzuführen.<br />
80
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108
Danksagung<br />
Herrn Professor Dr. W. Holtz möchte ich für die Überlassung des interessanten<br />
Themas, der Möglichkeit zur Erlernung reproduktionsmedizinischer Techniken<br />
und Methoden sowie für die vielfältigen Ideen und Anregungen während der An-<br />
fertigungszeit dieser Arbeit danken.<br />
Bei Herrn Professor Dr. M. Gauly möchte ich mich für das Interesse an meinem<br />
Thema und der Bereitschaft zur Übernahme des Korreferates bedanken.<br />
Unsagbar zum Gelingen dieser Arbeit hat die Unterstützung der Firmen Con-<br />
sarctic, Gück Zellkulturbedarf, Labotect, MTG, Varolab und Zeiss MicroImaging<br />
beigetragen. Durch Dauerleihgaben der Geräte und Bereitstellung <strong>von</strong> Medien<br />
konnten die Versuche auf höchstem technischen Niveau erfolgen, was die Qua-<br />
lität der Aussagekraft der Versuche sicher maßgeblich mit beeinflußt hat. In<br />
diesem Zusammenhang sei auch die Firma <strong>Dragon</strong> <strong>IVF</strong> International genannt,<br />
auf deren Initiative hin diese große Kooperation zwischen Universität und In-<br />
dustrie erstmals stattfinden konnten.<br />
Erste technische Einführungen zum Thema wurden <strong>von</strong> Frau Dr. Judith Reischl<br />
gegeben, der ich auch zu großem Dank verpflichtet bin.<br />
Herrn Azzam Al Yakub möchte ich für die freundschaftliche Zusammenarbeit<br />
meinen besonderen Dank ausdrücken.<br />
Für die schnelle und qualifizierte Hilfe bei der statistischen Auswertung möchte<br />
ich Frau Bianca Lind danken.<br />
Den Kollegen und Kolleginnen insbesondere Frau Elisabeth Stüwe, Herrn Peter<br />
Ludewig und Frau Birgit Sohnrey möchte ich für die motivierende, freundschaft-<br />
liche Arbeitsatmosphäre danken.<br />
Ein ganz herzliches Dankeschön geht an Dr. Manzoor Nowshari, Frau Dr. Ma-<br />
nuela Ropeter-Scharfenstein, Herrn Dr. Klaus Nebendahl, Herrn Wolf (Human-<br />
genetik) sowie allen Freunden und Mitarbeitern am Institut für Tierzucht und<br />
Haustiergenetik.<br />
109
Eidesstattliche Erklärung<br />
Mit meiner Unterschrift versichere ich, die vorliegende Arbeit selbständig ver-<br />
fasst und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt zu<br />
haben<br />
Göttingen, den 23.07.2007 ...............................................<br />
(Stephanie Buhtz)<br />
110