Fusarium oxysporum F. - ศูนย์เทคโนโลยีชีวภาพเกษตร

การพัฒนา SCAR primers สําหรับตรวจสอบเชื้อราสาเหตุโรคเหี่ยวเหลืองของ
มะเขือเทศ (Fusarium oxysporum F.sp. lycopersici)
Development of SCAR Primers for Detection of Fusarium Wilt Pathogen of
Tomato (Fusarium oxysporum F.sp. lycopersici)
มนัสวี สุริยวนากุล 1 2
วีระศักดิ์ ศักดิ์ศิริรัตน1,3
และ ปยะดา ธีระกุลพิศุทธิ์
Manatsawee Suriyawanakul 1 , Weerasak Saksirirat 1,3 and Piyada Theerakulpisut 2
1
สาขาโรคพืชวิทยา ภาควิชาพืชศาสตรและทรัพยากรการเกษตร คณะเกษตรศาสตร
มหาวิทยาลัยขอนแกน ขอนแกน 40002
1
Plant Pathology Section, Department of Plant Science and Agricultural Resources, Faculty of
Agriculture, Khon Kaen University, Khon Kaen 40002
2
ภาควิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร มหาวิทยาลัยขอนแกน ขอนแกน 40002
2
Department of Biology, Faculty of Science, Khon Kaen University, Khon Kaen 40002
3
ศูนยเทคโนโลยีชีวภาพเกษตร และศูนยวิจัยเทคโนโลยีชีวภาพทางการเกษตร เพื่อเศรษฐกิจที่ยั่งยืน
มหาวิทยาลัยขอนแกน ขอนแกน 40002
3
Center of Agricultural Biotechnology (AgBiotec-PERDO-CHE) and Agricultural Biotechnology
Research Center for Sustainable Economy, Khon Kaen University, Khon Kaen 40002
ABSTRACT
Fifteen isolates of Fusarium oxysporum F. sp. lycopersici (Fol) were collected in
Thailand, three isolates from the Netherlands and one isolate from the United States of America,
were tested on pathogenicity using tomato seedlings (Sida variety). Fourteen isolates of Fol
caused Fusarium wilt symptom on tomato plants but five isolates did not infect the host plant.
DNA of nineteen isolates of Fol was studied on DNA finger print using randomly amplified
polymorphic DNA polymerase chain reaction (RAPD-PCR) technique. DNA fingerprint of Fol was
performed using Operon Kit C (OPC 20 primers) and (OPE 10 primers). The primer OPC-04 and
OPE-09 generated DNA fragments about 500 bp and 800 bp, respectively. Moreover, those
fragments were found only on isolates causing Fusarium wilt disease. The DNA fragments were
subjected to design SCAR primers, which tested for Fol detection, compared to DNA pattern of
other Fusarium spp. (F. oxysporum F.sp. melonis, F. oxysporum F.sp. cucumerinum, F.
moniliforme, F. poae, F. solani and Fusarium spp.). Using SCAR primer from primer OPE-09
provided a PCR product of 378 bp which occurred only on isolates causing Fusarium wilt
การประชุมวิชาการอารักขาพืชแหงชาติ ครั้งที่ 9
24-26 พฤศจิกายน 2552 โรงแรมสุนีย แกรนด อําเภอเมือง จังหวัดอุบลราชธานี

disease. This result suggests the development efficacy of this SCAR primer for PCR detection
technique of Fol.
Key words: Fusarium oxysporum F.sp. lycopersici, Fusarium wilt, RAPD, SCAR primer
บทคัดยอ
เชื้อรา Fusarium oxysporum F.sp. lycopersici (Fol) สาเหตุโรคเหี่ยวเหลืองของมะเขือเทศ
จํานวน 15 ไอโซเลต ที่แยกไดในประเทศไทย 3 ไอโซเลต จากเนเธอรแลนด และ 1 ไอโซเลตจาก
สหรัฐอเมริกา รวม 19 ไอโซเลต ไดนํามาทดสอบความสามารถในการเกิดโรคกับมะเขือเทศ (พันธุสีดา)
พบวา 14 ไอโซเลต ทําใหมะเขือเทศเปนโรคเหี่ยวเหลือง 5 ไอโซเลต ไมทําใหมะเขือเทศเปนโรคเหี่ยว
เหลือง นําเชื้อรา Fol ทั้งหมดจํานวน 19 ไอโซเลต นั้นมาศึกษารูปแบบลายพิมพดีเอ็นเอ (DNA
fingerprint) ดวยเทคนิค random amplified polymorphic DNA (RAPD) โดยใชไพรเมอร Operon Kit C
(OPC) จํานวน 20 ชุด และ OPE จํานวน 10 ชุด พบวาไดแถบ DNA ขนาดประมาณ 500 bp ที่ไดจาก
ไพรเมอร OPC-04 และ 800 bp ที่ไดจากไพรเมอร OPE-09 ซึ่งเปนแถบ DNA ที่พบเฉพาะในเชื้อรา
Fol ไอโซเลต ที่ทําใหเกิดโรคเหี่ยวเหลืองกับมะเขือเทศ แถบ DNA ดังกลาวไดนําไปออกแบบไพรเมอร
(SCAR primer) ที่มีความจําเพาะเจาะจงกับเชื้อรา Fol ไอโซเลตที่เปนสาเหตุโรคเหี่ยวเหลืองของมะเขือ
เทศ และเมื่อนํา SCAR primer นั้นมาทดสอบกับเชื้อรา Fol ทั้งหมด และเชื้อรา Fusarium ชนิดอื่น
ไดแก F. oxysporum F.sp. melonis, F. oxysporum F.sp. cucumerinum, F. moniliforme, F. poae,
F. solani และ Fusarium spp. พบวา SCAR primer ที่ไดจากไพรเมอร OPE-09 มีความจําเพาะเจาะจง
กับเชื้อรา Fol ไอโซเลตที่ทําใหเกิดโรคกับมะเขือเทศ โดยจะพบแถบ DNA ขนาดประมาณ 378 bp ซึ่งจะ
ปรากฏเฉพาะในเชื้อรา Fol ไอโซเลต ที่ทําใหเกิดโรคในมะเขือเทศเทานั้น การศึกษานี้ชี้ใหเห็นถึง
ประสิทธิภาพของ SCAR primer ที่สามารถนําไปพัฒนาการตรวจสอบเชื้อรา Fol ที่แมนยําดวยเทคนิค
PCR
คําหลัก: Fusarium oxysporum F.sp. lycopersici, โรคเหี่ยวเหลือง, RAPD, SCAR primer
บทนํา
มะเขือเทศ (Lycopersicon esculentum Mill.) เปนพืชที่นิยมปลูกและบริโภคกันอยาง
แพรหลายทั่วโลก เนื่องจากมะเขือเทศมีคุณคาทางโภชนาการสูง เปนแหลงวิตามิน และแรธาตุที่จําเปน
สําหรับมนุษย นอกจากนี้มะเขือเทศยังเปนพืชเศรษฐกิจที่สําคัญของประเทศไทยดวย เนื่องจากมี
เกษตรกรผูผลิตเมล็ดพันธุมีมากถึงประมาณ 37,500 ครอบครัว รวมทั้งมีบริษัทเมล็ดพันธุที่ดําเนิน
กิจการประมาณ 70 บริษัท ซึ่งปริมาณการใชเมล็ดพันธุภายในประเทศคาดวาจะมีมูลคามากกวา 20,000
ลานบาท/ป และในป 2548 มีการสงออกเมล็ดพันธุเปนมูลคา 1,153.4 ลานบาท (วัชริน, 2548) ประเทศ
ไทยโดยเฉพาะภาคตะวันออกเฉียงเหนือมีสภาพภูมิอากาศที่เหมาะสมแกการผลิตเมล็ดพันธุมะเขือเทศ
เปนอยางมาก มีพื้นที่ปลูกมะเขือเทศมากในเขตจังหวัดหนองคาย สกลนคร นครพนม กาฬสินธุ และ
296 24-26 พฤศจิกายน 2552 โรงแรมสุนีย แกรนด จังหวัดอุบลราชธานี

ขอนแกน โดยเปนแหลงผลิตมะเขือเทศผลสดสําหรับบริโภค สงโรงงานอุตสาหกรรม และเปนแหลงผลิต
เมล็ดพันธุที่ใหญที่สุดในประเทศไทย (เกียรติเกษตร, 2541) ในกระบวนการผลิตเมล็ดพันธุเพื่อการ
สงออกนั้น จะตองมีใบรับรองปลอดโรคพืช (phytosanitary certificate) ที่ระบุการปลอดโรคบางชนิดทั้ง
ในสภาพแปลงปลูกและโรคที่ติดไปกับเมล็ดพันธุ ซึ่งโรคเหี่ยวเหลือง (Fusarium wilt) ของมะเขือเทศที่
เกิดจากเชื้อรา Fusarium oxysporum F.sp. lycopersici (Fol) นั้นเปนโรคตองหามโรคหนึ่งที่มี
ความสําคัญโดยเฉพาะเชื้อรา Fol race 3 มีความสําคัญตอการปลูกและการผลิตเมล็ดพันธุมะเขือเทศ
เพื่อการสงออกเปนอยางมาก เพราะสามารถเขาทําลายมะเขือเทศไดรุนแรงและอาจถายทอดทางเมล็ด
พันธุได ทําใหประเทศผูนําเขาเมล็ดพันธุมะเขือเทศหลายประเทศ ระบุการปลอดเชื้อรา Fol race 3 จาก
ประเทศผูผลิตเมล็ดพันธุตนทาง
เชื้อรา Fol เปนสาเหตุของโรคเหี่ยวเหลืองของมะเขือเทศ ซึ่งเปนโรคที่ทําความเสียหายอยาง
มากตอมะเขือเทศทั่วโลก เชื้อราชนิดนี้มีแหลงอาศัยทั่วไปในดิน สามารถเขาทําลายตนมะเขือเทศได
ตั้งแตระยะตนกลาจนถึงระยะใหผลผลิต เนื่องจากเชื้อรา Fol เปนเชื้อราที่อาศัยอยูในดิน อีกทั้งยัง
สามารถสรางสปอรแบบไมอาศัยเพศเพื่อใชในการแพรกระจายไดถึง 3 แบบ ไดแก microconidia,
macroconidia และ chlamydospores (Agrios, 2005) จึงทําใหเกิดการแพรระบาดไดดีและยากในการ
ปองกันกําจัด อุณหภูมิในดินที่เหมาะสมในการแพรกระจายของเชื้อคือ อุณหภูมิระหวาง 20-34 ° ซ ซึ่ง
ประเทศไทยตั้งอยูในเขตรอนชื้น จึงมักพบการระบาดของเชื้อรา Fol อยูเสมอ ในตางประเทศมีรายงาน
วาพบเชื้อรา Fol จํานวน 3 race ดวยกันคือ race 1, race 2 และ race 3 เชื้อรา Fol race 1 พบครั้งแรก
เมื่อ ป ค.ศ. 1886 ในรัฐ Arkansas ประเทศสหรัฐอเมริกา (Booth, 1971; Marlatt et al., 1996) สําหรับ
Fol race 2 พบครั้งแรกเมื่อป ค.ศ. 1945 ในรัฐ Ohio ประเทศสหรัฐอเมริกา (Alexander and Tucker,
1945) สวน Fol race 3 พบครั้งแรกเมื่อป ค.ศ. 1978 ในประเทศออสเตรเลีย (Grattidge and O’Brien,
1982) ภายหลังพบวามีรายงานการแพรระบาดของเชื้อรา Fol race 3 อยางกวางขวางเชน ที่ Florida
(Volin and Jones.,1982), California (Davis et al., 1988; Cai et al., 2003), Georgia (Chellemi et al.,
1992), Arkansas, North Carolina (Marlatt et al., 1996), ประเทศเม็กซิโก (Valenzuela-Ureta et al.,
1996), Tennessee (Bost, 2001) ตอมาไดรายงานวาพบเชื้อรา Fol race 3 ในประเทศบราซิล (Reis et
al., 2005) ซึ่งการเกิด race ตางๆ ของเชื้อรา Fol อาจเปนผลมาจากความผันแปรทางพันธุกรรม
(genetic variation) ทําใหเกิดสายพันธุใหมๆ สงผลใหการศึกษาเกี่ยวกับเชื้อรา Fol มีความสําคัญมากใน
ปจจุบัน
การตรวจวินิจฉัยเชื้อสาเหตุเชื้อรา Fol ที่ผานมาใชวิธีตรวจสอบลักษณะทางสัณฐานวิทยาของ
โคนิเดีย (conidia) คลามิโดสปอร (chlamydospore) และความสามารถในการทําใหเกิดโรคในมะเขือเทศ
(pathogenicity) เปนตน ปจจุบันเทคนิคดานเทคโนโลยีชีวภาพเชน การเพิ่มปริมาณชิ้นสวน DNA ใน
หลอดทดลอง (polymerase chain reaction, PCR) มีความกาวหนามากขึ้น และไดนํามาใชในการ
ตรวจสอบเชื้อรา Fusarium spp. หลายชนิด เชน F. oxysporum F.sp. melonis, F. oxysporum F.sp.
cucumerinum, F. moniliforme, F. poae, F. solani รวมถึงเชื้อรา Fol นอกจากนี้ มนัสวี และคณะ
การประชุมวิชาการอารักขาพืชแหงชาติ ครั้งที่ 9 297

(2548) Bunyatratchata et al. (2005) ไดศึกษาการใชเทคนิค PCR ตรวจสอบ race ของเชื้อรา Fol แต
ยังไมไดพัฒนาถึงการตรวจสอบเชื้อรา Fol ในทุก race จุดประสงคของการศึกษานี้เพื่อหาไพรเมอรที่
เหมาะสมในการบงชี้เชื้อรา Fol ที่มีความสามารถในการทําใหเกิดโรคเหี่ยวเหลืองของมะเขือเทศ ออก
จากเชื้อรา Fol ที่ไมสามารถทําใหเกิดโรค และจําแนกความแตกตางของเชื้อรา Fol จากเชื้อ Fusarium
ชนิดอื่นๆ เพื่อใชเปนไพรเมอรในการตรวจสอบยืนยันเชื้อรา Fol กอนที่จะใชไพรเมอรในการจําแนก
race ตอไป
วิธีการวิจัย
1. เชื้อรา Fusarium oxysporum F.sp. lycopersici (Fol) จํานวน 19 ไอโซเลต และเชื้อ
Fusarium spp. อื่นที่นํามาศึกษาจํานวน 9 ไอโซเลต ไดมาจากแหลงตางๆ ดังแสดงในTable 1
Table 1 Isolates of Fusarium oxysporum F.sp. lycopersici and Fusarium spp. Used in this study
Fusarium Isolates Origin
Fol 1, Fol 2, Fol 3N
Fol 3A
KK1, KK2, KK3, KK4, KK5,
KK6
KS
CM1, CM2, CM3
PP1
NK1, NK2
SN1, SN2
Fom
Foc
F. monoliforme
F. poae
F. solani
Fu1
Fu5
Fu6
Fu13
Fusarium oxysporum F. sp.
lycopersici
F.oxysporum F.sp. melonis
F.oxysporum F.sp. cucumerinum
F.moniliforme
F.poae
F.solani
Fusarium spp.
The Netherlands
The United tates of America
Khon Kaen University
Kalasin
Chiang Mai University
Department of Agriculture
Nong Khai
Sakonnakhon
Kanchanaburi
Thailand Institute of Scientific and
Technological Research (TISTR)
Mukdahan
Mahasarakham
Khon Kaen
Sakonnakhon
2. การทดสอบความสามารถในการทําใหพืชเกิดโรคของเชื้อรา Fol
นําเชื้อรา Fol จํานวน 19 ไอโซเลต ไดแก Fol 1, Fol 2, Fol 3N, Fol 3A, KK1, KK2, KK3,
KK4, KK5, KK6, CM1, CM2, CM3, KS, PP1 NK1, NK2, SN1 และ SN2 ไปเพาะเลี้ยงบนอาหาร
potato dextrose agar (PDA) ที่อุณหภูมิหอง (30 ± 4 o ซ) เปนเวลา 7 วัน เตรียมสารแขวนลอยสปอร
(spore suspension) ใหมีปริมาณสปอรเทากับ 10 6 สปอร/มล. นําไปปลูกเชื้อกับตนกลามะเขือเทศพันธุสี
ดา อายุ 20 วัน โดยวิธีการตัดรากตนกลามะเขือเทศออกประมาณ 1 ซม. จากปลายราก แลวจุมลงในสาร
298 24-26 พฤศจิกายน 2552 โรงแรมสุนีย แกรนด จังหวัดอุบลราชธานี

แขวนลอยสปอร (root dip) เปนเวลา 20 นาที โดยประยุกตตามวิธีการของ Marlatt et al. (1996) และ
Bunyatratchata, et al. (2005) จากนั้นนําตนกลามะเขือเทศไปปลูกในดินปลูกผสมวัสดุปลูก (พีทมอส)
ที่ผานการนึ่งฆาเชื้อแลว อัตราสวนดินปลูกตอพีทมอสเทากับ 5:2 ในกระถางขนาดเสนผานศูนยกลาง
12 ซม. จํานวน 1 ตน/กระถาง ไอโซเลตละ 12 กระถาง ตรวจสอบอาการของตนกลามะเขือเทศทุกวัน
เปนเวลา 20 วันหลังจากปลูกเชื้อ
3.การพัฒนา SCAR primers สําหรับตรวจสอบเชื้อราสาเหตุโรคเหี่ยวเหลืองของมะเขือเทศ
(Fusarium oxysporum F.sp. lycopersici)
3.1 การศึกษารูปแบบลายพิมพ DNA ของเชื้อรา ดวยเทคนิค RAPD-PCR
การเตรียม Genomic DNA
สกัด DNA ของเชื้อราทั้งหมด 28 ไอโซเลต ที่นํามาศึกษา ไดดัดแปลงมาจากวิธีการของ
Doyle and Doyle (1987) โดยเลี้ยงเชื้อรา ในอาหารเลี้ยงเชื้อ potato dextrose broth (PDB) เขยาที่
ความเร็วรอบ 125 รอบ/นาที ที่อุณหภูมิหองเปนเวลา 7 วัน กรองเอาสวนที่เปนเสนปใยลางเสนใยดวย
น้ํากลั่นนึ่งฆาเชื้อ นําเสนใยประมาณ 0.5-1.0 กรัม มาบดในไนโตรเจนเหลวใหละเอียด แลวเติม
สารละลาย extraction buffer [2% CTAB (hexadecylammonium bromide), 100 mM Tris-base, 20
mM EDTA, 1.42 mM NaCl, 1% PVP-40, pH 8.0] ปริมาตร 700 µl และ 2-mercaptonethanol จํานวน
3 µl ดูดใสในหลอด microcentrifuge ขนาด 1.5 มล. บมที่อุณหภูมิ 60 ๐ ซ เปนเวลา 60 นาที โดยพลิก
หลอดกลับไปมาเปนครั้งคราว เติมสารละลาย chloroform : isoamyl alcohol, (24:1, v/v) ปริมาตร 500
µl พลิกหลอดกลับไปมาเบาๆ จากนั้นนําไปปนเหวี่ยงที่ความเร็ว 13,000 รอบตอนาที ที่อุณหภูมิ 10 ๐ ซ
เปนเวลา 10 นาที ดูดสารละลายสวนบน (supernatant) ไปใสในหลอด microcentrifuge หลอดใหม เติม
ไอโซโพรพานอล (isopropanol) ที่เย็นจัด ปริมาตร 0.7 เทา พลิกหลอดกลับไปมาเบาๆ เพื่อให DNA
ตกตะกอน ทิ้งไวที่อุณหภูมิ –20 ๐ ซ เปนเวลา 20 นาที นําไปปนเหวี่ยงที่ความเร็วรอบ 13,000 รอบ/นาที
ที่อุณหภูมิ 10 ๐ ซ เปนเวลา 10 นาที เพื่อให DNA ตกตะกอนสูกนหลอด เทสวนใสที่เปนสารละลายทิ้ง
ลางตะกอน DNA ดวยสวนผสมระหวางเอธานอล ความเขมขน 76% และแอมโมเนียมอะซิเตต ความ
เขมขน 10 mM [76% ethanol:10 mM ammonium acetate, 1:1] ปริมาตร 500 µl พลิกหลอดกลับไปมา
เบาๆ เทสวนใสที่เปนสารละลายทิ้งใหเหลือแตเฉพาะตะกอน DNA ที่กนหลอด ทิ้งไวใหแหงที่อุณหภูมิ
ประมาณ 30-60 นาที ละลายตะกอน DNA ดวยสารละลาย TE buffer [10 mM Tris-base pH 8.0, 1 mM
EDTA] ปริมาตร 40 µl และกําจัด RNA ดวยเอนไซม RNase A ความเขมขน 10 มิลลิกรัมตอมล.
(mg/ml) บมที่อุณหภูมิหอง เปนเวลา 30 นาที เก็บสารละลายดีเอ็นเอไวที่อุณหภูมิ –20 ๐ ซ จนกวาจะ
นําไปใช
การเพิ่มปริมาณ DNA ดวยเทคนิค PCR
นําเอา genomic DNA เชื้อรา 15 ไอโซเลต (Fol 1, Fol 2, Fol 3N, Fol 3A, KK1, KK2, KK3,
KK4, KK5, KK6, CM1, CM2, CM3, KS, PP1) มาเพิ่มปริมาณ DNA ดวยเทคนิค RAPD ตามวิธีการ
การประชุมวิชาการอารักขาพืชแหงชาติ ครั้งที่ 9 299

ของ มนัสวี และคณะ (2548) โดยใชไพรเมอร Operon Kit C (OPC) จํานวน 20 ชุด และ OPE จํานวน
10 ชุด ในปฏิกิริยา PCR ทั้งหมด 25 µl ประกอบไปดวย Taq polymerase (Promega) (5 unit/µl)
จํานวน 1 µl, 10 X Taq buffer 2.5 µl, dNTPs (0.25 mM) จํานวน 2 µl, ไพรเมอร (100 ρMol/µl)
จํานวน 2 µl, MgCl 2 (25 mM) จํานวน 2 µl และ genomic DNA (100 ng/µl) จํานวน 5 µl ปรับปริมาตร
ใหได 25 µl ดวยน้ํากลั่นนึ่งฆาเชื้อ นําไปเขาเครื่อง Thermal cycle โดยใชชวงอุณหภูมิ ดังนี้ ขั้นที่ 1
pre-denatured อุณหภูมิ 94 ๐ ซ เปนเวลา 1 นาที จํานวน 1 รอบ, ขั้นที่ 2 denatured อุณหภูมิ 94 ๐ ซ เปน
เวลา 1 นาที, annealing อุณหภูมิ 36 ๐ ซ เปนเวลา 1 นาที, extension อุณหภูมิ 72 ๐ ซ เปนเวลา 1 นาที
จํานวน 40 รอบ และ ขั้นที่ 3 extension อุณหภูมิ 72 ๐ ซ เปนเวลา 2 นาที จํานวน 1 รอบ
ตรวจวิเคราะหผลการเพิ่มปริมาณชิ้นสวน DNA โดยการนํา PCR product ปริมาตร 5 µl ผสม
กับ loading dye 2 µl นํามาแยกขนาดบน 2% agarose gel electrophoresis ภายใตสภาพ 0.5 X TBE
[1X TBE: 89 mM Tris-base, 89 boric acid และ 2 mM EDTA] ที่กระแสไฟฟา 100 โวลต เปนเวลา 50
นาที แลวจึงนํา gel ไปยอมดวย ethidium bromide (EtBr) นาน 10 นาที นําไปลาง EtBr โดยการแชใน
น้ําสะอาด 2 ครั้ง ครั้งละ 5 นาที หลังจากนั้นนํา gel ไปตรวจสอบชิ้นสวน DNA ดวยเครื่อง Gel
documentation (GENE GENIUS bio imaging system)
3.2 การสกัด DNA ออกจาก gel โดยการละลาย
เลือกแถบ DNA ที่ไดจากการเพิ่มปริมาณดวยเทคนิค RAPD โดยเลือกแถบที่ปรากฏเฉพาะใน
ไอโซเลตที่ทําใหเกิดโรคเหี่ยวเหลืองในมะเขือเทศเทานั้น จากนั้นทําการตัดแถบ DNA ที่เลือก และ
ละลาย ออกจาก gel โดยใช QIAquick Gel Extracton Kit (QIAGEN) นํา DNA ที่ไดไปตรวสอบใน
agarose gel electrophoresis เพื่อยืนยันวาได DNA เปาหมาย แลวนําไปวัดคา OD เพื่อหาความเขมขน
สง DNA ที่ไดไปหาลําดับนิวคลีโอไทด โดยใชบริการจากหนวยบริการชีวภาพ (BSU) ศูนยพันธุ
วิศวกรรม และเทคโนโลยีชีวภาพแหงชาติ
3.3 การออกแบบไพรเมอรและการสังเคราะหไพรเมอร
นําขอมูลลําดับนิวคลีโอไทดที่ไดมาออกแบบไพรเมอรโดยใชโปรแกรม CLC Genomics
Workbench 3 โดยกําหนดคาความยาวเบส 18-20 เบส แลวสังเคราะหไพรเมอรตามลําดับลําดับนิวคลี
โอไทดที่ออกแบบโดยใชบริการจากบริษัท BioDesign Co., Ltd
3.4 การทดสอบความจําเพาะเจาะจงของ SCAR primer
นํา DNA ของเชื้อราทั้งหมด 28 ไอโซเลต จากTable 1 มาเพิ่มปริมาณ DNA ดวย SCAR
primers ที่ไดออกแบบไว ในปฏิกิริยา PCR ทั้งหมด 25 µl ประกอบไปดวย Taq polymerase
(Promega) (5 unit/µl) จํานวน 0.4 µl, 10 X Taq buffer 2.5 µl, dNTPs (0.25 mM) จํานวน 2 µl, ไพร
เมอร (100 ρMol/µl) จํานวน 1 µl, MgCl 2 (25 mM) จํานวน 0.75 µl และ genomic DNA (100 ng/µl)
จํานวน 5 µl ปรับปริมาตรใหได 25 µl ดวยน้ํากลั่นนึ่งฆาเชื้อ นําไปเขาเครื่อง Thermal cycle
(Biometra ® รุน Tpersonal) โดยใชชวงอุณหภูมิ ดังนี้ ขั้นที่ 1 pre-denatured อุณหภูมิ 94 ๐ ซ เปนเวลา
300 24-26 พฤศจิกายน 2552 โรงแรมสุนีย แกรนด จังหวัดอุบลราชธานี

3 นาที จํานวน 1 รอบ, ขั้นที่ 2 denatured อุณหภูมิ 94 ๐ ซ เปนเวลา 1 นาที, annealing อุณหภูมิ 56 ๐ ซ
เปนเวลา 1 นาที, extension อุณหภูมิ 72 ๐ ซ เปนเวลา 1 นาที จํานวน 30 รอบ และ ขั้นที่ 3 extension
อุณหภูมิ 72 ๐ ซ เปนเวลา 10 นาที จํานวน 1 รอบ
ตรวจวิเคราะหผลการเพิ่มปริมาณชิ้นสวน DNA โดยการนํา PCR product ปริมาตร 5 µl ผสม
กับ loading dye 2 µl นํามาแยกขนาดบน 2% agarose gel electrophoresis ภายใตสภาพ 0.5 X TBE
[1X TBE: 89 mM Tris-base, 89 boric acid และ 2 mM EDTA] ที่กระแสไฟฟา 100 โวลต เปนเวลา 50
นาที แลวจึงนํา gel ไปยอมดวย ethidium bromide (EtBr) นาน 10 นาที นําไปลาง EtBr โดยการแชใน
น้ําสะอาด 2 ครั้ง ครั้งละ 5 นาที หลังจากนั้นนํา gel ไปตรวจสอบ DNA ดวยเครื่อง Gel documentation
(Gene Genius Imaging System)
ผลการวิจัย
1. ความสามารถในการทําใหพืชเกิดโรคของเชื้อรา Fol
เชื้อรา Fol 19 ไอโซเลต ที่นํามาทดสอบ คือ ไอโซเลต Fol 1, Fol 2, Fol 3N, Fol 3A, KK1,
KK2, KK3, KK4, KK6, CM2, NK1, NK2, SN1 และ SN2 ที่ทําใหเกิดโรคกับมะเขือเทศพันธุสีดา และที่
เหลืออีก 5 ไอโซเลต คือ KK5, CM1, CM3, KS และ PP1 ไมทําใหเกิดโรคกับมะเขือเทศพันธุสีดา (Fig.
1) เมื่อเปรียบเทียบกับกรรมวิธีควบคุม (ตนมะเขือเทศที่ไมปลูกเชื้อรา Fol)
Control Fol 1 Control Fol 2 Control Fol 3N
Control KK1 Control KK2 Control KK6
Control CM 1 Control CM 2 Control CM 3
Fig. 1 Wilt symptoms of tomato (Sida cultivar) after 15 days of inoculation with Fusarium oxysporum F.sp.
lycopersici isolates Fol 1, Fol 2, Fol 3N, KK1, KK2, KK6, CM1, CM2 and CM3 (right) compared with no
inoculation (left).
การประชุมวิชาการอารักขาพืชแหงชาติ ครั้งที่ 9 301

2. การศึกษารูปแบบลายพิมพ DNA ของเชื้อรา ดวยเทคนิค RAPD-PCR
จากการเพิ่มปริมาณ DNA ของเชื้อรา Fol 15 ไอโซเลต ดวยไพรเมอร OPC และ OPE นั้น
พบวาการเพิ่มปริมาณ DNA ดวยไพรเมอร OPC-04 และ OPE-09 จะพบแถบ DNA ขนาด 520 bp (Fig.
2A) และ 800 bp (Fig. 2B) ตามลําดับ ซึ่งเปนแถบ DNA ที่พบเฉพาะในเชื้อรา Fol ไอโซเลตที่ทําใหเกิด
โรคเหี่ยวเหลืองในมะเขือเทศเทานั้น
3000 bp
1500 bp
1000 bp
800 bp
500 bp
300 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 C
500
A
3000 bp
1500 bp
1000 bp
800 bp
500 bp
300 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 4 15 C
800
Fig. 2 DNA fingerprints of Fusarium oxysporum F.sp. lycopersici amplified with primers OPC-04
(A) and OPE-09 (B), lane M, 100 bp ladder, lane 1-28 are Fol 1, Fol 2, Fol 3N, Fol 3A,
KK1, KK2, KK3, KK4, KK5, KK6, CM1, CM2, CM3, KS, and PP1, respectively, lane C, negative control.
3. การทดสอบความจําเพาะเจาะจงของ SCAR primer
จากเลือกแถบ DNA ขนาด 500 bp และ 800 bp จากไพรเมอร OPC-04 และ OPE-09
ตามลําดับ นําไปหาลําดับนิวคลีโอไทด และออกแบบไพรเมอร แลวนําไพรเมอรที่ไดนั้นมาทดสอบความ
เจาะจงกับเชื้อรา Fol 19 ไอโซเลต (Fol 1, Fol 2, Fol 3N, Fol 3A, KK1, KK2, KK3, KK4, KK5, KK6,
CM1, CM2, CM3, KS, PP1, NK1, NK2, SN1 และ SN2) และ Fusarium spp. ชนิดอื่นอีก 9 ไอโซเลต
(F. oxysporum F.sp. melonis, F. oxysporum F.sp. cucumerinum, F. moniliforme, F. poae, F.
solani, Fu1, Fu5, Fu6 และ Fu13) พบวาไพรเมอรที่ออกแบบจาก DNA ขนาด 800 bp คือไพรเมอร
FolPF (Forward primer) 5’-GCG-AAC-CCG-AAG-CTA-CAA-3’ FolPR (Reverse primer) 5’-CGT-
302 24-26 พฤศจิกายน 2552 โรงแรมสุนีย แกรนด จังหวัดอุบลราชธานี
B

CAG-TGG-GAT-AGG-TCT-3’ มีความจําเพาะจงกับเชื้อรา Fol ไอโซเลตที่เกิดโรคเหี่ยวเหลืองกับมะเขือ
เทศ โดยจะพบแถบ DNA เพียงแถบเดียวขนาดประมาณ 378 bp ในเฉพาะไอโซเลตที่เกิดโรคเหี่ยว
เหลืองกับมะเขือเทศเทานั้น (Fig. 3)
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 M 16 17 18 19 20 21 22 23
1000 bp
700 bp
500 bp
400 bp
300 bp
378
Fig. 3 DNA fingerprints of Fusarium oxysporum F.sp. lycopersici amplified with primers FolPF and
FolPR, lane M, 100 bp ladder, lane 1-28 are Fol 1, Fol 2, Fol 3N, Fol 3A, KK1, KK2, KK3,
KK4, KK5, KK6, CM1, CM2, CM3, KS, PP1 NK1, NK2, SN1, SN2, F. oxysporum F.sp. melonis,
F. oxysporum F.sp. cucumerinum, F. moniliforme, F. poae, F. solani, Fu1, Fu5, Fu6
and Fu13, respectively, lane C, negative control.
สรุปและวิจารณ
จากการทดสอบความสามารถในการทําใหพืชเกิดโรคของเชื้อรา Fol โดยการนําสารแขวนลอย
สปอรของเชื้อรา Fol ปริมาณสปอรเทากับ 1X10 6 สปอร/มล. ไปปลูกเชื้อกับตนกลามะเขือเทศพันธุสีดา
อายุ 20 วัน พบวาเชื้อรา Fol ที่นํามาทดสอบมี 14 ไอโซเลต คือ Fol 1, Fol 2, Fol 3N, Fol 3A, KK1,
KK2, KK3, KK4, KK6, CM2, SN1, SN2, NK1 และ NK2 ทําใหเกิดโรคเหี่ยวเหลืองในมะเขือเทศพันธุสี
ดา และที่เหลืออีก 5 ไอโซเลต คือ KK5, CM1, CM3, KS และ PP1 ไมทําใหเกิดโรคเหี่ยวเหลืองใน
มะเขือเทศพันธุสีดา เมื่อเปรียบเทียบกับกรรมวิธีควบคุม (control treatment) ซึ่งผลการทดลองในครั้งนี้
ใหผลตรงกันกับการทดลองของ Bunyatratchata et al. (2005) ซึ่งเปนการยืนยันผลของความสามารถใน
การทําใหเกิดโรคเหี่ยวเหลืองในมะเขือเทศของเชื้อที่นํามาทดสอบครั้งนี้
สําหรับการพัฒนา SCAR primer สําหรับตรวจสอบเชื้อรา Fusarium oxysporum F.sp.
lycopersici (Fol) สาเหตุโรคเหี่ยวเหลืองของมะเขือเทศนั้น พบวาไพรเมอร FolPF และ FolPR ที่ได
ออกแบบจากลําดับนิวคลีโอไทดของ DNA ขนาด 800 bp ซึ่งไดจากการเพิ่มปริมาณ DNA ดวยไพร
เมอร OPE-09 นั้น มีความจําเพาะเจาะจงกับเชื้อรา Fol ไอโซเลตที่เกิดโรคเหี่ยวเหลืองกับมะเขือเทศ
โดยเมื่อนําไพรเมอร FolPF และ FolPR เพิ่มปริมาณ DNA ของเชื้อรา Fol 19 ไอโซเลต และเชื้อรา
Fusarium spp. 9 ไอโซเลต พบวาไพรเมอรดังกลาวสามารถเพิ่มปริมาณไดเฉพาะกับ DNA ของเชื้อรา
Fol ไอโซเลตที่เกิดโรคเหี่ยวเหลืองในมะเขือเทศเทานั้น โดยพบแถบ DNA ขนาดประมาณ 378 bp ผล
การศึกษาครั้งนี้ไดผลที่สามารถนําไปใชในการตรวจสอบเชื้อสาเหตุโรคเหี่ยวเหลืองในมะเขือเทศที่มี
ความแมนยําสอดคลองกับการตรวจสอบกับพืชอาศัย โดยที่ SCAR primer สําหรับตรวจสอบเชื้อรา Fol
การประชุมวิชาการอารักขาพืชแหงชาติ ครั้งที่ 9 303

นี้เปนวิธีที่มีความแมนยําสูงเชนเดียวกันมีรายงานการใช SCAR marker ในการตรวจสอบเชื้อราสาเหตุ
โรคเหี่ยว เชนการ ตรวจสอบเชื้อ Fusarium oxysporum F.sp. phaseoi (Alves-Santos et al., 2002)
กิตติกรรมประกาศ
ขอขอบคุณศูนยเทคโนโลยีชีวภาพเกษตร มหาวิทยาลัยรวม มหาวิทยาลัยขอนแกน และ
ศูนยวิจัยเทคโนโลยีชีวภาพทางการเกษตร เพื่อเศรษฐกิจที่ยั่งยืน รวมทั้งศูนยพันธุวิศวกรรมและ
เทคโนโลยีชีวภาพที่ใหทุนสนับสนุนในการทําวิจัย และคุณรภีพร หีบแกว ที่ไดใหความอนุเคราะหเชื้อรา
Fol ไอโซเลต NK1 และ NK2
เอกสารอางอิง
เกียรติเกษตร กาญจนพิสุทธิ์. 2541. มะเขือเทศ. ฐานเกษตรกรรม. กรุงเทพฯ.
วัชริน มีรอด. 2548. สหภาพยุโรปยักษใหญแหงวงการเมล็ดพันธุ. คนเมื่อ 28 พฤษภาคม 2551, จาก
http://www.biotec.or.th/policy/home/european.asp
มนัสวี ฉายผาด, วีระศักดิ์ ศักดิ์ศิริรัตน, และ พรเทพ ถนนแกว. 2548. การพัฒนาวิธีการทางชีวโมเลกุล
เพื่อบงชี้ race ของเชื้อ Fusarium oxysporum F. sp. lycopersici สาเหตุโรคเหี่ยวเหลืองของ
มะเขือเทศ. แกนเกษตร 33 (2): 108-123.
Agrios, G. N. 2005. Plant pathology 5 th ed. Academic Press, Inc., New York.
Alexander, L. J. and C. M. Tucker, 1945. Physiologic specialization in the tomato wilt fungus
Fusarium oxysporum F.sp. lycopersici. J. Agric. Res. 70: 303 – 313.
Booth, C. 1971. The genus Fusarium. Commonwealth Mycological Institute, Kew, Surrey,
England.
Bost, S. C. 2001. First report of Fusarium oxysporum F.sp. lycopersici race 3 on tomato in
Tennessee. Plant Disease 85: 802.
Bunyatratchata, W., W. Saksirirat, P. Sirithorn and P. Teerakupisut 2005. Race identification of
Fusarium with pathogen of tomato, Fusarium oxysporum F. sp. lycopersici by
pathogenic reaction on standard differential host and development of Thai differential
host. Khon Kaen Agri. J. 33: 95 – 107.
Cai, G., L. R. Gale, R. W. Schneider, H. C. Kistler, R. M. Davis, K. S. Elias and E. M. Miyao.
2003. Origin of race 3 of Fusarium oxysporum F.sp. lycopersici at a single site in
California. Phytopathology 93: 1014 – 1022.
Chellemi, D. O., H. A. Dankers, and B. Crosier 1992. First report of Fusarium oxysporum F. sp.
lycopersici race 3 on tomato in northwest Florida and Georgia. Pl. Dis. 76: 861.
Davis, R. M., K. A. Kimble, and J. J. Farrar, 1988. A third race of Fusarium oxysporum F. sp.
lycopersici identified in California. Pl. Dis. 72: 453.
304 24-26 พฤศจิกายน 2552 โรงแรมสุนีย แกรนด จังหวัดอุบลราชธานี

Doyle, J. J. and J. L. Doyle, 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh
leaf tissue. Phytochemical Bulletin 19:11 – 15.
Grattidge, R. and R. G. O’Brien, 1982. Occurrence of a third race of Fusarium wilt of tomatoes
in Queensland. Pl. Dis. 66 :165 – 166.
Marlatt, M. L., J. C. Correll, P. Kaufmann and P. E. Cooper, 1996. Two genetically distinct
population of Fusarium oxysporum F.sp. lycopersici race 3 in the United States. Pl.
Dis. 80:1336 – 1342.
Reis, A., H. Costa, , L.S. Boiteux and C.A. Lopes, 2005. First report of Fusarium oxysporum F.
sp. lycopersici race 3 on tomato in Brazil. Fitopatol. Brasil. 30:426-428.
Valenzuela-Ureta, J. G., D. A.Lawn, R. F. Heisey, and V. Zamudio-Guzman, 1996. First report
of Fusarium wilt race 3, caused by Fusarium oxysporum F.sp. lycopersici, of tomato
in Mexico. Pl. Dis. 80: 105.
Volin, R. B. and J. P. Jones, 1982. A new race of Fusarium wilt of tomato in Florida and
sources of resistance. Proc. Fla. State Hortic. Soc. 95: 268 – 270.
Windels, C.E. 1992. Fusarium. In: Methods for research on soil borne phytopathogenic fungi.
L.L. Singleton, I.D. Mihail and C.M. Rush (Eds.) APS Press, St. Paul, Minnesota.
การประชุมวิชาการอารักขาพืชแหงชาติ ครั้งที่ 9 305