Bacillus - ศูนย์เทคโนโลยีชีวภาพเกษตร

4.2 การสรางเอนไซมคลูแคเนส (β-1,3-1,4- glucanase)วางกระดาษกรองที่จุมลงในสารแขวนลอยแบคทีเรีย บนอาหาร Luria agar ผสม 0.05%Lichenan จากนั้นนําจานอาหารไปบมที่อุณหภูมิหองเปนเวลา 18 ชม. แลวตรวจผลโดยการเท 0.1%Congo red ลงบนจานอาหารเลี้ยงเชื้อ ทิ้งไว 5 นาที จากนั้นทําการวัดขนาดวงใสรอบๆแผนกระดาษกรองและบันทึกผลแลวทําการวิเคราะหทางสถิติTable 1 Antagonistic activity of Bacillus spp. isolates to phytopathogenic fungiAntagonisticactivity ofBacillus spp.Isolates*Phytophth Didymella Macrophominora capsic bryoniae a phaseolinaPhytopathogenic fungiCollectotrichumgloeosporioidesRemark : + = antagonistic - = non antagonistic *ND = no date available** = personal communicationผลการทดลองC. capsiciFusariumoxysorium f.sp.lycopersici1. การจําแนกระดับสกุลของแบคทีเรีย Bacillus spp. ดวยการใชเทคนิค PCRSclerotiumrolfsiiRhizoctoniasolaniBSR032 - + ND + + - + +BSR003 - + ND + - - - +BFP011 + - ND + + + + -BRR026 + - ND + + + - -BRR031 + + ND + + + - +BRR035 + - ND + + + - +BSR025 - - ND + - - - +BRS038 + - ND + + + + +B083 + + + + + - - -B006 - - + - - - - -B076 + + + + + + - +Referenceปทมวรรณ(2551)**นิตยา(2549)นาตยา (2545) นิตยา (2549)ปทมวรรณ(2551)**นิตยา (2549) นิตยา (2549)นิตยา (2549)1.1 สกัด genomic DNA ของแบคทีเรีย Bacillus spp.การสกัด genomic DNA ของแบคทีเรีย Bacillus spp. ดัดแปลงตามกรรมวิธีของ นิตยา(2549) นําไปตรวจสอบคุณภาพและหาปริมาณ DNA โดยวัดคาการดูดกลืนแสงดวยเครื่องสเปคโตรโฟโตมิเตอรที่ความยาวคลื่น 260 และ 280 นาโนเมตร พบวา DNA ที่สกัดไดมีอัตราสวนระหวางคาดูดกลืนแสงอยูในชวง 1.7-1.9 ซึ่งเปน genomic DNA ที่สะอาดและจากการตรวจสอบคุณภาพของ DNAดวย gel electrophoresis บน 1% agarose gel พบวา genomic DNA ที่สกัดไดมีคุณภาพ ไมมีการแตกหัก แถบ DNA มีความสวางชัดจน เหมาะสมสําหรับนําไปใชในการทดลองตอไป268 24-26 พฤศจิกายน 2552 โรงแรมสุนีย แกรนด จังหวัดอุบลราชธานี

1.2 การเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอของแบคทีเรีย Bacillus spp.Genomic DNA ที่สกัดไดจากแบคทีเรีย Bacillus spp.จํานวน 11 ไอโซเลต และแบคทีเรียBacillus มาตรฐาน จํานวน 5 สกุล เมื่อนํามาเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอดวยไพรเมอร Bsub 5F และ Bsub 3Rพบวามีชิ้นสวนดีเอ็นเอขนาด 595 bp. ทั้งจํานวน 11 ไอโซเลตและแบคทีเรีย Bacillus มาตรฐาน 3 สกุลไดแก ไอโซเลต BSR032 , BSR003, BFP011, BRR026, BRR031, BRR035, BSR025, BRS 38,B006, B076, B083, B. subtilis, B. licheniformis และ B. firmus, ยกเวนไอโซเลต B. cereus, B.circulans (Fig. 1 A,B) (Table 2)2. การจําแนกระดับสกุลของแบคทีเรีย Bacillus spp. ดวยการใชระบบ Biologจากการศึกษาการจําแนกแบคทีเรีย Bacillus spp.จํานวน 11 ไอโซเลต และแบคทีเรีย Bacillusspp. มาตรฐาน จํานวน 5 สกุล ดวย Biolog Microlog System, Release 4.2 ผลแสดงวา ไอโซเลตBSR025, BRS 038 จําแนกสกุลเปน B.pumilus, ไอโซเลต BSR003, BFP011, BRR026, BRR031,BRR035, BRR035 จําแนกสกุลเปน B.licheniformis, ไอโซเลต B083, B.006, B.076 จําแนกสกุลเปนB.subtilis, และไอโซเลต BSR 032 จําแนกสกุลเปน B.firmus และแบคทีเรีย Bacillus spp.มาตรฐานทั้ง 5 สกุล จําแนกเปนสกุลตามระบุไว (Table 2)Table 2 Species identification of Bacillus spp. isolates antagonistic to phytopathogenic fungiby PCR and Biolog SystemNo. Isolates PCR product* Result of Biolog system1. B.cereus (TISTR 687) - B.cereus2. B.circulans (TISTR 907) - B.circulans3. B.firmus (TISTR 1876) + B.firmus4. B.licheniformis (TISTR 1109) + B.licheniformis5. B.subtilis (TISTR 008) + B.subtilis6. BSR 032 + B.firmus7. BSR 003, BFP 011, BRR 026, BRR + B.licheniformis031 and BRR 0358. BSR025 and BRS 038 + B.pumilus9. B006, B076 and B083 + B.subtilisRemark : + = Amplification of 595 bp. DNA fragment - = No amplification of 595 bp. DNA fragmentการประชุมวิชาการอารักขาพืชแหงชาติ ครั้งที่ 9 269

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9M 1 2 3 4 5500 bp.ABFig. 1 Agarose gel electrophoresis of DNA fragment obtained of Bacillus spp. UsingPrimer Bsub 5F และ Bsub 3R (A: Lane M. Marker 100 bp., 1. BRS038, 2. BSR003, 3.B083, 4. B006, 5. BSR032, 6. B.subtilis(TISTR 008), 7. B.circulans(TISTR 907), 8.B.licheniformis (TISTR 1109), 9. B.firmus (TISTR 1876), 10. B cereus (TISTR 687), 11.BRR026, 12. Water B: Lane : M. Marker 100 bp., 1. BFP011, 2. B076, 3. BRR035, 4.BSR025, 5. B.subtilis (TISTR 008), 6. BRR031, 7. Water )3. การทดสอบความสามารถในการสรางเอนไซมบนอาหารแข็ง3.1 การสรางเอนไซมไคติเนส (chitinase)เมื่อนําแบคทีเรีย Bacillus spp. จํานวน 11 ไอโซเลต มาทําการทดสอบการสรางเอนไซมไคติเนส บนอาหาร chitinase- detection agar (CHDA) ที่มี colloidal chitin 0.3%เปนสวนประกอบ พบวามีวงใสรอบกระดาษกรองจุมสารแขวนลอยแบคทีเรียจํานวน 6 ไอโซเลต แสดงวาแบคทีเรีย Bacillusspp. ทั้ง 6ไอโซเลต สามารถสรางเอนไซมไคติเนส ซึ่งไดแก B.licheniformis BRR031, BRR026,BSR003, B.firmus BSR032, B.pumilus BRS025 และ B.subtilis B076 เมื่อทําการวิเคราะหทางสถิติสามารถแบงเปนกลุมตามคาความแตกตางกันทางสถิติได 6 กลุม ดังนี้ 1) กลุม a ไดแก B.licheniformisBRR 031 2) กลุม ab ไดแก B.licheniformis BRR026 และ B.firmus BSR 032 3) กลุม b ไดแกB.pumilus BRS025 4) กลุม bc ไดแก B.licheniformis BSR 003 5) กลุม d ไดแก B.subtilis B076และ 6) กลุม e ไดแก B.licheniformis BRR035, BFP011, B.pumilus BRS038, B.subtilis B006,B083 (Table 3)3.2 การสรางเอนไซม β-1,3-1,4- glucanaseเมื่อนําแบคทีเรีย Bacillus spp. จํานวน 11 ไอโซเลต มาทําการทดสอบการสรางเอนไซม β-1,3-1,4- glucanase บนอาหาร Luria agar ผสม 0.1% Lichenan โดยตรวจวัดวงใส พบวามีวงใสรอบกระดาษกรองที่จุมสารแขวนลอยแบคทีเรีย จํานวน 7 ไอโซเลต ไดแก B.licheniformis BFP011, BRR031, BRR035, BSR003, B.firmus BSR032, B.pumilus BRS038 และ B.subtilis B076 ซึ่งสามารถแบงเปนกลุมตามคาความแตกตางกันทางสถิติได 5 กลุม ดังนี้ 1) กลุม a ไดแก B.licheniformis270 24-26 พฤศจิกายน 2552 โรงแรมสุนีย แกรนด จังหวัดอุบลราชธานี

BFP011 2) กลุม b ไดแก B.licheniformis BRR 031 3) กลุม c ไดแก B.licheniformis BRR035, BSR003 และ B.firmus BSR 032 4) กลุม d ไดแก B.pumilus BRS038 และ B.subtilis B006 5) กลุม eไดแก B.licheniformis BRR026, B.pumilus BRS025 และ B.subtilis B076 และ B083 (Table 3)Table 3 Clear zone of Bacillus spp. isolates to produce chitinase and β-1, 3-1, 4 glucanaseon the mediumIsolateclear zone on medium (cm.)chitinase a β-1, 3-1, 4 glucanase aB. licheniformis BRR026 2.1 ab 0 eB. licheniformis BRR031 2.3 a 1.5 bB. licheniformis BRR035 0 e 1.4 cB. licheniformis BFP011 0 e 1.6 aB. licheniformis BSR003 1.8 bc 1.4 cB. pumilus BRS038 0 e 1.2 dB. pumilus BRS025 1.9 b 0 eB. firmus BSR032 2.1 ab 1.4 cB. subtilis B006 0 e 1.2 dB. subtilis B076 1.3 d 0 eB. subtilis B083 0 e 0 eCV (%) 14.2 2.9a = average of 3 replication= Different letters in the same column indicated significant difference at p = 0.5สรุปและวิจารณผลการทดลองจากการจําแนกแบคทีเรีย Bacillus spp. จํานวน 11 ไอโซเลตที่เปนปฏิปกษตอเชื้อราสาเหตุโรคพืช ดวยเทคนิคทางดาน PCR ดวยไพรเมอร Bsub 5F และ Bsub 3R สามารถจําแนกแบคทีเรียBacillus spp. ไอโซเลตตางๆ รวมทั้งสกุลเปรียบเทียบที่เปนแบคทีเรีย Bacillus spp. ที่อยูในกลุมBacillus subtilis ซึ่งสอดคลองกับการศึกษาของ Wattiau et al., (2001) และงานวิจัยของ Ash etal.,(1991)ที่ใช 16S rRNA ในการจัดกลุมสกุลตางๆของแบคทีเรีย Bacillus spp. สวนการจัดจําแนกดวยระบบ Biolog สามารถจําแนกแบคทีเรีย Bacillus spp. จํานวน 11 ไอโซเลต เปน 4 สกุลไดแกB.firmus, B.licheniformis, B.pumilus และ B.subtilis ซึ่ง Ash et al.,(1991) จัดอยูในกลุมเดียวกันกับBacillus subtilis ทําใหการจําแนกทั้งสองวิธีสอดคลองกันและสามารถนําเทคนิคทาง PCR นี้ไปตรวจขั้นตนและพัฒนาไปเปนวิธีการจัดจําแนกที่ระดับเฉพาะมากกวาขึ้นไดโดยการหาลําดับนิวครีโอไทน(nucleotide)ของแบคทีเรีย Bacillus spp. ไอโซเลตตางๆแลวนําไปเปรียบเทียบกับฐานขอมูลของGenBank ซึ่งจะเปนการพัฒนางานวิจัยในขั้นตอไปการประชุมวิชาการอารักขาพืชแหงชาติ ครั้งที่ 9 271

สวนการทดสอบการสรางเอนไซมไคติเนสและ เอนไซม β-1,3-1,4- glucanase แบคทีเรียBacillus spp.ไอโซเลตที่มีความสามารถในการสรางเอนไซมทั้งสองชนิดไดแก ไอโซเลต B.licheniformisBRR031, B. licheniformis BSR003 และ B. firmus BSR032 สวนไอโซเลตที่ไมสามารถสรางเอนไซมทั้งสองชนิดไดคือ B. subtilis B083 เมื่อเปรียบเทียบผลการศึกษานี้กับรายงานของ Gowand Gadd (1995) เกี่ยวกับโพลิเมอร (polymer) ที่พบในผนังเซลลของเชื้อรากับผลการศึกษาที่ผานมาใน Table 1 B. licheniformis BRR031 สามารถคัดเลือกเปนไอโซเลตที่มีความสามารถในการสรางเอนไซมไคติเนสและ เอนไซม β-1,3-1,4- glucanase ไปใชในการเปนแบคทีเรียปฏิปกษตอเชื้อราสาเหตุโรคพืชที่มีประสิทธิภาพตอไปไดคําขอบคุณงานวิจัยนี้ไดรับการสนับสนุนสวนหนึ่ง จาก ศูนยความเปนเลิศดานเทคโนโลยีชีวภาพเกษตรสํานักพัฒนาบัณฑิตศึกษาและวิจัยดานวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี สํานักงานคณะกรรมการการอุดมศึกษา (AG-BIO/PERDO-CHE) กระทรวงศึกษาธิการและศูนยวิจัยเทคโนโลยีชีวภาพทางการเกษตรเพื่อเศรษฐกิจที่ยั่งยืน มหาวิทยาลัยขอนแกนเอกสารอางอิงกฤติกา จันทรางศุ .2549. การจําแนกความแตกตางทาง phenotype และ genotype ของแบคทีเรียBacillus spp.ที่เปนปฏิปกษตอเชื้อสาเหตุโรคพืช.วิทยานิพนธปริญญาวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต สาขาโรคพืชวิทยา มหาวิทยาลัยขอนแกน.นิตยา สุขทวี .2549. การโคลนยีนไคติเนสจากเชื้อ Bacillus spp. ที่เปนปฏิปกษตอเชื้อสาเหตุโรคพืช.วิทยานิพนธปริญญาวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต สาขาโรคพืชวิทยา มหาวิทยาลัยขอนแกน.นาตยา ขนันไทย. 2545. ประสิทธิ์ภาพของเชื้อแบคทีเรียปฏิปกษตอการควบคุมเชื้อราMacrophomina phaseolina (Tassi) Goid สาเหตุโรคเนาดําในถั่วเหลือง ถั่วเขียว และงา.วิทยานิพนธปริญญาวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต สาขาโรคพืชวิทยา มหาวิทยาลัยขอนแกน.พิศาล ศิริธร. 2551. การใชแบคทีเรีย Bacillus ควบคุมโรคพืชในระบบการผลิตพืชที่ยั่งยืน.โรคพืช มข.ปริทรรศน. สาขาโรคพืชวิทยา ภาควิชาพืชศาสตรและทรัพยากรการเกษตร คณะเกษตรศาสตร มหาวิทยาลัยขอนแกน.Ash Carol, J.A.E. Farrow, Sally Wallbanks and M.D. Collins. 1991. Phylogenetic heterogeneityof the genus Bacillus revealed by comparative analysis of small-subunit-ribosomalRNA sequences. Letters Applied Microbiology 13:202-206.Baillie,L.W., M.N. Jones., P.C. Turnbull and R. J. Manchee. 1995. Evaluation of the Biologsystem for the identification of Bacillus anthracis. Lett Appl Microbiol 20(4):209-11.272 24-26 พฤศจิกายน 2552 โรงแรมสุนีย แกรนด จังหวัดอุบลราชธานี

Chun Se-Chul, R.W. Schneider, and Ill-Min Chung. 2003. Determination of Carbon SourceUtilization of Bacillus and Pythium Species by Biolog® Microplate Assay. Journal ofMicrobiology. 41(3):252-258.Gow, N.A.R. and G. M. Gadd. 1995. The growing fungus. Chapman and Hall.London.Jacobsen, B. J., N. K. Zidak and B. J. Larson. 2004. The role of Bacillus based biologicalcontrol agents in integrated pest management systems : plant disease.Phytopathology 94:2003-2004.Schlichting, C., C. Branger, J.M. Fournier, W. Witte, A. Boutonnier, C. Wolz, P. Goullet and G.Doring. 1993. Typing of Staphylococcus aureus by Pulsed-field gel electrophoresis,zymotyping capsular typing and phage typing: resolution of clonal relationships.Journal of Clinical Microbiology 31: 227-232.Shangkuan, Y.H., J.F.Yang, H.C. Lin and M.F. Shaio. 2000. Comparison of PCR-RFLP,ribotyping and ERIC-PCR for typing Bacillus anthracis and Bacillus cereus strains. J.Appl. Microbiol. 89: 452– 462.Van Belkum, A., R. Bax, P. Peerbooms, W.H.F. Goessens, N. Van Leeuwen, and W.G.V.Quint. (1993) Comparison of phage typing and DNA ® ngerprinting by polymerasechain reaction for discriminating methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains.Journal of Clinical Microbiology 31: 798-803.Wattiau, P.M. -E. Renard, P.Ledent, V. Debois, G. Blackman. and S.N.Agathos. 2001. A PCRtest to identify Bacillus subtilis and closely related species and its application to themonitoring of wastewater biotreatment. Appl Microbiol Biotechnol. 56:816-819.การประชุมวิชาการอารักขาพืชแหงชาติ ครั้งที่ 9 273