应用ExPASy相关工具对GCR2蛋白进行分析 - abc

第 一 部 分 预 测 跨 膜 结 构

• 作 者 最 开 始 使 用 TMpred 和 DAS 软 件 程 序 推 测GCR2 是 一 个 7 次 跨 膜 的 蛋 白 , 并 进 一 步 使 用 12种 不 同 的 软 件 程 序 (TMHMM,SOUSI 和 DASTMfilter 等 ) 去 推 测 GCR2 的 拓 扑 结 构 , 其 中 9 种显 示 GCR2 是 具 有 不 同 跨 膜 结 构 哉 的 跨 膜 蛋 白 。TMHMM 已 经 错 误 推 测 了 很 多 跨 膜 结 构 域 , 并 且拟 南 芥 中 唯 一 个 被 报 告 的 GCR1 也 是 由 SOSUI 预测 出 是 三 次 跨 膜 的 蛋 白 。 另 外 , 已 知 的 跨 膜 蛋 白中 14% 不 能 被 可 用 的 软 件 正 确 推 测 , 所 以 , 膜 蛋白 的 计 算 机 推 测 还 不 是 一 个 成 熟 的 技 术 方 法 , 而主 要 是 用 来 作 为 对 实 验 测 试 的 假 设

SOSUI(1)GCR2 平 均 疏 水 性 是 -0.257, 没 有 显 著 的 疏 水 性 ;(2) 从 图 中 可 见 ,GCR2 也 没 有 明 显 的 疏 水 性 集 中 的 区 域 , 而 疏 水 性 集 中 连 续 的 区 域可 能 是 跨 膜 结 构 ;

• 针 对 以 上 分 析 , 马 力 耕 等 人 在 《Response toComment on “A G Protein-Coupled Receptor Is aPlasma Membrane Receptor forthe Plant HormoneAbscisic Acid”》 作 者 最 开 始 使 用 TMpred 和 DAS软 件 程 序 推 测 GCR2 是 一 个 7 次 跨 膜 的 蛋 白 , 并 进一 步 使 用 12 种 不 同 的 软 件 程 序 (TMHMM,SOUSI 和 DAS TMfilter 等 ) 去 推 测 GCR2 的 拓 扑结 构 , 其 中 9 种 显 示 GCR2 是 具 有 不 同 跨 膜 结 构 哉的 跨 膜 蛋 白 。TMHMM 已 经 错 误 推 测 了 很 多 跨 膜结 构 域 , 并 且 拟 南 芥 中 唯 一 个 被 报 告 的 GCR1 也是 由 SOSUI 预 测 出 是 三 次 跨 膜 的 蛋 白 。 另 外 , 已知 的 跨 膜 蛋 白 中 14% 不 能 被 可 用 的 软 件 正 确 推 测 ,所 以 , 膜 蛋 白 的 计 算 机 推 测 还 不 是 一 个 成 熟 的 技术 方 法 , 而 主 要 是 用 来 作 为 对 实 验 测 试 的 假 设 。

PredictProteinRel_sec 行 表 示 预 测 的 准 确 性 ,* 表 示 预 测 准 确 性 高 。 而 PHD_htm 行 中 的 M 表 示 预 测 的 跨 膜螺 旋 区 域 , 共 五 个 但 都 很 短 , 并 且 都 在 预 测 准 确 性 较 低 的 地 方 出 现 。 这 个 预 测 的 结 果 不 足以 说 明 GCR2 是 否 是 跨 膜 螺 旋 蛋 白 。

DAS

• 在 原 核 生 物 中 利 用 Dense Alignment Surfacemethod 预 测 蛋 白 质 的 跨 膜 结 构 域• 如 果 按 照 严 格 的 划 分 线 , 只 有 一 个 跨 膜 结 构 域 ,按 宽 松 的 划 分 线 , 会 有 7 个 跨 膜 结 构 域 。 但 是 , 这个 是 用 于 预 测 原 核 生 物 的 软 件 , 对 于 作 为 高 等 真核 生 物 拟 南 芥 的 GCR2 蛋 白 , 可 能 并 不 准 确 , 刘 西岗 等 人 以 此 结 果 为 其 依 据 之 一 , 诚 为 不 妥 。

HMMTOP• 【 功 能 】 预 测 蛋 白 质 的 跨 膜 螺 旋 以 及 拓 扑 结 构• 【 处 理 结 果 】• Length: 410• N-terminus: OUT• Number of transmembrane helices: 0• Transmembrane helices:• Total entropy of the model: 17.0206• Entropy of the best path: 17.0212

TMAP【 功 能 】 基 于 多 序 列 比 对 监 测 蛋 白 质 的 跨 膜 结 构【 处 理 结 果 】【 结 果 分 析 】(1) 由 TMAP 预 测 出 来 , 也只 有 一 个 跨 膜 结 构 域 , 与DAS 预 测 的 那 个 跨 膜 结 构 域位 置 相 同 , 可 以 互 相 印 证 。(2)TMAP 程 序 是 通 过 两 个参 数 来 计 算 蛋 白 是 跨 膜 蛋 白的 可 能 性 的 : 第 一 个 是 蛋 白中 段 , 疏 水 性 残 基 的 比 例 ;另 一 个 参 数 是 末 端 区 域 跨 膜序 列 的 跨 度 。(3) 所 以 , 图 中 实 线 代 表 的是 蛋 白 在 中 段 形 成 跨 膜 蛋 白的 可 能 性 , 而 虚 线 表 示 在 末端 形 成 跨 膜 蛋 白 的 可 能 性 。这 些 可 能 性 , 是 针 对 于 蛋 白的 每 个 氨 基 酸 残 基 计 算 的 ,所 以 横 坐 标 表 示 残 基 的 顺 序 ,纵 坐 标 表 示 成 为 跨 膜 蛋 白 的倾 向 性 。(4) 而 图 上 方 的 黑 条 , 则 是程 序 自 己 预 测 的 最 可 能 成 为跨 膜 区 域 的 地 方 。

TMpred有 7 个 跨 膜 结 构 域 , 而 第 1、3、7 是 不 显 著 的 跨 膜 结 构 域 。

TopPred一 个 确 定 的 跨 膜 结 构 域 以 及 两 个 不 确 定 的 跨 膜 结 构 域

Summary软 件 结 果 评 注TMHMM(v2.0)无 跨 膜 结 构SOSUI 没 有 明 显 的 疏 水性 集 中 的 区 域PredictProtein 五 个 跨 膜 螺 旋 都 很 短DAS 7 6 个 不 确 定HMMTOP 0TMAP 1TMpred 7 6 个 不 确 定TOPpre 3 2 个 不 确 定

讨 论• 四 个 预 测 软 件 认 为 它 不 是 跨 膜 蛋 白 。• DAS, TMpred, TOPpre 和 TMAP 认 为 其 有跨 膜 , 但 跨 膜 数 不 定 , 尤 其 是 当 对 跨 膜 结构 的 阈 值 设 定 的 较 高 时 ,DAS, TMpred,TOPpre 认 为 它 是 一 次 跨 膜 。• 预 测 软 件 预 测 的 结 果 不 能 判 定 其 是 否 为 跨膜 蛋 白

关 于 跨 膜 结 构 预 测 软 件Moller 等 人 曾 经 比 较 过 各 种 跨 膜 预 测 软 件 (7), 一个 有 趣 的 实 验 是 他 们 用 已 经 被 SwissProt 收 录 为GPCR 的 833 个 蛋 白 测 试 各 种 软 件 , 结 果 如 下 。软 件 名 准 确 预 测 为 七 次 准 确 预 测 的 比 率跨 膜 的 个 数ALOM2 29 3%DAS 24 3%HMMTOP 712 85%MEMSAT1.5 551 66%TMHMM1.0 707 85%TMHMM2.0 711 85%

第 二 部 分 GCR2 蛋 白 的 Blast 分 析 和 motif 预 测1 blast 分 析 结 果 :对 GCR2 蛋 白 序 列 进 行 序 列 相 似 性 搜 索 , 希 望 从 中得 到 关 于 GCR2 结 构 或 功 能 的 线 索 , 不 同 搜 索 方 法blast,fasta,MPsrch 得 到 的 结 果 大 致 相 同 , 其 中大 多 数 相 似 蛋 白 功 能 尚 未 确 定 。 就 已 知 蛋 白 来 推测 GCR2 可 能 为 跨 膜 的 受 体 ( 与 GPCR 相 似 ), 也可 能 为 外 周 某 种 功 能 的 酶 ( 与 LANC/ LANClike)。而 其 他 一 些 搜 索 软 件 Propsearch 的 结 果 则更 多 提 示 GCR2 可 能 和 LANC 更 接 近 的 线 索 。

Blast• PSI-Blast---position-specific iterated blast, 位 点 特异 叠 代 比 对PSI-BLAST 的 基 本 思 路 在 于 根 据 最 初 的 搜 索 结 果 ,依 照 预 先 定 义 的 相 似 性 阈 值 将 序 列 分 成 不 同 的 组 ,构 建 一 个 位 点 特 异 性 的 序 列 谱 , 并 通 过 多 次 叠 代不 断 改 进 这 一 序 列 谱 以 提 高 搜 索 的 灵 敏 度 。 但 缺点 在 于 运 算 复 杂 , 重 复 序 列 对 结 果 有 干 扰 等 。 有研 究 表 明 这 种 方 法 可 以 有 效 的 找 到 很 多 序 列 差 异较 大 而 结 构 功 能 相 似 的 相 关 蛋 白 , 所 以 对 GCR2 尝试 此 法 。

• 默 认 参数 - 首次 检 索结 果PSI-Blast 结 果

• 2 次 检 索 结果• 但 未 得 到 新的 相 似 蛋 白( 若 有 新 蛋白 则 前 标 显示 new)

Fasta3• Fasta 的 基 本 思 路 是 识 别 与 代 查 序 列 相 匹 配的 很 短 的 序 列 片 段 , 称 为 k-tuple。 蛋 白 质 序列 数 据 库 搜 索 时 , 短 片 段 的 长 度 一 般 是 1-2个 残 基 长 。Fasta 程 序 采 用 渐 进 (heuristicapproach) 算 法 将 位 于 同 一 对 角 线 上 相 互 接近 的 短 片 段 连 接 起 来 。 也 就 是 说 , 通 过 不匹 配 的 残 基 将 这 些 匹 配 残 基 片 段 连 接 起 来 ,以 便 得 到 较 长 的 相 似 性 片 段 , 与 blast 类 似 。

Fasta3:取 代 矩 阵 选 择Blosum62 ,其 他 参 数 默认

MPsrch• MPsrch 采 用 穷 尽 算 法 来 寻 找 相 似 序 列 , 灵敏 性 比 blast,fasta 要 高 , 但 在 对 GCR2 的 检索 中 , 三 者 结 果 类 似

MPsrch 结 果 :BL62, 其 他参 数 默认

• 接 前 页 结 果

两 两 比 对 结 果 示 意• 选 取 相 似 性 高 且 功 能 已 知 的 蛋 白 显 示 具 体比 对 结 果 :

左 图 杨 树 ABA 受 体 与 GCR2 比 对 , 右 图 水 稻 LANC-like protein 与 GCR2比 对 , 图 中 * 表 示 完 全 一 致 ,./.. 表 示 含 有 保 守 氨 基 酸

2 motif 检 索应 用 ExPaSy 中 相 关 软 件 对 GCR2 进 行 motif 相 似 性 的 检 索 (Pfam,HITs, FingerPRINTSCAN, InterProscan, SMART, Propsearch)

Pfam大 规 模 蛋 白 家 族 数 据 库 , 由 Sanger 研 究 中 心 维 护 , 输 入 序 列 即 可 ,Evalue 设 为 1.0, 结 果 得 到 GCR2 中 含 有 LANC-like domain(69-410)

Pfam 中 关 于 LANC-like 的 特 征 注 释 :• Lanthionines are thioether bridges that are putatively generatedby dehydration of Ser and Thr residues followed by addition ofcysteine residues within the peptide. This family contains thelanthionine synthetase C-like proteins 1 and 2 which arerelated to the bacterial lanthionine synthetase components C(LanC). LANCL1 (P40 seven-transmembrane-domain protein)and LANCL2 (testes-specific adriamycin sensitivity protein)are thought to be peptide-modifying enzyme components ineukaryotic cells. Both proteins are produced in large quantitiesin the brain and testes and may have role in the immunesurveillance of these organs [1]. Lanthionines are found inlantibiotics, which are peptide-derived, post-translationallymodified antimicrobials produced by several bacterial strains[2]. This region contains seven internal repeats• 其 中 提 到 的 p40 也 具 有 跨 膜 结 构 ( 虽 然 有 研 究 提 出 异 议 ),所 以 单 凭 LANC-like 结 构 域 还 不 能 说 明 GCR2 不 是 GPCR

HITsmotif 搜 索 , 显 示 蛋 白 序 列 与 motif 间 的 关 系参 数 : 默 认 , 在 全 部 数 据 库 中 搜 索结 果 中 有 比 较 完 整 的 长 序 列 一 致 性 的 显 示 GCR2 的 部 分 区 域 (69-410) 与LANC 和 LANc-like domain 比 较 相 似 :

FingerPRINTSCAN根 据 motifs 的 指 纹 特 征 来 确 认 某 个 蛋 白 家 族参 数 :FPScan/FPScan-fam:e value 0.0001( 默 认 ) ;database:PRINTS39_0 ; Matrix: blos62; Distance varience 10%;结 果 如 下 , 仍 然 显 示 可 能 存 在 LANC 样 区 域

GCR2 与 原 核 ( 左 ) 真 核 ( 右 )LANC 家 族 蛋 白 的 特 征 序 列一 致 性

InterProscan整 合 PROSITE, Pfam, PRINTS and other family and domain databases 的 蛋 白 特 征 查询输 入 序 列 , 参 数 默 认 : 仍 得 到 69-410LANC-like family 相 似 序 列 , 同 时 245-363 为six-hairpin glycosidase domain 相 似 区

SMARTsimple modular architecture research tool, 一 个 综 合 的 基 因 组 和 蛋 白 结 构 功 能 预 测工 具 , 包 括 了 酶 催 化 位 点 , 多 结 构 域 预 测 , 蛋 白 相 互 作 用 预 测 , 蛋 白 无 规 则 结 构预 测 等 。 结 果 中 1-22 氨 基 酸 序 列 区 为 无 规 则 结 构 区 (fromDisEMBL);23-68 未 知 ;69-410 为 LANC-like domain(from Pfam) 图 略 ; 下 图 则 显 示 在 阈 值 一 下 还 有 一 些低 可 能 性 的 motifs

Propsearch• Sequence homology using amino acid composition.(by Uwe Hobohm and Chris Sander), 相 对 于 利 用数 据 库 中 的 蛋 白 质 序 列 的 比 对 , 该 程 序 利 用 对 蛋白 质 氨 基 酸 组 成 , 残 基 性 质 , 等 电 点 及 分 子 量 等几 十 组 性 质 来 查 找 可 能 的 同 源 蛋 白 家 族 , 该 方 法对 于 找 到 一 些 低 一 致 性 ( 如 25% 以 下 , 用 blast 无法 分 析 的 ) 蛋 白 间 的 同 源 性 有 一 定 的 帮 助 . 数 据 库中 蛋 白 和 查 询 蛋 白 均 用 向 量 表 示 ( 根 据 各 种 比 对所 需 性 质 ), 结 果 用 查 询 蛋 白 与 已 知 蛋 白 间 的 距离 (DIST) 分 组 , 距 离 越 小 表 示 同 源 性 越 高 。 如0-1.3 表 示 相 似 可 能 性 为 99.9%,1.3-7.5 可 能 性99.6%, 而 8.7-10 表 示 相 似 可 能 性 为 87%。

Propsearch 结 果 , 下 列 结 果 并 无 直 接 显 示 GCR2 与 LANC 有 相 似 结 果 ( 所用 数 据 库 和 算 法 限 制 ?), 但 从 结 果 中 蛋 白 的 性 质 看 ,GCR2 的 功 能 或 者结 构 也 可 能 更 接 近 酶 的 性 质

motif 检 索 结 果• (Pfam, HITs, FingerPRINTSCAN, InterProscan, SMART,Propsearch)• 均 得 到 GCR2 的 69-410 区 含 LANC-like 相 似 序 列

第 三 部 分 多 序 列 比 对GCR2 和 其 他 GPCR 比 对 ( 结 果 未 显 示 )最 近 报 道 了 拟 南 芥 中 的 两 个 新 的 ABA GPCR 受 体 GTG1 和GTG2(8), 他 们 同 人 的 GPR89 的 序 列 一 致 性 达 45% 和68%。 用 needle 分 析 GTG1 和 GPR89 同 GCR2 的 序 列 一 致 性为 1.8% 和 7.6%。 Pandey 等 用 PROSITE 分 析 的 GTG1/2 的 一个 序 列 特 征 GTG1 的 382–411 序 列 处 是 比 较 保 守 的 ATP-/GTP-binding region,GCR2 在 该 处 同 GTG1 有 较 高 的 保 守性 , 但 是 两 端 有 缺 失 的 序 列 。

GCR2 和 LANC 比 对乳 酸 乳 球 菌 Lanc 同 拟 南 芥的 GCR2 的 identity 为 25%,而 杨 树 的 预 测 蛋 白 同 拟 南芥 的 GCR2 的 identity 为71%。 圆 圈 标 出 了 在 乳 酸乳 球 菌 Lanc 的 结 构 中 比 较重 要 的 位 点 ,Lanc H212,R280,C284, C330,H331。 其 中 C284, C330,H331 一 致 , 但 H212,R280 不 一 致 。

第 四 部 分 搜 索 GCR2 三 维 结 构( 三 级 结 构 )• 1 iMolTalk• 【 功 能 】 搜 索 同 源 蛋 白 的 结 构• 【 程 序 路 径 】http://i.moltalk.org/• 【 输 入 参 数 】 默 认• 【 处 理 结 果 】• 【 结 果 分 析 】• (1) 找 到 同 源 性• 最 高 的 结 构 信 息 为 NisC 蛋 白 (PDB ID: 2G0D);• (2) 为 了 更 加 形 象 观 察 其 相 似 性 , 使 用 Phyre (Successorof 3D-PSSM) 软 件 进 一 步 预 测 相 三 维 结 构 的 同 源 物 。

2 Phyre (Successor of 3D-PSSM)• 【 功 能 】 通 过 轮 廓 匹 配 以 及 二 级 结 构 寻 找 三 维 结 构 类 似 的蛋 白• 【 程 序 路 径 】http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre/index.cgi• 【 输 入 参 数 】 默 认• 【 处 理 结 果 】

【 结 果 分 析 】(1) 与 iMolTalk 结 果 相 同 , 与 GCR2 相 似 度 最 高 的 蛋 白 为 c2g0dA,即 nisin biosynthesis protein nisc(NisC);(2)NisC 结 构 如 右 图 ;(3) 这 与 PDB 数 据 库 中 结 构 基 本 相 同 ;

第 四 部 分 搜 索 GCR2 三 维 结 构( 四 级 结 构 )1 GlobPlot• 【 功 能 】 预 测 蛋 白 质 序 列 中 的 紊 乱 区 、 球 蛋 白 区 等• 【 程 序 路 径 】http://globplot.embl.de/• 【 输 入 参 数 】 默 认

• Disordered by Russell/Linding definition• >none_Disorder 208-214, 263-273, 372-384• mgerffrnem pefvpedlsg eeetvteckd sltkllslpy ksfseklhry alsikdkvvw etwersgkrvrdynlytgvl gtayllfksy qvtrneddlk lclenveacd vasrdservt ficgyagvca lgavaakclgddqlydryla rfrgirlpsd lpyellygra gylwaclfln khigqesiss ermrsvveei fragrqlGNKGTCPlmyewh gkrywgaahg lagimnvlmh telepdeikd vkgtlsymiq nrFPSGNYLSSEGsksdrlv hwchgapgva ltlvkaaqvy ntkefveaam eagevvwsrg llkrvgichg isgntyvflslyrltrnpky lyrakafasf lldkseklis eGQMHGGDRP FSLFegiggm aymlldmndptqalfpgyel• Potential globular domains (GlobDoms) by Russell/Linding definition• >none_GlobDoms 2-410mGERFFRNEM PEFVPEDLSG EEETVTECKD SLTKLLSLPY KSFSEKLHRYALSIKDKVVW ETWERSGKRV RDYNLYTGVL GTAYLLFKSYQVTRNEDDLK LCLENVEACD VASRDSERVT FICGYAGVCALGAVAAKCLG DDQLYDRYLA RFRGIRLPSD LPYELLYGRAGYLWACLFLN KHIGQESISS ERMRSVVEEI FRAGRQLGNKGTCPLMYEWH GKRYWGAAHG LAGIMNVLMH TELEPDEIKDVKGTLSYMIQ NRFPSGNYLS SEGSKSDRLV HWCHGAPGVALTLVKAAQVY NTKEFVEAAM EAGEVVWSRG LLKRVGICHGISGNTYVFLS LYRLTRNPKY LYRAKAFASF LLDKSEKLIS EGQMHGGDRPFSLFEGIGGM AYMLLDMNDP TQALFPGYEL

【 结 果 分 析 】(1) 找 到 3 个 较 为 不 稳 定 的 区 域 , 即 208-214, 263-273, 372-384, 这 些 位 置 , 由 于 可 变性 , 很 可 能 参 与 该 蛋 白 的 酶 活 性 或 者 蛋 白 相 互 作 用 , 在 点 突 变 法 探 寻 蛋 白 功 能 机 制 时应 当 重 点 关 注 ;(2)2-410 为 潜 在 的 球 蛋 白 区 , 而 该 蛋 白 全 场 也 是 410 个 氨 基 酸 残 基 而 已 , 佐 证 了 关于 该 蛋 白 不 具 有 跨 膜 结 构 的 分 析 。

2 DisEMBL 1.5• 【 功 能 】 预 测 蛋 白 质 序 列 中 的 紊 乱 区 、 球 蛋 白 区 等 ,• 【 程 序 路 径 】http://i.moltalk.org/• 【 输 入 参 数 】 默 认

【 结 果 分 析 】(1)GCR2 含 有 十 多 个 loop 或 者 coil 结 构 , 说 明 其 蛋 白 多 螺 旋 , 印 证 了 之 前 对 其 球蛋 白 的 判 断 ;(2) 在 1、40、55、65、110、150、180、200、350 等 处 存 在 较 显 著 的 Hot-loops 结构 , 很 可 能 参 与 该 蛋 白 的 酶 活 性 或 者 蛋 白 相 互 作 用 , 在 探 寻 蛋 白 功 能 机 制 时 应 当 重 点关 注 。

第 五 部 分 讨 论 和 体 会GCR2 膜 结 合 G 蛋 白 偶 联 受 体 之 争• 在 拟 南 芥 中 的 一 个 标 准 的 G 蛋 白 的 通 路 是 由 一 个Gα 亚 基 、 一 个 Gβ 亚 基 和 两 个 Gγ 亚 基 组 成 的 。 这 些亚 基 在 植 物 系 统 中 研 究 得 比 较 少 , 目 前 只 有 一 个确 定 的 G 蛋 白 受 体 GCR1。• 而 刘 西 岗 等 人 为 了 证 明 GCR2 也 是 一 个 参 与 植 物 激素 ABA 代 谢 的 G 蛋 白 受 体 , 是 一 个 结 合 Gα 亚 基(GPA1) 的 蛋 白 。• 他 们 07 年 在 《A G protein-coupled receptor is aplasma membrane receptor for the plant hormoneabscisic acid》 中 提 出 了 一 系 列 证 据 。

生 物 信 息 学 方 法 预 测 (DAS 和 TMpred)Liu X, Yue Y, Li B, Nie Y, Li W, Wu WH, Ma L.A G protein-coupled receptor is a plasmamembrane receptor for the plant hormone abscisic acid.Science. 2007 315(5819): 1712-6.

DAS• 在 原 核 生 物 中 利 用 Dense Alignment Surface method 预 测 蛋 白 质 的 跨 膜 结 构 域

TMpred有 7 个 跨 膜 结 构 域 , 而 第 1、3、7 是 不 显 著 的 跨 膜 结 构 域 。

直 接 观 察 GCR2 在 植 物 根 中 的 亚 细 胞 定 位YFP 标 记 GCR2 蛋 白 (GCR2-YFP)Liu X, Yue Y, Li B, Nie Y, Li W, Wu WH, Ma L.A G protein-coupled receptor is a plasmamembrane receptor for the plant hormone abscisic acid.Science. 2007 315(5819): 1712-6.

western blotting 检 测 在 全 细 胞 、 胞 质 、 细 胞 膜 上 ,GCR2-YFP 的 分 布用 变 性 剂 和 高 pH 溶 液 洗 细 胞 , 发 现GCR2-YFP 仍 然 主 要 定 位 在 膜 组 分 上 ,证 明 GCR2 是 一 个 结 合 在 膜 上 的 蛋 白 。Liu X, Yue Y, Li B, Nie Y, Li W, Wu WH, Ma L.A G proteincoupledreceptor is a plasma membrane receptor for the planthormone abscisic acid.Science. 2007 315(5819): 1712-6.

GCR2 与 Gα 亚 基 (GPA1) 的 相 互 作 用• 为 证 明 GCR2 是 一 个 参 与 ABA 代 谢 通 路 的 G 蛋 白 受体 , 并 推 测 其 与 Gα 亚 基 存 在 相 互 作 用 , 作 者 采 用了 4 种 方 法 :• SPR assay• split-ubiquitin Y2H• 双 分 子 荧 光 共 振• Co-IP

SPR assay:GCR2 能 与 GPA1 结 合 , BSA 作 为 负 对照 不 能 与 GPA1 结 合 。Liu X, Yue Y, Li B, Nie Y, Li W, Wu WH, Ma L.A G protein-coupled receptor is a plasma membrane receptor for the planthormone abscisic acid.Science. 2007 315(5819): 1712-6.

Split-ubiquitin Y2H证 明 了 全 长 的 GCR2 与 GPA1 的 相 互 作 用 、GCR2 的 free C 端 (290-401) 与GPA1 的 相 互 作 用 , 但 是 N 端 与 GPA1 没 有 相 互 作 用 。

双 分 子 荧 光 共 振Liu X, Yue Y, Li B, Nie Y, Li W, Wu WH, Ma L.A G protein-coupled receptor is a plasma membrane receptor for the planthormone abscisic acid.Science. 2007 315(5819): 1712-6.GCR2IL-YFPC 是 将 GCR2 的 C 端 290-401 氨 基 酸 删 除 后 的 蛋 白 。 可 见 ,GCR2 与GPA1 存 在 相 互 作 用 , 但 删 除 C 端 后 就 没 有 了 相 互 作 用 , 说 明 GCR2 的 C 端 与 GPA1 发生 了 相 互 作 用 。

Co-IP assayLiu X, Yue Y, Li B, Nie Y, Li W, Wu WH, Ma L.A G protein-coupled receptor is a plasma membrane receptor for the planthormone abscisic acid.Science. 2007 315(5819): 1712-6.FLAG 是 融 合 于 GCR2 的 一 个 抗 体 标 签 。 可 见 GCR2和 GPA1 可 以 共 沉 淀 下 来 。

对 “GCR2 是 G 蛋 白 受 体 ” 的 挑 战 和 辩 护• 后 来 Johnston 等 人 在 《Comment on “A G Protein–CoupledReceptor Is a Plasma Membrane Receptor for the PlantHormone Abscisic Acid”》 中 对 其 提 出 了 质 疑 :凭 借 硅 模 型 (silica modeling) 和 生 物 信 息 学 来 推 测 GCR2既 不 是 跨 膜 蛋 白 也 不 是 G 蛋 白 偶 联 受 体 (GPCR), 而 是细 菌 羊 毛 硫 氨 酸 合 成 酶 (LanC) 的 一 个 植 物 同 源 物刘 西 岗 等 人 在 《Response to Comment on “A G Protein–Coupled Receptor Is a Plasma Membrane Receptor for thePlant Hormone Abscisic Acid”》 对 Johnston 等 人 完 全 用 生 物信 息 学 的 方 法 得 出 的 结 论 指 出 是 不 合 理 的 , 并 进 一 步 提 供出 实 验 的 证 据 支 持 自 己 的 观 点 , 即 GCR2 可 能 是 一 个 新 的G 蛋 白 偶 联 受 体 。

GCR2-YFP 融 合 蛋 白 的 定 位Fig.1 (A) GCR2 is localized in the plasma membrane in the protoplast expressing35S::GFP (top) and dex-inductive promotor::GCR2-YFP (bottom). I, YFP fluorescence; II,chloroplast fluorescence; III, bright field; IV,merge of I and II. (B) GCR2 is predominantlyassociated with the membrane fraction. Total protein (T) was isolated from transgenicplants expressing dex-inductive promotor::GCR2-YFP. Proteins were fractionated intosoluble (S) or membrane (M)fractions. Equal amounts of protein were separated onSDS-PAGE and subjected to immunoblotting using antibodies to GFP. The sampleswereisolated from the transgenic plant under dexinductive conditions.

• 作 者 集 中 在 GCR2 的 生 物 化 学 特 性 上 进 行 研 究 。发 现 GCR2-YFP 融 合 蛋 白 只 定 位 在 质 膜 上 , 即 使被 诱 导 高 表 达 也 是 如 此 (1A), 并 且 在 细 胞 分 选和 免 疫 印 迹 分 析 中 也 和 膜 结 构 联 系 在 一 起 。 尽 管使 用 清 洁 剂 (0.1% or 0.5% Triton at Ph7.5 ) 或 者更 高 的 缓 冲 液 (pH10) 清 洗 ,GCR2 依 然 会 留 在质 膜 上 , 而 人 体 LanC 同 源 物 LANCL1 已 被 除 去 。

GCR2 与 GPA1 以 及 GCR2 与 Gb subunit的 相 互 作 用Fig.2Xigang Liu, Yanling Yue, Wei Li, and Ligeng Ma. Response to Comment on "A G Protein–Coupled Receptor Is a PlasmaMembrane Receptor for the Plant Hormone Abscisic Acid" . Science. 2007 318 (5852): 914d.

• (A) The dependence of intrinsic GTPase activity for physicalinteraction between GPA1 and GCR2 or GCR1 shown byYeast growth assay (left) and LacZ activity assay (right).KAT1-NubG + KAT1-Cub, positive control; SUC2-NubG +KAT1-Cub, negative control; cGPA1, Q222L-mutated GPA1defect in GTPase activity. (B) GCR2 and GCR1 interact withthe Gb subunit(AGB1) by split-ubiquitin assay in yeast. (Left)Yeast growth assay. (Middle)X-gal overlay assay. (Right)Corresponding LacZ activity for each yeast strain. I, GCR1-NubG + AGB1-Cub; II, NubG-GCR1 + AGB1-Cub; III,GCR2-NubG +AGB1-Cub; IV, NubG-GCR2 + AGB1-Cub; V,NubG + KAT1-Cub, positivecontrol; VI, SUC2-NubG +KAT1-Cub, negative control. b-galactosidase activity unit:Miller unit.

• 已 经 被 证 实 G 蛋 白 的 а 亚 基 的 内 在 GTP 酶 活 性 会 调节 它 与 G 蛋 白 偶 联 受 体 的 结 合 。 确 实 , 拟 南 芥 G蛋 白 а 亚 基 GPA1 的 GTP 酶 活 性 就 会 调 节 其 与GCR2 和 GCR1 的 相 互 作 用 。 另 外 , 与 一 些 G 蛋 白偶 联 受 体 相 似 的 是 ,GCR2 能 分 别 与 Gа(Fig.2A)和 Gβ(Fig.2B) 相 互 作 用 。( 负 对 照 仍 有 不 足 !)

• 在 知 道 GCR2 与 细 菌 的 LanC 蛋 白 只 有 较 低 的 序 列 相 似 性 的 基 础上 ,Johnston 等 人 认 为 GCR2 是 细 菌 的 羊 毛 硫 氨 酸 合 成 酶 的 植 物同 源 物 而 不 是 G 蛋 白 偶 联 受 体 。 然 而 作 者 有 7 种 证 据 支 持 GCR2在 生 物 化 学 上 显 著 不 同 于 LANCL 蛋 白 , 包 括 GCR2 和 LANCL1之 间 膜 结 合 特 性 上 和 亚 细 胞 定 位 上 的 不 同 。LANCL1-GFP 只 能 定位 在 细 胞 溶 质 和 核 仁 内 而 不 能 在 质 膜 上 , 然 而 LANCL1-YFP 只 能定 位 在 质 膜 上 。 最 后 , 在 与 Gа 和 Gβ 亚 基 的 的 相 互 关 系 上 也 有 不同 。 还 没 有 证 据 证 明 LANCL1 和 G 蛋 白 之 间 的 相 互 作 用 , 而GCR2 可 以 与 Gа 和 Gβ 亚 基 有 相 互 作 用 。• Johnston 等 人 认 为 GCR2 与 乳 酸 乳 球 菌 LanC 蛋 白 即 乳 酸 链 球 菌 素环 化 酶 (NisC) 结 构 的 相 似 性 可 以 为 GCR2 是 LanC 蛋 白 超 家 族 的 一员 提 供 证 据 。GCR2 可 能 是 一 种 LANC 的 同 源 物 , 但 也 有 好 几 种有 类 似 相 似 性 的 同 源 性 蛋 白 显 示 出 植 物 和 细 菌 功 能 和 生 理 生 化 特性 上 的 不 同 。 另 外 ,ERF/AP2 转 录 因 子 基 因 家 族 从 细 菌 的 HNH核 酸 内 切 酶 进 化 而 来 , 而 B3 结 构 域 转 录 因 子 基 因 家 族 ( 拟 南 芥的 37 个 成 员 ) 显 示 出 与 大 肠 杆 菌 ECORII 的 序 列 相 似 性 。 因 此 ,很 难 只 依 据 计 算 机 模 型 去 估 计 生 理 生 化 功 能 。 而 作 者 . 提 供 了 好 几个 生 理 生 化 方 面 的 证 据 证 明 GCR2 是 ABA 的 受 体 和 与 拟 南 芥 中Gа 和 Gβ 亚 基 的 相 互 关 系 。GCR2 其 它 的 特 性 可 能 与 经 典 的 G 蛋 白偶 联 受 体 不 相 一 致 , 因 此 认 为 GCR2 这 种 蛋 白 可 能 是 一 种 新 的 G蛋 白 偶 联 受 体 。

我 们 的 结 论• 综 上 , 刘 西 岗 等 人 的 文 章 中 提 出 了 很 多 支 持 自 己观 点 的 实 验 证 据 (2,4), 但 也 有 人 有 反 对 的 实验 数 据 (5,6)。 而 生 物 信 息 预 测 的 结 果 不 能 确证 GCR2 是 七 次 跨 膜 的 蛋 白 , 且 生 物 信 息 学 方 法 自身 又 有 很 多 的 局 限 , 所 以 GCR2 是 否 为 跨 膜 蛋 白 或GPCR 关 键 在 于 进 一 步 的 实 验 数 据 。

我 们 的 体 会• 正 确 并 适 当 的 使 用 生 物 信 息 学 工 具 有 助 于科 研 工 作 ;• 盲 目 使 用 生 物 信 息 学 工 具 而 忽 视 前 提 假 定导 致 错 误 ;• 生 物 信 息 学 工 具 预 测 的 结 果 需 要 “ 湿 实 验 ”加 以 验 证 ;• 科 研 工 作 — 下 结 论 需 慎 重 ;• 学 术 之 争 有 助 于 加 深 认 识

分 工 表姓 名 座 位 号 工 作张 翼佘 继 ( 组 长 )操 昭 煦刘 博 超C1C2D1D21. 第 二 部 分 , GCR2 蛋 白 的 blast 分 析 和 motif 预 测 。2. 第 三 部 分 ( 参 与 )。1. 背 景 讨 论 ( 全 部 )。2. 第 三 部 分 , 多 序 列 比 对 。3. 第 五 部 分 , 跨 膜 软 件 讨 论 。1. 第 一 部 分 , 跨 膜 结 构 软 件 预 测 中 的 TMAP, TMpred ,TopPred ,DAS ,HMMTOP, 总 结 各 软 件 的 分 析 结 果 。2. 第 五 部 分 , 结 合 实 验 数 据 讨 论 。1 . 第 一 部 分 , 跨 膜 结 构 软 件 预 测 中 的 TMHMM (v2.0) 和SOSUI 和 SOSUIsignal;2 . 第 四 部 分 搜 索 GCR2 三 维 结 构 。3 . 第 五 部 分 , 结 合 实 验 数 据 讨 论 。

参 考 文 献• 1. Erwin Grill and Alexander Christmann. BOTANY: A Plant Receptor with a Big Family.Science . 2007: 1676-1677.• 2. Liu X, Yue Y, Li B, Nie Y, Li W, Wu WH, Ma L.A G protein-coupled receptor is a plasmamembrane receptor for the plant hormone abscisic acid.Science. 2007 315(5819): 1712-6.• 3.Christopher A. Johnston, Brenda R. Temple, Jin-Gui Chen, Yajun Gao, Etsuko N.Moriyama, Alan M. Jones, David P. Siderovski, and Francis S. Willard. Comment on "A GProtein–Coupled Receptor Is a Plasma Membrane Receptor for the Plant Hormone AbscisicAcid". Science 2007 318 (5852): 914c.• 4.Xigang Liu, Yanling Yue, Wei Li, and Ligeng Ma. Response to Comment on "A G Protein–Coupled Receptor Is a Plasma Membrane Receptor for the Plant Hormone Abscisic Acid" .Science. 2007 318 (5852): 914d.• 5.Gao Y, Zeng Q, Guo J, Cheng J, Ellis BE, Chen JG.Genetic characterization reveals no rolefor the reported ABA receptor, GCR2, in ABA control of seed germination and early seedlingdevelopment in Arabidopsis.Plant J. 2007 52(6):1001-13.• 6.Guo J, Zeng Q, Emami M, Ellis BE, Chen JG.The GCR2 gene family is not required forABA control of seed germination and early seedling development in Arabidopsis.PLoS ONE.2008 3(8): e2982• 7 Möller S, Croning MD, Apweiler R.Evaluation of methods for the prediction of membranespanning regions.Bioinformatics. 2001 17(7): 646-53.• 8 Pandey S, Nelson DC, Assmann SM.Two novel GPCR-type G proteins are abscisic acidreceptors in Arabidopsis.Cell. 2009 136(1):136-48.• 9 Li B, Yu JP, Brunzelle JS, Moll GN, van der Donk WA, Nair SK. Structure and mechanismof the lantibiotic cyclase involved in nisin biosynthesis.Science. 2006 311(5766):1464-7.

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