Unità tecnica UTAGRI

Unità tecnica UTAGRILaboratori GEN ed INNFOODFLAVOR - PACCO DI LAVORO 77.2: Metodologiediagnostiche innovative per la caratterizzazione dellecomunità microbicheResponsabile: Annamaria BevivinoPartecipanti: Claudia Dalmastri, Patrizia Paganin, Patrizia DeRossi, Antonella Del Fiore, Francesca Lecce, Alessia Fiore, ElioFantini, Giulio Gianese

PL 77.2 – Metodologie diagnostiche innovative per laPL 77.2 – BACKGROUNDcaratterizzazione delle comunità microbicheI batteri identificati con le tecniche basate sulla coltivazionerappresentano soltanto la punta di un icebergL'utilizzo di tecnologie molecolari permette di identificare equantificare la presenza di classi di microorganismi ad ogginon coltivabili, che possono contribuire in modo determinantealla valorizzazione di prodotti alimentari ma anche causarnela deperibilità o alterarne la sicurezzaAnnamaria Bevivino

DISEGNO SPERIMENTALELactuca sativaINNOVATIVISTANDARDPACKAGING APPAFMO30PACKAGING CPPAFMO40PACKAGING FPPCX30 AFMIl lattughino (Lactuca sativa L.) prodotto dalla company, La LineaVerde SpA, è stato confezionato utilizzando tre differentipackaging, il packaging standard (F) e due packaging innovativicon differenti permeabilità ai gas e proprietà anti-fog (A and C).Annamaria Bevivino

COMPOSIZIONE DEI PACKAGINGBASIC PHYSICAL COMPOSINGlayer Thickness (μm) Substance (g/m 2 ) Density (Kg/dm 3 )A C F A C F A C FPP ANTIFOG 30 40 30 27.3 36.4 27 0.91 0.91 -Total (whitoutink)30 40 30 27.3 36.4 27Tolerances in the diagram +/- 8%CHEMICAL PROPERTIESGas Permeability Method Unit A C FO 2 ASTM D3985 cm 3/ m 2 24h atm 3000 1400 1800H 2 O ASTMF 1249 g/m 2 24h atm - 5 5.5Annamaria Bevivino

ANALISI MICROBIOLOGICADay 1 Day 3 Day 6 Day 8 Day 10Sono state prese in esametre buste di lattughino perogni tipo di packaging, adifferenti giorni dalconfezionamento.Le comunità batteriche sono state studiate mediante metodi dipendentidalla coltivazione e metodi indipendenti dalla coltivazione.Annamaria Bevivino

Log CFU/gMetodi dipendenti dalla coltivazioneBATTERI TOTALI COLTIVABILIAnalisi statistica (ANOVA)Days 3 2.794e+15Package 2 1.037e+15Day:Package 6 1.315e+15Df Sum Sq Mean Sq Fvalue9.315e+145.187e+142.192e+14Pr (>F)3.596 0.0289*2.003 0.15780.846 0.5478Residuals 2 5.958e+1 2.590e+1Non si sono 3 osservate 54 differenze statisticamentesignificative nella carica batterica totale tra i duepackaging innovativi (A e C) e il controllo F.(P=0.1578). E’ stato invece riscontrato in tutti icampioni un aumento significativo della caricabatterica totale nel tempo (P=0.0289).Tempo (giorni)Annamaria Bevivino, Claudia Dalmastri

Tecniche molecolariREAL-TIME PCRlog-phase analysisend-point analysisn• Alta concentrazione• Bassa concentrazioneN: numero delle molecole amplificaten: numero dei cicli di amplificazioneQuesto metodo molecolare permette di quantificare la presenza di generi especie di microrganismi caratterizzanti le matrici in esame.

REAL-TIME PCRDeterminazione mediante real time qPCR della carica batterica totale edell’entità della contaminazione da E. coli e S. aureus sulla matricevegetale.• Il DNA è stato estratto da foglie di lattughino (Lactuca sativa L.) prelevate da tredifferenti packaging: uno tradizionale (F) e due innovativi (A e C);Metodi per l’estrazione del DNA utilizzati‣ Metodo SDS‣ FastDNA SPIN Kit (Qbiogene)‣ DNeasy mericon Food Kit (Qiagen)‣ Nucleo spin gdna clean-up (Macherey-Nagel)• Sono stati utilizzati primers universali, disegnati sul gene 16S rRNA, per ladeterminazione della carica batterica totale e primers specie-specifici, disegnatisul gene nuc e sul gene uidA, per la determinazione rispettivamente di S. aureused E. Coli (Lee et al. 2011).Coppie di primers utilizzate27F e 338R27F e 519R338F e 519R519F e 907RS. aureus F e RE. Coli F e RPatrizia De Rossi, Antonella Del Fiore, Francesca Lecce

DNA (ng/g matrice vegetale)REAL-TIME PCRDeterminazione della carica batterica totale1,00E+071,00E+06DNA batterico totale1,00E+051,00E+041,00E+031,00E+021,00E+011,00E+001° 3° 6° 8° 10°giorni dal confezionamentoPACKAGING ATRADITIONAL PACKAGINGPACKAGING CReal time qPCR con primers 27F e 519R eseguita con lo strumento ABI Prism7000Le analisi svolte sui campioni di lattughino non hanno evidenziato differenze nellaquantità di DNA batterico totale tra le tre tipologie di packaging, entro dieci giornidal confezionamento.I risultati confermano i dati ottenuti dalla conta su piastra dei batteri coltivabili.Sono in corso le stesse analisi sui campioni di lattughino (campionamentoFebbraio 2013) confezionati con il metodo tradizionale e con l’innovazione diprocesso.Patrizia De Rossi, Antonella Del Fiore, Francesca Lecce

DNA (ng/g di matrice vegetale)DNA (ng/g di matrice vegetale)REAL-TIME PCRDeterminazione di E.coli e S. aureus1,00E+071,00E+061,00E+05E. Coli1,00E+041,00E+031,00E+021,00E+011,00E+001,00E-01I III VI VIII Xgiorni dal confezionamento1,00E+071,00E+061,00E+05S. aureus1,00E+041,00E+031,00E+021,00E+011,00E+001,00E-01I IIIVI VIII Xgiorni dal confezionamentoE’ stata rilevata la presenza di E. coli e S. aureus in tutti i campioni esaminati.Non sono state riscontrate differenze tra le tre tipologie di packaging nei 10 giorni esaminati.Patrizia De Rossi, Antonella Del Fiore, Francesca Lecce

Tecniche molecolariT-RFLPTerminal Restriction fragment length polymorphismAnalisi dei frammenti di restrizione marcatimediante elettroforesi capillareQuesta tecnica permette la comprensione della struttura e l’evoluzionedella comunità microbica delle matrici in esame in esame.

ANALISI T-RFLPIl packaging F forma un cluster distinto dal cluster formato dai campioni A e CRiferimento FPatrizia Paganin, Claudia Dalmastri, Annamaria Bevivino

PRINCIPAL COMPONENT ANALISI (PCA)Il packaging innovativo A si distingue come un componente separatoPatrizia Paganin, Claudia Dalmastri, Annamaria Bevivino

INDICI DI DIVERSITA’Gli indici Richness e Shannon indicanoun’abbondanza in specie maggiore nelpackaging F rispetto ai packaging A e C,nei primi gironi dal confezionamentoiShannon H: numero relativo di individui per specieRichness: indice di ricchezza di specie (N° di specie)Eveness: distribuzione delle specieP. Paganin, C. Dalmastri, A. Bevivino

ANALISI MICAL’analisi degli T-FRs è in corso di analisi mediante MicrobialCommunity Analysis (MiCA).Database:RDP (r10, 427) 700, 829 good quality bacterialSILVA (R106) 1, 471, 257 SSU (16S/18S) Parc.I risultati preliminari indicano un maggiore numero di picchinel packaging F rispetto a quelli riscontrati nei due packaginginnovativi, con una differente composizione in generi/specie.Patrizia Paganin, Claudia Dalmastri, Annamaria Bevivino

CONCLUSIONISebbene dai dati di quantificazione batterica non si siano osservate differenzenella quantità di cellule batteriche vitali e nel DNA batterico totale tra ipackaging innovativi ed il packaging tradizionale, i risultati ottenuti dall’analisi T-RFLP suggeriscono una diminuizione della diversità batterica nei due packaginginnovativi durante la shelf-life rispetto al packaging tradizionale.L’analisi T-RFLP si è rilevata particolarmente efficace e ha permesso dianalizzare la struttura delle comunità microbiche e di seguirne le dinamiche.L’analisi MICA in corso permetterà di individuare le specie batteriche dautilizzare come marcatori utili nel rivelare modificazioni della qualità sensorialedel lattughino fresco durante la conservazione.

PL 77.2 – Metodologie diagnostiche innovative per lacaratterizzazione delle comunità microbicheLA METAGENOMICALa metagenomica è un approccio basatosull'utilizzo di tecniche genomichemoderne per lo studio di comunitàmicrobiche direttamente nel loroambiente naturale, evitando così ilproblema del prelevamento ecoltivazione in laboratorio.Vi sono due approcci di analisi di metagenomica ad oggi realizzabili:1. Il primo consiste nell’identificazione e quantificazione della presenza di generi especie di microrganismi caratterizzanti le matrici in esame.2. Il secondo è l'analisi metagenomica totale, per decodificare l'intero contenuto inDNA microbico di una matrice alimentare. Oltre a definire la complessitàmicrobica presente nel campione, tale approccio permette anche di determinarela presenza di specifiche funzioni geniche di rilevanza per la sicurezzaalimentare, quali geni di resistenza ad antibiotici o codificanti tossine.Annamaria Bevivino

PL 77.2 – Metodologie diagnostiche innovative per lacaratterizzazione delle comunità microbicheSistema di terza generazione: Ion TorrentPersonal Genome Machine (PGM) SequencerLe tecnologie avanzate di sequenziamento ultramassivo permettono dii) determinare e identificare la presenza di microorganismi non coltivabili ma che possonoavere un ruolo significativo nei processi produttivi e nel determinare i tempi di shelf lifedi prodotti alimentariii) di poter anche identificare geni con funzioni di rilevanza per migliorare sia il processoproduttivo sia il prodotto alimentare.Annamaria Bevivino

ATTIVITA’ SPERIMENTALEMessa a punto di protocolli di metagenomica per la determinazionedell'entità della contaminazione batterica totale (coltivabili e incoltivabili)in funzione del tempo e dei diversi packaging innovativi1. Studio del gene 16S rDNA per l’identificazione della regioneamplificabile maggiormente rappresentativa2. Amplificazione della regione scelta del gene 16S rDNA da DNA dilattughino1. Sequenziamento next generation (ion torrent) degli ampliconi e analisidei risultatiAlessia Fiore, Elio Fantini, Giulio Gianese

RISULTATICreazione librerie Ion Torrent - regione V3 del gene 16S (amplicone 180 bp).Campioni 18 e F20.• Lattughino 18 (Campionamento 2011, Kit di estrazione, 10°g, busta 18)• Lattughino F20 (Campionamento 2011, buffer di estrazione tris HCl, 10°g, busta 20)18 F20 C-Profilo libreria Ion TorrentSequenziamento Ion Torrent200100Sequenze ottenute:Campione 18: 108.425Campione F20: 170.871Alessia Fiore, Elio Fantini, Giulio Gianese

RISULTATIL’analisi informatica delle sequenze ha messo in evidenza che i generimaggiormente rappresentati appartengono ai due “phyla” battericiProteobatteri (Pseudomonas) e Bacteroidetes (Flavobacterium)Genere N° reads %Pseudomonas 1384 35,7Flavobacterium 932 24,1Chryseobacterium 245 6,3Duganella 229 5,9Janthinobacterium 167 4,3Stenotrophomonas 96 2,5Acinetobacter 77 2,0Acidovorax 66 1,7Sphingobacteriaceae 66 1,7Rheinheimera 61 1,6Pantoea 58 1,5Delftia 40 1,0Rhizobium 39 1,0Tabella1: Generi maggiormente rappresentati nei campioni di lattughino analizzatiAlessia Fiore, Elio Fantini, Giulio Gianese

RISULTATICreazione librerie Ion Torrent - regione V3 del gene 16S (amplicone 180 bp).Campionamento 2012:• Lattughino 1°,3°,6°,8° gg (tre repliche per giorno) CAMPIONE CONTROLLOFigura 1: Profilo bioanalyzer di otto libraries (2/giorno) a giorni di campionamento diversiAlessia Fiore, Elio Fantini, Giulio Gianese

PL 77.2 – IN PROGRESSCaricamento delle 12 libraries chip 316 Ion torrent ed analisibioinformatica delle sequenze ottenuteAnalisi dei dati in corso….Alessia Fiore, Elio Fantini, Giulio Gianese

PRESENTAZIONI A CONGRESSI

MONDAY, JULY 22, 2013MICROBIAL FOOD SAFETY: TRENDS IN TRACING AND MONITORINGPATHOGENSChairpersons: Jeffrey Hoorfar, Denmark; Jordan Kieran, Ireland1. Biotracing: A new concept in food safety (Jordan Kieran, Ireland)2. Emerging issues in antibiotic resistance of pathogens in food productionchains (Stefan Schwarz, Germany)3. Foodborne viruses: occurrence and prevention (Albert Bosch, Spain)4. Advanced detection, monitoring and surveillance technologies forfoodborne pathogens(Jeffrey Hoorfar, Denmar)kWEDNESDAY, JULY 24, 2013TURNING OVER A NEW LEAF IN PHYLLOSPHERE MICROBIOLOGYJohan Leveau, USA

CONGRESSO INTERNAZIONALE FEMS 2013ABSTRACT TOPICSAntibiotic resistance and resistomeAntimicrobial resistanceApplied metagenomicsBacterial biofilmsBacterial pathotypesBacterial population geneticsBiotechnology and industrial microbiologyCell biology and cell structuresClustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats (CRISPR)Computational microbiologyCRISPR-based immunity in prokaryotesEmerging diseasesEnvironmental microbiologyExtreme environmentsFood microbiologyFungal developmentGeneral virology and bacteriophagesGlobal regulatory networksHigh-throughput approachesInteractions of bacteria with protozoans andmacrophagesIntracellular survivalMetagenomics in the environmentMetagenomics of the human bodyMetals and microbesMicrobes and alternative energy sourcesMicrobial cell biology and cell structureMicrobial communitiesMicrobial evolution, phylogenyMicrobial pathogenicityMicrobial persistence and chronic infectionsMicrobial proteomicsMicrobiology educationMicrobiology of aquatic ecosystemsMobile genetic elementsMolecular methods for diagnosis of infective agentsNew antimicrobial mechanismsNew approaches to typing of bacteriaNew vaccine designPlant/microbes interactionsPollutant degradation: hidden microbial potential innature to combat pollutantsSecondary metabolites and metabolomicsSecretionSignallingSmall regulatory RNAsToxin / antitoxin: activities and functionsVector-borne pathogensVeterinary microbiologyViral infections and host geneticsFree subjects

FEMS MICROBIOLOGY LETTERS-----Messaggio originale-----Da: Jeffrey Cole [mailto:J.A.COLE@bham.ac.uk]Inviato: giovedì 22 agosto 2013 17.07A: 'annamaria.bevivino@enea.it'Oggetto: From the Editor-in-Chief of FEMS Letters regarding your presentation in LeipzigDear Dr BevivinoI was interested to see the poster BACTERIAL COMMUNITY COMPOSITION AND PROTEOME ANALYSIS OFFRESH-CUT LETTUCE IN INNOVATIVE PACKAGES that you presented at the FEMS Microbiology Congress inLeipzig last month. As Editor-in-Chief of the Journal FEMS Microbiology Letters, I would like to encourageyou please to consider publishing your work in our Journal. We provide rapid publication free of charge tothe authors (including free colour figures, where they are required). Alternatively you will have the optionto pay for immediate free open access by all readers via our on-line open service. Our journal is keen toattract short papers reporting exciting results that make a seminal contribution to microbiologicalknowledge. The normal word limit is 3,000 words. I can be a little flexible over this, but I cannot acceptarticles of more than 4000 words.There is an absolute maximum of six figures and tables.Thank you for considering this request.With kindest regards,Jeff ColeEditor-in-ChiefFEMS Microbiology Letters

FEMS MICROBIOLOGY LETTERSDear Annamaria,Thank you for your response, which is greatly appreciated. Your work would stand alone as a paper forthe journal, not be part of a special issue. There is therefore no deadline to meet - but of course, weare looking for papers that present innovative, reliable data that would interest a wide audience, so itis important that you do not rush to submit half-finished work.When you submit a paper to FEMS Letters, please be sure to mention in the cover letter that yoursubmission is in response to an invitation to submit a paper following the FEMS Leipzig Congress.Kindest regards.Jeff ColeProfessor Jeff Cole,School of Biosciences,University of Birmingham,Birmingham B15 2TT, UK