DIAZ_CESAR_1167D.pdf

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE
FACULTAD DE QUÍMICA Y BIOLOGÍA
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
POLARIDAD ESTRUCTURAL Y DINÁMICA DE
POLIMERIZACIÓN DE LA TUBULINA BACTERIANA BTUBA/B
DE PROSTHECOBACTER DEJONGE/1
CÉSAR DAVID DÍAZ CELIS
Santiago-Chile
Profesor Guía:
Dr. Octavio Monasterio Opazo
Tesis para optar al grado de
Doctor en Microbiología
2010 HOPA
F'RMA
1 7 ENE /011

A mi familia
¡¡¡

Agradecimientos
Quisiera agradecer a mi familia por todo el apoyo y formación a lo largo de
estos años.
A los Ores. Rosalba Lagos y Octavio Monasterio por estos años de enseñanza
y formación académica en el laboratorio de Biología Estructural y Molecular.
Agradezco a los miembros de la comisión por haberme permitido desarrollar
esta idea de tesis y por la revisión de este trabajo.
Una parte de esta tesis fue desarrollada en EE.UU. por lo que me gustaría
agradecer al Dr. Carlos Bustamante de la U. de California, Berkeley, por
haberme permitido trabajar en su laboratorio y también a el Dr. Dan Fletcher de
la misma universidad, en donde pude realizar los experimentos de polaridad y
visualización de la polimerización. También me gustaría agradecer al Dr. Dyche
Mullins de la U. de California, San Francisco, por sus consejos y comentarios
acerca de este trabajo y por permitirme trabajar en su lab. Por supuesto me
gustaría agredecer a los estudiantes que estuvieron conmigo trabajando en el
mesón: Viviana Risca de Fletcher lab, por haber creído en esta idea y haberme
enseñado numerosas técnicas, y a Scott Hansen de Mullins lab por su
disposición, contactos, ayuda y enseñanzas.
Agradezco a la Facultad de Ciencias de la Universidad de Chile por toda la
formación que me entregó en el inicio de mis estudios de Biotecnólogo y por
todos los buenos momentos vividos en sus aulas y jardines. Tambien quiero
agradecer a la Facultad de Química y Biología de la Universidad de Santiago
de Chile, por acogerme y permitirme continuar los estudios de postgrado en el
programa de Microbiología.
A los integrantes que están y que ya no están del CEM-BEM.
A mis amigos y compañeros de la Facultad de Ciencias en "Gómez Millas", en
especial a los de "OPA" por todos estos años que hemos compartido en un
sinfín de eventos de todo tipo. No puedo dejar de mencionar a Christian Wilson
del laboratorio de Bioquímica por toda la ayuda Bibilográfica que me brindó
para el desarrollo de esta tesis y por la compañía en la estadía en California.
Muchas gracias a todos los que están y ya no están .. ..
iv

Fuentes de Financiamiento
Esta tesis se desarrolló en el Laboratorio de Biología Estructural y
Molecular de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Chile. Fue
financiada por:
• MECESUP, beca de doctorado años 2005 y 2006
• CONICYT, beca de doctorado años 2007 y 2008
• CON\CYT, beca de asistencia a congresos nacionales años 2005, 2006,
2007, 2009 y 2010
• CONICYT, beca de pasantía en el extranjero de gestión propia, año
2009
• MECESUP, beca de término de tesis año 201 O (UCH0604)
• USACH, beca de arancel años 2005 al 201 O
• FONDECYT, proyecto 1095121 del Dr. Octavio Monasterio O pazo
V

TABLA DE CONTENIDOS
ÍNDICE DE TABLAS ................................................ .............. ...... .. .. .. ............ viii
ÍNDICE DE FIGURAS ................ ........................................ .............................. ix
LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................ xi
RESUMEN .......... .. ......................................................................................... xvi
SUMMARY ...... ............... .. ................ ............................ .. ............................. xviii
1. INTRODUCCIÓN ....................... .............. .......................................... .. ........ 1
1.1. El citoesqueleto de los eucariontes versus el de las bacterias .. ........... 1
1.2. Proteínas homólogas de a/¡3-tubulina: FtsZ, BtubAJB, TubZ ..... ..... .. ... .4
1.3. Dinámica de los filamentos del citoesqueleto ........ .................. .. .. ....... 12
1.4. La división de bacterias Verrucomicrobia ... ..... ... ................................ 23
1.5. Hipótesis ........................... ........................................................ .. ... .... 26
1.6. Objetivos ... .... .. ........... ... ....... .. ..... ...... .. .. ... .......... .. .. ... ............. ..... ....... 27
2. MATERIALES Y MÉTODOS ........ ............................................................. 28
2.1. MATERIALES ............................................. ... .................................... 28
2.2. MÉTODOS ........... .. ............. ... ......................... ... ................................ 29
3. RESULTADOS ............................................ ........ ...................................... 46
3.1. Purificación de BtubAJB y marcaje con sondas fluorescentes ... ....... .. 46
3.2. Caracterización del efecto de potasio sobre la polimerización y la
actividad GTPásica de BtubAJB ............................................ .. ... ... .... .49
3.3. Determinación de la polaridad cinética y estructural de los
filamentos de BtubA/B ........ .. .............. ......... .. .................................... 77
vi

3.4. Visualización y determinación de la dinámica de polimerización
de los filamentos_ individuales de BtubA/8 .... .... ........ .... .............. ........ 80
4. DISCUSIÓN ............................................................................................. 101
4.1. Purificación de BtubAIB por ciclos de polimerización y
despolimerización ... ................................................................... .. .... 102
4.2. Ensamblaje cooperativo: modelo de nucleación-elongación .... .. ...... 103
4.3. La hidrólisis de GTP ........ .. .... .. ..... .............. .. ...... .. .... ........................ 110
4.4. Polaridad estructural y dinámica de polimerización de los
filamentos de BtubAIB .................. ...... .......................................... ... 113
4.5. Significancia biológica del mecanismo de polimerización de
BtubA/B . ............. .. .. .. ............................................................... .. ...... 119
5. CONCLUSIONES .................................................................................... 123
BIBLIOGRAFÍA ...................................... ...................................................... 124
Apéndice A: Proteínas del citoesqueleto bacteriano ............................... 135
Apéndice B: Análisis de la nucleación de Nishída y Sakai ...................... 140
Apéndice C: Modelo teórico del mecanismo de "treadmilling" ............... 143
vii

ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Concentración crítica de la polimerización de BtubAJB en función
de la concentración de KCI ... .... ...... .. ........................................................ ...... 61
Tabla 2. Tamaños de los núcleos y velocidades relativas de la nucleación
de BtubAJB en presencia de diferentes concentraciones de KCI .... ............ ..... 68
Tabla 3. Constantes catalíticas de la actividad GTPásica de BtubAJB en
función de la concentración de KCI ............. ............... ..... .. ....... ....... ....... .. ...... . 74
viíi

ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Proteínas homólogas procariontes de las tres clases de proteínas
citoesqueléticas eucariontes .............. .. ........ ...... ................. ............... . 3
Figura 2. La estructura del microtúbulo y el huso mitótico . ................ ......... ....... 6
Figura 3. Comparación estructural de las proteínas homólogas de
a/B-tubulina ....................................................................... ................. 7
Figura 4. Estructura de los filamentos y propiedades bioquímicas de
BtubA/B ........ .......... .. ......................................... ...... .... ......... ....... ..... 1 O
Figura 5. Modelo de la polimerización de actina por
nucleación-condensación .............. ... .. .............. ... ............................. 16
Figura 6. Inestabilidad dinámica de los microtúbulos . ..... .. ........ .... .................. 22
Figura 7. Micrografía electrónica de transmisión de
Prosthecobacter dejongeii . ... ... ... .... ......... ...... .. ..... .......... .... .............. 25
Figura 8. Purificación y marcaje fluorescente de BtubAJB ....................... ....... .48
Figura 9. Microscopía confocal del producto de la polimerización de
BtubAIB en presencia de distintas concentraciones de KCI. .... ......... 51
Figura 10. Microscopía electrónica del producto de la po limerización de
BtubA/B en presencia de distintas concentraciones de KCI. .......... 54
Figura 11 . Cinética de polimerización de BtubA/B en ausencia de KCI y
estimación de la concentración crítica de la polimerización ........... 58
Figura 12. Cinéticas de polimerización de BtubA/B en presencia de
concentraciones crecientes de KCI. ...................... .. ....................... 62
Figura 13. Cambio de la concentración crítica de la polimerización de
BtubAIB en función de la concentración de KCI. ............ ................ 63
Figura 14. Características de las cinéticas de polimerización a bajas
y altas concentraciones de KCI. .......... .. .. .......... .. .............. ............. 66
ix

Figura 15. Determinación del tamaño del núcleo y de las velocidades
relativas de nucleación de BtubA/8 ..................... .. .. .. .............. ....... 70
Figura 16. Determinación de la concentración crítica de la polimerización
de BtubAIB por sedimentación a alta velocidad . .. .. ........................ 72
Figura 17. Actividad GTPásica de BtubAIB en presencia de diferentes
concentraciones de KCI. ............ ............................ .. ...................... 76
Figura 18. Determinación de la polaridad de ensamblaje de
!os filamentos de BtubAIB ......... .. ................................ .... .. ...... .. .. ... 78
Figura 19. Microscopía confocal de la polimerización in vitro de los
filamentos individuales de BtubAJB ........... .. .. .... ........ .. ............ ....... 86
Figura 20. Inestabilidad dinámica de un filamento individual de BtubAJB:
interconversiones entre las fases de crecimiento y acortamiento . .. 88
Figura 21. "Treadmilling" de un filamento individual de BtubA/8 ............ .......... 91
Figura 22. Dependencia de la velocidad de polimerización de
BtubAIB en función de la concentración de proteína . .. .. .... .. .. ........ . 95
Figura 23. Microscopía confocal de la polimerización de los
filamentos individuales de BtubAJB con GMPCPP y GTP ............. . 99
Figura 24. Microscopía confocal de la polimerización de los filamentos
individuales de BtubA/B con GTP y cantidades
subestequiométricas de GMPCPP ............... .. .... ........ .. ................ 100
Figura 25. Modelos de la dinámica de polimerización de BtubAIB ............... . 118
Figura 26. Diagrama de la polimerización de un filamento polar . .. ................ 149
X

[P] : concentración de polímeros
[S): concentración de subunidades
LISTA DE ABREVIATURAS
[SJ ec: concentración de subunidades en el equilibrio dinámico, equivalente al
valor de la concentración crítica
[s·]: concentración de subunidades disponibles para polimerizar y equivale a la
concentración inicial de subunidades menos la concentración crítica
lmáx: intensidad máxima de la señal de dispersión de luz
Vmáx: velocidad máxima de la polimerización
n: número de subunidades que forman el núcleo
Ce: concentración crítica
C/: concentración crítica en el extremo "más" o de crecimiento rápido del
polímero
e;;: concentración crítica en el extremo "menos" o de crecimiento lento del
polímero
Kn: constante de equilibrio para la formación de un núcleo de n subunidades
Kec: constante de equilibrio de asociación de las subunidades con el polímero
en el estado estacionario
Kfc: constante de equilibrio para la asociación de subunidades con NDP
KJc : constante de equilibrio para la asociación de subunidades con NTP
dn/ dt; v: suma de las velocidades netas de elongación en unidades de nú mero
de subunidades n adicionadas por segundo en los dos extremos del polímero
dn+ 1 dt; v-t-: velocidad neta de elongación en unidades de número de
subunidades n adicionadas por segundo por polímero en el extremo "más"
xi

dn-; dt; v-: velocidad neta de elongación en unidades de número de
subunidades n adicionadas por segundo ror polímero en el extremo "menos"
k 2 : suma de las constantes de velocidad de adición de segundo orden de la
subunidad en los dos extremos del polímero
ki: constante de velocidad de adición de segundo orden de la subunidad en el
extremo "más" del polímero
k:¡: constante de velocidad de adición de segundo orden de la subunidad en el
extremo "menos" del polímero
k! 0 : constante de velocidad de asociación de la sub unidad con NDP en el
extremo "más" del polímero
k-:¡ 0 : constante de velocidad de asociación de !a subunidad con NDP en e!
extremo "menos" del polímero
ktr: constante de velocidad de asociación de la subunidad con NTP en el
extremo "más del polímero
k:¡r: constante de velocidad de asociación de la subunidad con NTP en el
extremo "menos" del polímero
k_ 1 : suma de las constantes de velocidad de disociación de primer orden de la
subunidad en los dos extremos del polímero
k: 1 : constante de velocidad de disociación de primer orden de la subunidad en
el extremo "más" del polímero
k: 1 : constante de velocidad de disociación de primer orden de la subunidad en
el extremo "menos" del polímero
k:f: constante de velocidad de disociación de la subunidad con NDP en el
extremo "más" del polímero
k: f: constante de velocidad de disociación de la subunidad con NOP en el
extremo "menos" del polímero
k:[: constante de velocidad de disociación de la subunidad con NTP en el
extremo "más" del polímero
xii

k=[: constante de velocidad de disociación de la subunidad con NTP en el
extremo "menos" del polímero
k*: constante de velocidad de la nucleación de orden-n
k cat: constante catalítica
oc: grados Celsius
A: angstrom
ADP: adenosín difosfato ("adenosine-5'-diphosphate")
ATP: adenosín trifosfato ("adenosine-5'-triphosphate")
ATPásica: actividad hidrolítica de ATP
BtubAIB: tubulina bacteriana A, B ("bacteria! tubulin A, B")
D.S.: desviación estándar
DAPI: 4',6-d iamidino-2-fenilindol diclorhidrato
DMSO: dimetilsulfóxido
DNA: ácido desoxirribonucleico ("deoxyribonucleic acid")
DO: densidad óptica
DOL: grado o relación de marcaje sonda:proteína ("degree of labeling")
DTT: ditiotreitol ("dithiothreitol")
EDT A: ácido etilendiamino-tetracético
EGTA: ácido etilenglicol -N,N,N' ,N'- bis-(2-aminoetiléter) tetracético
FtsZ: "filamentous temperature-sensitive Z"
g: gramo
GDP: guanosín difosfato ("guanosine-5'-diphosphate")
GFP: proteína fluorescente verde ("green fluorescent protein")
xiii

PIPES: ácido piperacín-N,N ·-bis[2-etanosulfónico]
PLL: polilisina-L; poli-L-Iisina ("poly-L-Iysine")
PMSF: fenilmetano sulfonilfluoruro ("phenylmethanesulphonylfluoride")
rpm: revoluciones por minuto
s: segundos
SDS-PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato
sódico ("sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis")
TAMRA: 5,6-carboxitetrametilrodamina, succinimidil éster ("5-(and-6)carboxytetramethylrhodamine,
succinimidyl ester")
TRIS: tris-(hidroximetil) aminoetano
wlv: peso/volúmen
x g: número de veces de la aceleración de gravedad
¡.¡m: micrómetro
XV

estables, pues la velocidad de despolimerización y la actividad GTPásica
disminuyeron. Se determinó, que al igual que los microtúbulos, los filamentos
de BtubA/B son estructuralmente polares, lo que produce que un extremo del
filamento crezca más rápido que el otro. Sin embargo, la polaridad de los
manojos de filamentos es mezclada. Se observó que los filamentos individuales
de BtubA/B exhiben la dinámica denominada "treadmilling" que consiste en el
crecimiento por un extremo del filamento y el acortamiento por el otro. También
se observó en filamentos individuales el mecanismo de inestabilidad dinámica,
que es el principal mecanismo de ensamblaje de los microtúbulos, y consiste
en cambios estocásticos entre fases de crecimiento y acortamiento de un
extremo del microtúbulo. La alta concentración intracelular de potasio indicaría
que en Prosthecobacter, los filamentos de BtubA/B se ensamblarían
rápidamente a partir de un núcleo de tres o cuatro subunidades, los que no se
encontrarían como filamentos individuales, sino como manojos y que crecerían
de manera longitudinal dentro de la célula. Esto indicaría que el mecanismo de
inestabilidad dinámica no sería esencial para la función de BtubA/B, pues las
interacciones laterales estabilizarían los filamentos y el mecanismo de
"treadmilling" permitiría el reordenamiento de los filamentos dentro de la célula.
Estos resultados apoyan la idea de que BtubA/B cumple un rol de soporte
estructural en Prosthecobacter que estaría relacionado con la determinación de
la forma celular alargada a través de la formación de los manojos.
xvii

Besides, individual BtubAJB filaments displayed treadmilling , which is the
growth at one end and the shortening at the 0ther end at the same rate. Also,
individual filaments showed dynamic instability, which is the main microtubule
assembly mechanism and consists of changes between growing and shrinking
phases at microtubule end. The high Prosthecobacter intracellular potassium
concentration suggests that the behavior of BtubA/B filaments would be a fast
assembly from a trimeric or tetrameric nucleus, to induce filaments bundles that
grows \ogitudinally within the ce\1. This means that the dynamic instability
mechanism would not be operative, because lateral interactions stabilize the
filaments, and only the treadmlilling would allow the reorganization of BtubAIB
filaments within (inside) the cell. These results support the hypothesis that
BtubAIB bundles probably plays a structural support in Prosthecobacter that
could contribute to the elongated shape of the cells.
xix

1. INTRODUCCIÓN
1.1. El citoesqueleto de los eucariontes versus el de las bacterias
El citoesqueleto es una red compleja y dinámica de filamentos de
proteínas y está compuesto de los filamentos de actina, los microtúbulos
(polímeros de tubulina) y los filamentos intermedios. Su función es regular y
organizar muchos procesos celulares en las células eucariontes, como la
determinación de la forma celular (morfogénesis), división y polaridad celular,
fagocitosis, movimiento y tráfico intracelular de macromoléculas (Carballido­
Lopez y Errington, 2003)
Por décadas se pensó que éstas proteínas estaban ausentes en los
procariontes, pues los estudios bioquímicos y de microscopía no habían podido
detectar estructuras citoesqueléticas en bacterias. De hecho, la ausencia de
redes de citoesqueleto en bacterias se consideró alguna vez una definición que
distinguía a las células procariontes de las eucariontes. Las bacterias no poseen
una necesidad obvia por un citoesque\eto, pues mantienen sus formas con una
rígida pared celular que funciona como exoesqueleto y su pequeño tamaño
permite a las moléculas difundir a través de la célula bacteriana a velocidades
que deberían obviar la necesidad por un transporte activo (Gitai, 2005). Además,
los proyectos de secuenciación de genomas bacterianos no revelaban ninguna
proteína que por su secuencia primaria fuera identificada como citoesquelética
(Carballido-Lopez, 2006). Sin embargo, en los últimos 20 años, esta visión
errónea cambió completamente con la identificación en las bacterias de los
homólogos de las tres principales clases de proteínas del citoesqueleto de los
eucariontes: FtsZ, BtubA/B y TubZ, homólogos de tubulina; MreB, ParM y MamK
son los homólogos de actina; y CreS (crescentina) es el homólogo de los
filamentos intermedios (Figura 1 ).
1

La primera proteína que se identificó a comienzos de 1990, fue FtsZ, una
proteína que forma una estructura en forma de anillo en e\ sitio de \a división
bacteriana (Bi y Lutkenhaus, 1991) y se postuló como el ancestro de los
microtúbulos por su semejanza a tubulina. El ancestro de actina se identificó 1 O
años después del descubrimiento de que FtsZ y tubulina eran equivalentes en
estructura y propiedades bioquímicas. Así, se observó que la proteína MreB, que
determina la forma celular, forma filamentos con propiedades bioquímicas y
estructurales muy similares a las de actina (Jones y cols., 2001; van den Ent y
cols. , 2001 ). A partir de este hallazgo, se cambió la definición de que las
bacterias no tenían estructuras internas filamentosas, por la idea de que el
interior de la célula bacteriana contiene un gran número de elementos
citoesqueléticos organizados. En el año 2003, se determinó que la proteína
crescentina de Cau/obacter crescentus formaba filamentos que participan en la
determinación de la forma helicoidal y curva de esta bacteria y que tiene
propiedades bioquímicas y estructurales similares a los filamentos intermedios
(Ausmees y cols. , 2003). Además, se identificó a BtubNB (Jenkins y cols., 2002)
y a TubZ (Larsen y cols ., 2007) como nuevos homólogos de tubulina y a ParM
(Moller-Jensen y cols., 2003) y MamK como nuevos homólogos de actina en
bacterias.
Sin embargo, existen diferencias importantes entre el citoesqueleto de los
eucariontes y el de los procariontes, como la existencia de un grupo de proteínas
citoesqueléticas en bacterias, el grupo MinO/ParA, que no tiene una contraparte
eucariótica conocida y el hecho que las funciones análogas son frecuentemente
llevadas a cabo en eucariontes y procariontes por familias diferentes de proteínas
citoesqueléticas y a menudo a través de diferentes mecanismos (Shih y Rothfíeld,
2006). En el Apéndice A se da una descripción más completa de las proteínas del
cítoesqueleto de bacterias.
2

Proteína
eucarionte
tubulina
actina
Filamentos
intermedios
Homólogo Polímeros in vitro Polímeros in vivo
procarionte
FtsZ
MreB
CreS
Figura 1. Proteínas homólogas procariontes de las tres clases de proteínas
citoesqueléticas eucariontes.
Estructura de los polímeros formados in vitro por las proteínas FtsZ, MreB y ereS
observados por microscopía electrónica y localización intracelular determinada por
microscopía de fluorescencia. FtsZ forma in vitro filamentos cuNos y rectos con GTP
que in vivo se localizan en el sitio de la división celular (inmunofluorescencia), en
donde forman el anillo-Z que dirige la constricción de la célula (flecha). In vitro, MreB
forma filamentos y sábanas de filamentos en presencia de A TP . La microscopía de
fluorescencia muestra filamentos helicoidales de MreB que rodean a la célula de
Bacillus subtilis (inmunofluorescencia). e reS o crescentina forma in vitro polímeros
similares a los filamentos intermedios y se ubican en la cuNatura interna de
Caulobacter crescentus (verde, ereS-GFP). La membrana está teñida en rojo. Barra=
100 nm (microscopía electrónica); 2 1-1m (microscopía de fluorescencia). (Figura
adaptada del trabajo de Moller-Jensen y Jan Lowe (Moller-Jensen y Lowe, 2005)).
3

Draber, 2006). Delta (ó) y épsilon (E) tubulina participan en el ensamblaje y
anclaje de los cuerpos basales y eta (1"\) tubulina en el desarrollo del cuerpo
basal (Libusova y Draber, 2006). La función de zeta ((;), theta (8) , iota (1) y
kappa (K) tubulina es aún desconocida (Libusova y Draber, 2006).
1.2.2. FtsZ, la proteína bacteriana de la división celular
FtsZ es la proteína más conservada del citoesqueleto bacteriano y se
encuentra en casi todos los miembros de Bacterias, Euriarqueas y en muchos
organelos de los eucariontes (Margolin, 2005) . FtsZ es esencial para la
citoquinesis, pues forma en el futuro sitio de la división celular una estructura
en forma de anillo, el anillo-Z (Figura 1) (Bi y Lutkenhaus, 1991), el cual actúa
como el organizador central del ensamblaje de la maquinaria de la división
celular formada por al menos doce proteínas diferentes (Errington y cols. ,
2003). In vitro, FtsZ forma protofilamentos simples y dobles en presencia de
GTP, similares a los de tubulina , pero que no se ensamblan en microtúbulos
(Figura 1) (Bramhill y Thompson, 1994; de Boer y cols. , 1992; Mukherjee y
cols ., 1993; Mukherjee y Lutkenhaus, 1994; RayChaudhuri y Park, 1992). A
pesar de que FtsZ y tubulina comparten sólo un 12% de identidad de secuencia
de aminoácidos y que ésta se encuentra principalmente en la región de unión
de GTP (de Boer et al., 1992), sus estructuras cristalinas resultaron ser muy
similares (Figura 3) (Lowe y Amos, 1998; Nogales y cols ., 1998a; Nogales y
cols ., 1998b), lo que corroboró la homología y probable ancestro común entre
estas dos proteínas.
5

1.2.3. La tubulina bacteriana BtubA/B
La baJa identidad de secuencia aminoacídica entre a/¡3-tubulina y FtsZ
no se condice con el hecho que estas proteínas están entre las que menos han
evolucionado del universo de proteínas conocidas (Dacks y Doolittle, 2001;
Doolittle, 1995). Además, sus funciones celulares son distintas. Esto planteó la
necesidad de un nexo entre ellas como otra proteína homóloga en bacterias o
arqueas más relacionada con a/¡3-tubulina que con FtsZ. En el año 2002 se
descubrió en el genoma del género bacteriano Prosthecobacter dos nuevas
secuencias más relacionadas con a/¡3-tubulina que con FtsZ (Jenkins y cols.,
2002): btubA (bacteria/ tubulin A) y btubB (bacteria! tubulin B). BtubA y BtubB
comparten entre un 31% a 35% y entre un 34% a 37% de identidad de
secuencia con a- y 13-tubulina, respectivamente, pero sólo entre un 8% a 11 %
con FtsZ. Aunque no se logró identificar por microscopía electrónica la
presencia de estructuras similares a los microtúbulos en secciones de
Prosthecobacter dejongeii, sí se detecto la transcripción de btubA y btubB por
RT-PCR (Jenkins y cols., 2002).
Estudios bioquímicos posteriores demostraron que, en presencia de GTP,
BtubA y BtubB forman filamentos simples (Figura 4A) y manojos de filamentos
(Figura 4B) que no corresponden a microtúbulos (Jenkins y cols. , 1997; Schlieper
y cols., 2005; Sontag y cols. , 2005). Sin embargo, los filamentos simples están
formados por dos protofilamentos similares a los de a/¡3-tubulina y FtsZ (Figura
4A). No se sabe si los dos protofilamentos son paralelos o antiparalelos el uno
con el otro (Schlieper y cols. , 2005). A través de ensayos de sed imentación se
determinó que ambas proteínas polimerizan en cantidades equimolares (Figura
4C), lo que indica que BtubA y BtubB forman un heterodímero y además, apoya
la idea de que BtubAIB polimeriza de una manera alternada dentro del polímero,
similar a a/¡3-tubulina (Schlieper y cols., 2005; Sontag y cols. , 2005). Poco se
sabe sobre la cinética de polimerización de BtubAIB, pero la existencia de una
8

concentración mínima de proteína para polimerizar sugiere un mecanismo
cooperativo de ensamblaje (Sontag y cols. , 2005) que es reversible (Schlieper y
cols., 2005), pues después de la despolimerización de los filamentos, debido al
agotamiento de GTP, es posible iniciar un nuevo ciclo de polimerización
adicionando más nucleótido (Figura 40). Ensayos de inmunofluorescencia con
anticuerpos anti-BtubB en la bacteria Escherichia co/i, que se usó para la sobre­
expresión de BtubA/B, mostró que la tubulina bacteriana se ensambla en largos
manojos de filamentos que se extienden de polo a polo a lo largo de la bacteria
(Figura 4E) (Sontag y cols., 2005) . En base a esto, se especuló que la tubulina
bacteriana contribuiría a la forma alargada de Prosthecobacter. Sin embargo, aún
no existen estudios publicados de la localización y función de BtubA!B en
Prosthecobacter.
La estructura cristalina del heterodímero de BtubAJB resuelta a 3,2 A
(Schlieper y cols., 2005) (Figura 3) muestra que se asemeja muy estrechamente
a la estructura del heterodímero de a/¡3-tubulina con la arquitectura típica de tres
dominios. lnteresantemente, BtubA/B también posee un dominio carboxilo
terminal, ausente en FtsZ, y que en tubulina forma la superficie externa de los
microtúbulos e interactúa con proteínas reguladoras (MAPs, motores
moleculares). Esta alta similitud estructural indicaría que el mecanismo de
polimerización es similar al de la tubulina eucarionte (Nogales y Wang, 2006). Sin
embargo, a pesar de estas similitudes entre la tubulina eucarionte y la bacteriana,
BtubAJB exhibe algunas propiedades distintas a a/{3-tubulina , como una
dimerización débil y reversible (Schlieper y cols., 2005) y un plegamiento
independiente de chaperonas que se asemeja al de FtsZ (Andreu y cols., 2002).
En base a estos resultados, se postuló que los genes de la tubulina bacteriana
habrían sido adquiridos por Prosthecobacter desde un eucarionte primitivo por
transferencia genética horizontal (Jenkins y cols., 2002; Schlieper y cols., 2005).
9

1.3.2. Nucleación
El núcleo de polimerización se define como el oligómero más pequeño
(de tamaño n), con más probabilidad de crecer y formar un polímero que de
disociarse (Figura 5A). La reacción limitante de la polimerización cooperativa
de los filamentos es la adición de una subunidad al núcleo para formar un
extremo estable o "semilla" que pueda elongar o crecer espontáneamente. Esto
se debe a que la constante de velocidad para la asociación de una subunidad
con otra subunidad es probablemente diferente de la constante de velocidad de
asociación de la subunidad al extremo del polímero, debido a la diferencia en el
número de contactos que establece con las otras subunidades (Oosawa y
Kasai, 1962) (Figura 5A). Además, la cooperatividad de la nucleación se
atribuye también a la disminución de la entropía debido a la inmobilización de
las subunidades en el polímero (E rickson y Pantaloni, 1981). En el modelo
simplificado de Wegner (Wegner y Engel, 1975) se supuso que los oligómeros
de tamaño n - 1 se encuentran en un pre-equilibrio ráp ido con las
subunidades, es decir, se forman rápidamente y tienen más probabilidades de
disociarse que de crecer, lo que significa que todos los pasos previos a la
formación del núcleo son invisibles a la cinética y el sistema puede ser descrito
como si el núcleo estuviera en equilibrio con las subunidades libres. De
acuerdo a esto, la velocidad de nucleación es la velocidad de cambio del
número de filamentos por unidad de volumen:
donde [P] es la concentración en número de los polímeros, n corresponde al
número de subunidades que forman el núcleo, [5] es la concentración de
subunidades (monómero de actina o heterodímero de tubulina), k 2 es la suma
de las constantes de velocidad de adición de segundo orden de la subunidad
13

subunidades, las constantes de velocidad de asociación y de disociación se
hacen independientes de la longitud del filamento debido a la equivalencia de
los sitios de unión (Wegner, 1982). La velocidad de cambio de la concentración
de subunidades puede ser descrita por:
d[S]
----¡¡¡- = k2 [S] [P] - k_ 1 [P] (3)
En el estado estacionario o equilibrio dinámico, las velocidades de
crecimiento y acortamiento de los polímeros son idénticas, por lo tanto
k2 [S]ec [P] = k_l [P], y:
igual a:
k_l
[S] ec =Ce = k; (4)
La constante de equilibrio de asociación Kec en el estado estacionario es
Por lo tanto, la velocidad de polimerización se expresa como:
15

1.3.4. Hidrólisis del nucleótido
Las dinámicas de polimerización (mecanismos de polimerización y
despolimerización) de las proteínas del citoesqueleto de los eucariontes y de
los procariontes son energéticamente costosas pero también evolutivamente
conservadas, lo que indica que son centrales para el desarrollo de sus
funciones biológicas. Para esto, la mayoría de las proteínas citoesqueléticas
unen e hidrolizan nucleósidos trifosfato (NTP), lo que les permite transformar la
energía química en dinámicas de polimerización alejadas del equilibrio químico.
El campo de la investigación de los polímeros del citoesqueleto ha adoptado
tradicionalmente una mirada cinético-química de las dinámicas de
polimerización (Kueh y Mitchison , 2009), la que postula que el estado químico
del nucleótido unido a la subunidad controla las velocidades de asociación y de
disociación de las subunidades con el polímero. Tubulina une GTP y actina une
ATP y ambas polimerizan cuando están unidas al NTP. Poco después de la
polimerización, las subunidades hidrolizan el NTP a nucleós\dos difosfato
(NDP), se libera el fosfato inorgánico (Pi) y el NDP es retenido en el polímero,
el cual se vuelve más inestable que el polímero con NTP, por lo que se
despolimeriza y libera las subunidades individuales que estarán disponibles
para otro ciclo de polimerización y despolimerización. En este esquema, la
energía libre de la hidrólisis no cataliza la polimerización, sino que gatilla la
despolimerización, lo que permite a los polímeros en las células experimentar
un recambio continuo alejado del equilibrio químico y así se pueden ensamblar
en algunos lugares de la célula, mientras que se desensamblan en otros. Esto
permite al citoesque\eto reorganizarse rápidamente en respuesta a las
necesidades celulares. Si los polímeros citoesqueléticos se ensamblaran in
vivo hasta alcanzar un equilibrio químico verdadero, sería difícil y lento cambiar
su organización espacial.
17

Una segunda propiedad que surge del acoplamiento directo de la
dinámica de polimerización y la hidrólisis del nucleótido es el potencial para
realizar un trabajo mecánico de empuje con la polimerización, de tracción con
la despolimerización (Desai y Mitchison, 1997; lnoue y Salman, 1995) o
también por cambios de la curvatura de los filamentos, como es el caso de la
FtsZ cuando participa en la formación del anillo-Z de constricción celular
(Osawa y cols., 2008).
Entender como el polímero usa la energía de la hidrólisis del nucleótido
para promover el recambio y para realizar trabajo mecánico es el tema central
dentro del campo de investigación del citoesqueleto (Kueh y Mitchison, 2009).
1.3.5. Análisis cinético-químico de las dinámicas de polimerización:
"treadmilling" e inestabilidad dinámica
"Treadmilling". A comienzos de 1970 se demostró que los microtúbulos y los
filamentos de actina se pueden ensamblar reversiblemente a partir de sus
subunidades solubles y se sabía que la hidrólisis del nucleótido jugaba un rol
en la polimerización , pero se pensaba que la dinámica de polimerización se
reducía a un intercambio en el equilibrio entre las subunidades solubles y los
extremos de los polímeros y además, era desconocido como la hidrólisis del
NTP generaba el recambio de las subunidades en el polímero. Wegner
propuso una solución para el recambio de la actina a través de la teoría del
"treadmilling" (Wegner, 1976) (Apéndice C). La base de esta teoría es que las
velocidades de asociación y de disociación de las subunidades en los extremos
del polímero dependen del estado químico del nucleótido unido. Las
subunidades unidas a NTP se asocian preferencialmente a los extremos,
mientras que las subunidades unidas a NDP se disocian desde los extremos.
Además , los filamentos de actina son polares, es decir, sus dos extremos son
18

despolimerización del microtúbulo pero que no es necesaria para la
.. polimerización (Caplow y cols., 1994; Hyman y cols, 1992). Un modelo similar
se propuso para explicar el mecanismo de inestabilidad dinámica de ParM, el
homólogo bacteriano de actina (Garner y cols ., 2004).
21

1.4. La división de bacterias Verrucomicrobia
El phylum Verrucomicrobia es un phylum divergente de bacterias Gram
negativas que habitan los suelos y ambientes acuáticos (Lee y cols. , 2009). Se
ha estimado que Verrucomicrobia comprende hasta el 10% de las bacterias
totales en el suelo (Wagner y Horn , 2006). Las características más peculiares
de estas bacterias, son la presencia en los epixenosomas de estructuras
semejantes a los microtúbulos (Petroni y cols. , 2000) y de genes similares a la
tubulina eucarionte en el género Prosthecobacter (Jenkins y cols., 2002).
lnteresantemente, algunos miembros de Verrucomicrobia viven en
asociación con eucariontes. Los epixenosomas son bacterias ectosimbiontes
acuáticas que viven en la superficie de protozoos ciliadas del género
Euplotidium y que defienden a su hospedero de depredadores con un sistema
de ejección de estructuras tubulares de 22 ± 3 nm de diámetro, cercano al
tamaño de los microtúbulos eucariontes (25 nm) (Petroni y cols., 2000). Las
estructuras tubulares son sensibles a factores que despolimerizan los
microtúbulos, como la droga nocodazol y una temperatura de 4°C. Además,
reaccionan con anticuerpos anti-tubulina de paramecios. Sin embargo, no se
conoce la identidad de la proteína que forma esos tubos.
En base a las características de las estructuras tubulares presentes en los
epíxenosomas, se buscó y encontró genes homólogos a la tubulina eucarionte en
el genoma del género Prosthecobacter que pertenece a Verrucomicrobia y que
es llamado así debido a la morfología de las especies que lo componen, las
cuales producen prostecas (Prosthecobacter dejongeii, Prosthecobacter
vaneervenii, Prosthecobacter debontií y Prosthecobacter fusiformis) . La protesca
es una extensión de la pared celular que contiene citoplasma (Staley, 1968) y que
aumenta el area de la superficie de las células. Esto contribuye a un aumento de
la respiración y de la captación de nutrientes, disminución de la sedimentación en
ambientes acuáticos, y posiblemente participa en la adhesión a sustratos sólidos
23

usando la punta de la prosteca (Merker y Smit, 1988). Además, al igual que el
phylum_ Planctomicetes, algunos miembros de Verrucomicrobia como
Prosthecobacter dejongeii poseen células compartimentalizadas de forma
diferente a la organización procarionte clásica (Lee y cols. , 2009) y que consiste
en la separación del citoplasma celular en dos regiones: un gran compartimiento
central, llamado pirelulosoma, el cual contiene al nucleoide condensado y
ribosomas y que está rodeado por una membrana intracitoplasmática, y un
segundo compartimiento más periférico, llamado parifoplasma, el cual rodea al
pirelulosoma y se ubica entre la membrana plasmática y la intracitoplasmática y
carece de ribosomas (Figura 7).
Aún no se sabe la función que cumpliría la tubulina bacteriana BtubA/8 en
Prosthecobacter. Se cree que participaría en la mantención de la forma alargada
de la célula y no participaría en la división celular, pues Prosthecobacter posee la
proteína FtsZ (Pilhofer y cols., 2007b). Sin embargo, llama la atención de que el
género Prosthecobacter haya conservado la tubulina bacteriana a lo largo de su
evolución, lo que indicaría que cumple algún tipo de función en la bacteria.
24

Figura 7. Micrografía electrónica de transmisión de Prosthecobacter dejongeii.
Las células de Prosthecobacter dejongeii son fusiformes, rectas, largas (3-1 O ¡.Jm) y
anchas (1 tJm) (Hedlund y cols., 1997) y poseen un plano celular compartimentalizado,
similar al encontrado en el phylum Planctomicetes (Lee y cols., 2009). En la
micrografía de Prosthecobacter dejongeii se observa la prosteca (PT), la membrana
citoplasmática (CM) que rodea a la región del parifoplasma (P) y ésta a su vez a la
región del pirelulosoma. El pirelulosoma contiene al nucleoide (N) y está rodeado por
una membrana intracitoplasmática (ICM). El inserto corresponde a una magnificación
de la zona del cuadro blanco (Lee y cols., 2009). Barra= 0,5 ¡.Jm.
...
,:
25

1.6. Objetivos
Se propuso como objetivo general determinar la polaridad estructural de
los filamentos de BtubAJB y su dinámica de polimerización. Para esto se
plantearon los siguientes objetivos específicos:
1. Purificar y marcar BtubAJB con sondas fluorescentes.
2. Determinar el efecto de potasio sobre la polimerización y la actividad
GTPásica de BtubAJB.
3. Determinar la polaridad cinética y estructural de BtubA/8.
4. Determinar la dinámica de polimerización de los filamentos de BtubAJB.
27

Placas de agar-LB. Al medio líquido LB se le agregó agar al 1%. Cuando se
necesitó, se suplementó con ampicilina 100 ¡.Jg/ml.
Cepas y plasmidios. Se utilizó la cepa de Escherichia coli XL 1 0-Gold
(Stratagene) para almacenar el plasmidio que codifica para la tubulina
bacteriana BtubAIB de Prosthecobacter dejongeii, el cual fue donado por el Dr.
Daniel Schlieper. BtubAB se encuentra bajo el control del promotor T7. Se
utilizó la cepa de Escherichia coli BL21 (ADE3) para sobre-expresar la proteína.
2.2. MÉTODOS
2.2.1 . Preparación de las células electrocompetentes
Las células aptas para la transformación (introducción de DNA foráneo)
o electrocompetentes, se prepararon a partir de un cultivo bacteriano en fase
exponencial de crecimiento. Para ello, se tomaron con un asa estéril células de
la cepa de Escherichia coli XL 1 0-Gold y de la cepa de Escherichia co!i
BL21 (ADE3) guardadas a -80°C y se sembraron por separado en una placa de
LB agarosa. Se utilizó la cepa de Escherichia coli XL 1 0-Gold para almacenar el
plasmidio que codifica para BtubAIB y la cepa de Escherich ia coli BL21(ADE3)
se utilizó para sobre-expresar la proteína. Después de crecer las bacterias en
la placa por 24 h a 3rC, se seleccionó una colonia y se puso a crecer las
bacterias en 1 O mL de medio LB por 24 h a 3rC y ag itación constante. 5 mL
de este cultivo se inocularon en 200 mL de medio LB y se pusieron a crecer las
bacterias con agitación constante a 3rC hasta alcanzar una D06oo entre 0,6-
0,7 (fase exponencial de crecimiento). Las células se cosecharon a 4.500 x g
por 10 min en tubos de 50 mL fríos, se descartó el sobrenadante y el
precipitado bacteriano obtenido se suspendió en glicerol al 1 O% frío mediante
29

amortiguador HEPES 50 mM (pH 7 ,0); PMSF 1 mM y DTT 1 mM , en un
volumen final de 40 ml totales. Esta mezcla celular se traspasó a un vaso
precipitado de vidrio y se sonicó con 8 pulsos de 20 s y pausas de 1 min con
una salida de valor 8 (misonix Sonicator 3000) en hielo para evitar el
sobrecalentamiento. Se volvió a traspasar el lisado sonicado a tubos de 30 ml
y se ultracentrifugó a 100.000 x g por 90 mina 4°C. El precipitado se descartó
y al sobrenadante se le midió el volumen en una probeta y se colocó en un
tubo Falcon de 50 ml. De acuerdo al volumen del sobrenadante, se le agregó
cloruro de potasio sólido para lograr una concentración final de 0,5 M y cloruro
de magnesio a una concentración final de 5 mM. Esta mezcla se incubó a
temperatura ambiente (25°C) por 20 minutos, se traspasó a los tubos de 30 mL
de la ultracentrífuga, se les adicionó GTP 1 mM e inmediatamente se
ultracentrifugó a 100.000 x g por 20 min a 25°C. Después de esta primera
polimerización, el sobrenadante se descartó, se estimó el volumen del
precipitado y se suspendió con la pipeta con aproximadamente 3 a 4
volúmenes del amortiguador HE PES 50 mM (pH 7 ,0) y se incubó en hielo por
20 min. Posteriormente, se ultracentrifugó a 100.000 x g por 20 mina 4°C para
eliminar los agregados de proteína. Este paso indica el fin del primer ciclo de
polimerización y despolimerización. Se midió el volumen del sobrenadante y se
le agregó nuevamente cloruro de potasio 0,5 M; cloruro de magnesio 5 mM y
se incubó a temperatura ambiente por 20 min para iniciar un segundo ciclo de
polimerización y despolimerización con la adición de GTP 1 mM. Este
procedimiento se realizó 3 veces. El último sobrenadante se dializó a 4°C por
12 h contra amortiguador HEPES 50 mM (pH 7,0). Se tomó la proteína
dializada y se centrifugó a 20.000 x g por 30 min para eliminar agregados. Por
último, se alicuotó en tubos "Eppendorf' y se congeló a -80oc para su posterior
uso.
32

2.2.4. Cuantificación de la tubulina bacteriana BtubA/8
Antes de los experimentos de polimerización, alícuotas de BtubA/B se
descongelaron en hielo y se incubaron con un exceso de GTP (0,5 mM) por 1 h
y en hielo. Después se separó la proteína del nucleótido libre usando una
columna "Micro Bio-Spin" (Bio-Rad), previamente equilibrada con amortiguador
de polimerización sin KCI (HEPES 50 mM (pH 7,0) ; MgCI2 5 mM). Se realizó
una dilución de 1:100 con la proteína equilibrada y se determinó su
concentración a partir de su valor de absorbancia a 280 nm. Los valores de los
coeficientes de extinción, de acuerdo a la composición de aminoácidos ,
corresponden a 47.900 M- 1 cm· 1 y 39.880 M- 1 cm· 1 para BtubA y BtubB,
respectivamente. Además, se debe incluir la contribución de GTP a la
absorbancia a 280 nm. El coeficiente de extinción de GTP a pH 7,0 es de
13.700 M- 1 cm· 1 a una longitud de onda de 254 nm. A una longitud de 280 nm,
GTP absorbe aproximadamente un 58,3% con respecto a su máximo valor de
absorbancia. Esto significa que el coeficiente de extinción de GTP a 280 nm es
aproximadamente 7.987,1 M- 1 cm· 1 . Suponiendo que BtubA y BtubB unen cada
una un mol de GTP, el coeficiente de extinción molar corregido corresponde a
103.754,2 M- 1 cm· 1 .
2.2.5. Marcación fluorescente de la tubulina bacteriana BtubAIB
Para observar la polimerización de los filamentos de BtubA/B, se
estandarizó un método de marcaje fluorescente que permitió obtener una
relación de marcaje sonda:proteína (DOL) de aproximadamente 1:1 . La
relación 1:1 del marcaje se consiguió en base a las propiedades químicas de la
sonda fluorescente. La tubulina bacteriana se modificó con las sondas 5,6-
carboxitetrametilrodamina, succinimidil éster (TAMRA) y Alexa Fluor 488, las
que reaccionan con los grupos amina alifáticos no protonados que incluyen el
33

amino terminal de las proteínas (pKa= 8,0) y el grupo r.-amino de las lisinas
(pKa=1 0,5). Para no marcar las lisinas (que generalmente se ubican en la
superficie de las proteínas) se debe usar un amortiguador más cercano al pH
neutro, el cual permite marcar específicamente el extremo amino terminal. Esto
se hizo con el amortiguador HEPES 50 mM (pH 7,0), el cual se usó también
para la purificación y todos los ensayos de polimerización. Además del pH del
amortiguador, también se consideró la relación molar sonda/proteína de la
reacción de conjugación. Se hicieron varios ensayos de marcaje a distintas
relaciones molares sonda: proteína. Una relación molar sonda:proteína de 10:1
permitió la obtención de un DOL de 1:1. Para la cuantificación precisa de las
sondas (TAMRA o Alexa Fluor 488), se disolvió aproximadamente 0,5 mg de
cada una en 50 ¡JL de DMSO. Se tomó 1 ¡.¡L y se hizo una dilución de 1:10.000
en el amortiguador HEPES 50 mM (pH 7,0) y se calculó la concentración de
cada una de las sondas utilizando los valores de la absorbancia máxima y el
coeficiente de extinción indicados por el fabricante (lnvitrogen; TAMRA 555
nm/65.000 M- 1 cm- 1 ; Alexa Fluor 488 519 nm/ 73.000 M- 1 cm-\ Se prepararon
150 ¡.¡L de una solución de BtubAJB 200 ¡.¡M en amortiguador HEPES 50 mM
(pH 7,0) y se le adicionó la sonda previamente cuantificada a una
concentración final de 2 mM . La mezcla se incubó en hielo por 1 h con
agitación ocasional suave y en oscuridad. Después se separó la proteína
marcada de la sonda libre con dos columnas "Micro Bio-Spin" (Bio-Rad;
previamente equilibradas con el amortiguador HEPES 50 mM (pH 7,0)) y se le
adicionó KCI 200 mM y MgCI2 5 mM . Se incubó a temperatura ambiente por 1 O
min y en oscuridad. Para seleccionar la proteína marcada competente para
polimerizar, se adicionó GTP 1 mM y se ultracentrifugó a 100.000 x g por 15
min a 25°C. El precipitado se suspendió en amortiguador HEPES 50 mM (pH
7,0), se incubó en hielo por 20 min y en oscuridad y se ultracentrifugó a
100.000 x g por 15 min a 4 oc para eliminar los agregados. La proteína
marcada se microdializó por 6 horas en oscuridad a 4°C contra 100 ml de
34

amortiguador HE PES 50 mM (pH 7 ,0). Se ultracentrifugó la proteína marcada
por 15 mina 100.000 x g y 4°C, y se guardó en alícuotas de 20 1-JL a -80°C para
su posterior uso. Para determinar el DOL de la proteína marcada, se
descongeló una alícuota de 20 1-JL de BtubAIB-TAMRA y se incubó en hielo con
GTP 1 mM, como se indica en el método de cuantificación de BtubAIB (2.2.4).
Se hizo un espectro de absorción de una solución 1:100 de la proteína
marcada que se obtuvo desde la columna "Micro Bio-Spin" (Bio-Rad). Para
calcular la concentración de proteína, se determinó su absorbancia a 280 nm
sin la contribución de la sonda unida, utilizando la siguiente relación:
Aproteína 280 nm = A2a0 - Amáx X (CF)
donde A28o es la absorbancia a 280 nm que se obtuvo del espectro de
absorción; Amáx es la absorbancia en la longitud de onda de máxima absorción
de la sonda, y CF es la contribución de la sonda a la A2ao (C F= A2ao sonda
libre/Amáx sonda libre) y que en estas condiciones tuvo un valor de 0,23 para el
TAMRA y de 0,17 para el Alexa Fluor 488 (lnvitrogen da un valor de 0,30 para
el TAMRA y de O, 11 para el Alexa Fluor 488 a pH 8,0). A partir del valor de la
absorbancia de la proteína a 280 nm se determinó su concentración
aproximada con el coeficiente de extinción molar teórico (1 03.754,2 M- 1 cm- 1 ) .
La concentración de la sonda se determinó con el valor de la absorbancia en
sus respectivos máximos de absorción y con los coeficientes de extinción molar
dados por el fabricante. La razón entre la concentración molar de la sonda y la
concentración molar de la proteína es igual al DOL.
2.2.6. Ensayos de la actividad GTPásica
La actividad GTPásica de BtubAIB se determinó midiendo la
concentración del fosfato liberado con el ensayo de verde de malaquita
35

Soluciones "stock":
1. Solución "stock" de verde de malaquita 1,32 mM en H2S04 3,1 M:
agregar 8,3 mL de H2S0 4 95% a 41 ,7 mL de agua nanopura. Esperar
que se enfríe y agregar 61 mg de verde malaquita.
2. Solución "stock" de molibdato de amonio al 15% en agua nanopura.
3. Solución "stock" de Tween 20 al11 % en agua nanopura.
2.2.7. Ensayos de polimerización por dispersión de luz
Se siguió la cinética de polimerización de BtubA/B con ensayos de
dispersión de luz en un ángulo de 90 grados en un espectrofluorímetro Perkin­
Eimer LS-508, usando una longitud de onda de excitación y emisión de 350
nm, anchos de banda de excitación y emisión de 5 nm y un filtro de transmisión
de 4%. A partir de una solución de BtubA/B 400 1-JM que se encuentra en
amortiguador de polimerización sin KCI (HEPES 50 mM (pH 7,0); MgCI2 5 mM),
se preparó una solución de BtubA/B 20 1-JM en amortiguador de polimerización
con cantidades crecientes de KCI (0,0; 3,13; 6,25; 12,5; 25,0; 50,0; 1 00,0;
200,0; 500,0; 1.000,0 y 2.000,0 mM). La preparación de esta solución de
BtubA/B 20 !JM produjo una dilución de KCI de un 5% con respecto al valor que
se indica. La solución de BtubA/B 20 1-JM se diluyó en serie, con el
amortiguador respectivo, al 75% de su valor inicial para alcanzar las
concentraciones de BtubA/B de 20 ,0; 11,25; 8,44 ; 6,33; 4,75; 6,33; 4,75; 3,55;
2,67; 2,0 y 1,5 !JM. Cada solución se colocó en una cubeta de cuarzo de 500
1-JL y 1 cm de paso óptico y se registró la dispersión de la solución por 5 min a
temperatura ambiente y sin la adición de GTP para establecer la línea base. La
reacción se inició con la adición de GTP 1 mM y la solución se homogeneizó
por inversión de la cubeta (3 veces). Las medidas de dispersión de luz
comenzaron 15-20 s después de la adición del nucleótido.
37

2.2.8. Microscopía electrónica
Se polimerizó BtubAIB 5 ¡.JM con GTP 1 mM en amortiguador de
polimerización con diferentes concentraciones de KCI y a temperatura
ambiente. Después de 5 min, se adicionó 4 ¡.JL de la mezcla de la reacción a
una grilla de cobre cubierta con carbón. Despúes que las grillas se lavaron tres
veces en el amortiguador de polimerización respectivo, se tiñeron
negativamente con formato de uranílo O, 75%. Las imágenes de las muestras se
obtuvieron a 25°C en un microscopio electrónico Tecnai T12 y con una
magnificación de 52.000X.
2.2.9. Ensayos de precipitación de polímeros a alta velocidad
Se prepararon soluciones de BtubAIB a distintas concentraciones en el
amortiguador de polimerización con distintas concentraciones de KCI. Las
reacciónes se iniciaron a temperatura ambiente con la adición de GTP 1 mM e
inmediatamente se ultracentrifugaron a 100.000 x g en un rotor TLA 100.4 a
25°C por 15 min. Se suspendieron los precipitados en amortiguador de
polimerización sin KCI, se combinaron con amortiguador de carga, se hirvieron
por 1 O m in y se separaron por electroforesis en geles de acrilamida al 1 O% o
en geles en gradiente de acrilamida "Precast" (4-20%; Biorad) cuando se
estimó necesario cuantificar las muestras. Los geles se tiñeron con azul de
Coomassie y se cuantificaron con el programa tmageJ
(http://rsbweb.nih.gov/ij/). Se calibraron las concentraciones con estándares de
BtubAIB cargados en el mismo gel.
38

2.2.10. Observación de la polimerización de BtubA/8 por microscopía
confocal
Este protocolo lo diseñó Viviana Risca en el laboratorio de Dan Fletcher
(Universidad de California, Berkeley) y está basado en el protocolo del lavado
ácido de los cubreobjetos del laboratorio de T ed Salman:
(http://www.bio.unc.edu/faculty/salmon/lab/protocolscoverslippreps.html)
Preparación de los cubreobjetos
Se calentaron sin hervir en un microondas 150 ml de agua nanopura,
dentro de un vaso precipitado de 250 ml, y se adicionó los cubreobjetos uno
por uno al agua caliente para evitar que se pegaran entre si. Bajo campana se
adicionó HCI 1 M al vaso precipitado con el agua caliente y los cubreobjetos, se
mezclaron y cubrieron con parafilm y papel aluminio. Las etapas de este
procedimiento de lavado ácido de los cubreobjetos son:
1. Se calentaron los cubreobjetos (22 x 40 mm para los canales de
reacción; 22 x 22 mm para los cubiertos de poli-L-Iisina) en el vaso
precipitado con HCI1 M a 50-60°C por 4-16 h.
2. Se enfriaron a temperatura ambiente.
3. Se eliminó el HCI con 100 ml de agua nanopura, tres veces.
4. Se llenó el vaso con 150 ml de agua nanopura y se sonicó en un baño
de agua por 20 minutos. Alternativamente, se puede sonicar
directamente el vaso con agua nanopura con los cubreobjetos con un
pulso de 20 min y con una salida de valor 8 (Misonix Sonicator 3000).
5. Se repitió dos veces el paso 4.
6. Se agregó 200 ml de etanol 50% (Merck, grado HPLC) en agua
nanopura y se sonicó igual que en el paso 4.
39

7. Se agregó 200 mL de etanol 70% (Merck, grado HPLC) en agua
Notas:
nanopura y se sonicó igual que en el paso 4.
8. Se agregó 200 mL de etanol 95% (Merck, grado HPLC) en agua
nanopura y se sonicó igual que en el paso 4.
9. Se agregó 200 mL de etanol 95% (Merck, grado HPLC) en agua
nanopura. Los cubreobjetos se pueden almacenar en esta solución.
1 O. Antes de usar, los cubreobjetos se lavaron con agua nanopura y se
secaron en un horno o con una corriente de aire/nitrógeno filtrada.
• El protocolo original utiliza 30 min de sonicación, sin embargo 20 min
son suficientes.
• Los cubreobjetos se pueden almacenar en etanol 95% (paso 9) por al
menos 2 semanas y probablemente un poco más.
• En el protocolo original del laboratorio de Ted Salmen no se indica como
secar los cubreobjetos justo antes de ser usados. Cuando se seca
directamente el etanol en un horno funciona , pero algunas zonas no se
observan correctamente. Para un mejor resultado es recomendable
lavarlos con agua nanopura (3 veces) y secarlos en un horno o con una
corriente de aire/nitrógeno filtrada .
Cubreobjetos cubiertos de Poli-L-Lisina (PLL)
1. Se lavó los cubreobjetos con agua nanopura y se removió el exceso de
agua dando toques con el vértice del cubreobjetos sobre papel filtro
absorbente.
2. Se sumergió los cubreobjetos en una placa de petri con PLL 0,1 % w¡v
(Sigma P8920) y se secaron por 30 min a temperatura ambiente en una
gradilla de cubreobjetos cubiertos por un "taper" para evitar el material
40

particulado del aire . También se puede realizar este procedimiento a 4°C
por 24 h.
3. Se tomó los cubreobjetos con una pinza y se lavaron uno por uno por
inmersión (10 veces) en un vaso precipitado con agua nanopura para
eliminar el exceso de PLL. Se cambió el agua nanopura cada dos
cubreobjetos.
4. Se lavó los cubreobjetos por inmersión en etanol 100% y se colocaron
en un "rack" dentro de un horno para secarlos.
5. Para guardar los cubreobjetos por un período largo de tiempo (meses),
se deben colocar en un "sandwich" de papel filtro dentro de una placa de
Petri sellada con parafilm. Lavar con etanol 100% (paso 4) antes de
usarlos.
Montaje de los canales de flujo para la polimerización de BtubA/8
Materiales. Portaobjetos estándar (25,4 x 76,2 mm; 1-1 ,2 mm ancho); cinta
adhesiva de doble cara 3M; cubreobjetos (22 x 40 mm) lavados con ácido;
cámara húmeda hecha de una caja de puntas de pipeta con agua nanopura en
el fondo y dos palillos de mondadientes paralelos sobre la superficie donde van
las puntas, para mantener el portaobjetos separado de la superficie plástica.
Alternativamente, una cámara húmeda puede ser fabricada con una placa de
Petri grande con dos palillos pegados dentro y papel absorbente empapado
con agua nanopura alrededor del borde de la placa para proporcionar la
humedad.
1. Los portaobjetos no necesitan ser limpiados de n1nguna forma en
especial, pero usualmente se limpiaron con papel de cubetas para
remover el polvo.
41

2. Se cortaron dos trozos largos de la cinta adhesiva doble y se colocaron
cuidadosamente sobre el portabojetos, sin tocar la parte de la cinta
adhesiva que quedó libre y que contactará al cubreobjetos. Para obtener
un canal de 12 ¡.¡L de flujo, se requiere una separación de 4 mm entre
los dos trozos de la cinta adhesiva y el canal debe estar orientado de
forma perpendicular a la cara larga del portaobjetos.
3. Se cortó los extremos de la cinta adhesiva hacia abajo y a lo largo de!
portaobjetos con un cuchillo cartonero o una hoja de afeitar.
4. Se colocó con mucho cuidado sobre las cintas adhesivas (en un
movimiento) un cubreobjetos lavado con ácido, con su cara larga
perpendicular a la cara larga del portaobjetos. Se usó una punta de
pipeta P1 000 para presionar suavemente el cubreobjetos en la zona de
contacto con la cinta adhesiva hasta que ésta se puso más oscura, lo
que asegura un buen sellado.
5. Se dió vuelta el canal y se colocó en la cámara húmeda sobre los
palillos.
6. Se colocó la solución con la pipeta sobre el cubreobjetos, cerca de la
entrada del canal. La capilaridad hizo fluir la solución hacia el canal.
7. Se lavó el canal con papel filtro (o papel absorbente) para succionar la
solución desde el otro extremo del canal , mientras se pipeteó solución
cerca de la entrada del canal. El volumen de la solución de lavado fue
de 10 veces el volúmen del canal.
8. Se hizo fluir la muestra, con al menos dos volúmenes del canal, lo que
aseguró un intercambio total.
42

Notas:
2
[
5
6
pipeta
• Asegurarse de no formar burbujas. Mientras se succiona la solución con
el papel filtro, asegurarse de que siempre hay más solución en la
entrada del canal o si no el canal se secará Si se observa una forma de
menisco es porque el canal se está secando y se debe colocar
suavemente con la pipeta más solución en el área de la cinta adhesiva
contigua a la entrada del canal para evitar la formación de una burbuja.
Evitar la presión sobre el cubreobjetos, pues también se forman
burbujas.
• Depués de incubaciones largas se forma una fila de burbujas a lo largo
del borde de la cinta adhesiva debido al aire que quedó atrapado por
ésta. Esto es normal y sólo se debe evitar enfocar en esa área.
• El flujo de la solución a lo largo del canal no es uniforme, es mucho más
lento cerca de los bordes.
Remoción del oxígeno
Para la microscopía de fluorescencia es esencial remover el oxígeno
para disminuir el daño debido a la iluminación durante la excitación, y al
apagamiento producido por éste. El método comunmente usado para remover
43

Microscopía
Para observar una muestra en el microscopio:
1. Se fabricó el canal de flujo. Se hizo fluir por el canal de flujo el anticuerpo
anti-rodamina a una dilución de 1:100 en el amortiguador de polimerización
y se incubó por 15 mina temperatura ambiente.
2. Se lavó el canal con 100 1-1L del amortiguador de polimerización. Se hizo
fluir 50 1-1L de ácido plurónico 10% (bloqueador) y se incubó por 1 O m in .
3. Se lavó con 50 1-1L de ácido plurónico 10%.
4 . Se hizo fluir una dilución 1:100 de una solución de "semillas" de BtubA/B
estabilizadas con GMPCPP. Se incubó por 5 min a temperatura ambiente.
Para sintetizar las "semillas" se polimerizó BtubA/B 51-1M (50% marcada con
TAMRA) con GMPCPP 0,5 mM por 5 min en el amortiguador de
polimerización que se ensayó y se ultracentrifugó a 100.000 x g por 15 min
a 25°C. El sobrendante se descartó y el precipitado se suspendió en el
amortiguador de polimerización con ácido plurónico 1 O%.
5. Se lavó con 50 1-JL de ácido plurónico 10%.
6. Se hizo fluir una mezcla de BtubA/B a una concentración determinada (30%
marcada con TAMRA) , GTP 1 mM, la mezcla de "gloxy" para remover el
oxígeno, y glucosa. Para prevenir que el canal se seque se puede sellar con
VALAP (vaselina 33%; lanolina 33%; parafina 33%) .
7. Se visualizó con un objetivo 100x cuando fue posible, pero a 63x y con
aceite de inmersión se observó bien. Se visualizó el crecimiento de los
filamentos en un microscopio confocal "spinning disk" y se registraron las
imágenes cada 2 s por 10 min. No se observó daño de la muestra debido a
la excitación.
45

ya sea como acetato de potasio (Sontag y co\s., 2005) o cloruro de potasio
(Schlieper y cols., 2005). En ausencia de KCI no se pudo purificar BtubA/B.
Además, en la estandarización de este nuevo método de purificación se observó
que e\ uso de cloruro de sodio, a la misma concentración y condiciones usadas
con el potasio, no induce la polimerización de BtubA/B. Se usó como
amortiguador HEPES (pH 7,0) en su forma de ácido libre, para titularlo con
hidróxido de potasio y así eliminar un posible efecto negativo del sodio en \a
polimerización de BtubA/B. Como se observa en la Figura 8A, después de 4
horas de inducción, BtubA/B es la proteína que se encuentra en mayor cantidad
en la fracción soluble del lisado bacteriano y que después del tercer ciclo de
polimerización y despolimerización se obtiene prácticamente pura y en gran
cantidad, con un rendimiento de 300 a 400 mg por cada 12 L de cultivo celular
(Video Suplementario 1).
Para determinar las propiedades de la polimerización de BtubA/B se
marcó la proteína con las sondas fluorescentes TAMRA y Alexa Fluor 488 (Ver
Materiales y Métodos). Una relación molar de 10:1 (sonda:proteína) permitió la
obtención de una proteína funcional con un grado de marcaje de
aproximadamente una molécula de sonda por molécula de proteína
(heterodímero) (Figura 88).
47

3.2. Caracterización del efecto de potasio sobre la polimerización y la
actividad GTPásica de 8tubA/8
3.2.1. Efecto de potasio sobre la polimerización de 8tubAIB
El desarrollo del nuevo método de purificación de BtubA/B empleado en
este trabajo de tesis permitió corroborar que la polimerización de BtubA/B es
estimulada fuertemente con la adición de KCI (Schlieper y cols., 2005) y que
esta estimulación es específica para el potasio, pues con la utilización de cloruro
de sodio no se pudo purificar la proteína. Sin embargo, no se conoce como el
potasio produce esta estimulación de la polimerización . Por esta razón , se
propuso como objetivo determinar el efecto de potasio sobre la polimerización
de BtubA/8. Para esto, se visualizó los polímeros formados en presencia de
potasio por microscopía confocal y microscopía electrónica, se analizó la
cinética de polimerización de BtubAIB mediante dispersión de luz, y se
cuantificó la cantidad de polímeros por sedimentación a alta velocidad.
3.2.1.1. Microscopía de fluorescencia y microscopía
visualización de los filamentos de 8tubA/8
concentraciones de cloruro de potasio
electrónica:
a distintas
Microscopía confocal. Para observar en solución los polímeros que BtubAIB
forma en presencia de distintas concentraciones de KCI, se incubó BtubA/B 5
!JM (15% del total corresponde a proteína marcada con la sonda TAMRA
denominada BtubA/B-TAMRA) en amortiguador de polimerización (HEPES 50
mM (pH 7,0); MgCI2 5 mM) en ausencia y con diferentes concentraciones de KCI
(50; 1 00; 200; 500 y 1.000 mM) y se adicionó GTP 1 mM para iniciar la
polimerización. Después de 5 min de reacción , se adicionó una alícuota de cada
49

A
B
Figura 9. Microscopía confocal del producto de la polimerización de BtubA/8 en
presencia de distintas concentraciones de KCI.
51

Figura 9. Microscopía confocal del producto de la polimerización de BtubA/8 en
presencia de distintas concentraciones de KCI.
(A) BtubN B 5 11M (BtubA/B-TAMRA 15%) se incubó en amortiguador de
polimerización a 25°C, en las distintas concentraciones de KCI (mM) indicadas en el
borde superior derecho de las microfotografías y se inició la reacción co n la adición de
GTP a una concentración final de 1 mM. 5 minutos después se visualizó cada muestra
sobre un cubreobjetos por microscopí a confocal. Barra= 1 O ¡Jm. (B) Se polimerizó a/¡3tubulina
marcada con la sonda TAMRA ("Cytoskeleton, lnc") a un a concentración de
50 1-1M en el amortiguador PIPES 80 mM (pH 6,9); EGTA 0,5 mM; MgCI2 2,0 mM;
glicerol 5%, GTP 1 ,O mM a 25°C. Se visualizó los microtúbulos sobre un cubreobjetos
por microscopía de epifluorescencia. Barra= 1 O ¡Jm.
52

Microscopía electrónica. Previamente se reportó que los polímeros o
filamentos simples de BtubAIB no son microtúbulos, pero están formad os por
dos protofilamentos similares a los formados por a/¡3-tubulina y FtsZ (Schlieper
y cols. , 2005; Sontag y cols., 2005). Además, los filamentos simples forman
manojos de polímeros de protofilamentos dobles. La mayoría de estos
polímeros de protofilamentos dobles son rectos y poseen un giro repetitivo.
Como se mencionó anteriormente, en estos dos trabajos se usó amortiguador
de polimerización con KCI 200 mM o con KAc 350 mM, concentraciones
salinas altas, que de acuerdo a lo descrito anteriormente, favorecerían la
polimerización y la formación de manojos de filamentos .
Para analizar la estructura de los polímeros que BtubAIB forma en
presencia de las distintas concentraciones de KCI, se incubó BtubAIB 5 1-1M en
amortiguador de polimerización, en ausencia y con diferentes concentraciones
de KCI (25; 50; 100; 200 y 2.000 mM) y se adicionó GTP 1 mM para iniciar la
polimerización. Después de 5 min de reacción , se tomó una alícuota de cada
reacción y se tiñeron con tinción negativa con formato de uranilo y se obtuvo
imágenes de las muestras usando microscopía electrónica. Se confirmó que los
polímeros de BtubAIB corresponden a un par de protofilamentos rectos de
aproximadamente 1 O nm de diámetro, que se entralazan entre sí, de manera
similar a la actina, ParM y MreB. Los pares de protofilamentos interactúan entre
si para formar manojos (Figura 1 OA). Estos manojos de filamentos carecen del
empaquetamiento lateral regular de la pared de los microtúbulos y se asemejan
más a los manojos de filamentos de FtsZ inducidos con calcio (Lu y cols. , 2000).
En ausencia de KCI no se observó filamentos , pero el incremento de la
concentración de KCI produjo un aumento en el número y largo de éstos, junto
con la formación de manojos (Figura 1 OB). A 2 M de esta sal, los manojos
contienen unos 7 filamentos y son más cortos, pues la proteína soluble
disponible para polimerizar se hace limitante (Figura 1 OC).
53

e
Figura 10. Microscopía electrónica del producto de la polimerización de BtubAIB
en presencia de distintas concentraciones de KCI.
BtubA/B 5 1-1M se polimerizó en amortiguador de polimerización a 25°C con GTP 1 mM,
en presencia de distintas concentraciones de KCI y se tiñó con formato de uranilo
0,75%. Se visualizó por microscopía electrónica de transmisión. La concentración de
KCI está indicada en cada figura. Barra= 100 nm.
54

necesario titularlo con una base fuerte para alcanzar el pH 7,0. Para determinar
el efecto de potasio del amortiguador, se incubó por 5 minutos a temperatura
ambiente diferentes concentraciones de BtubAIB (2,0; 2,67; 3,56; 4,75; 6,33;
8,44; 11 ,25; 15,0; 20,0 1-1M) en amortiguador de polimerización sin KCI (HEPES
50 mM (pH 7,0); MgCb 5 mM) para establecer la línea base de la señal de
dispersión y luego, se indujo la polimerización de BtubAIB a 25°C con una
concentración saturante de GTP (1 mM) . Si se considera que KOH se disocia
completamente en solución, la concentración de potasio sería de
aproximadamente 1 O mM, de acuerdo al volumen usado de KOH 5 M. Como
control se polimerizó BtubAIB 20 1-1M en amortiguador de polimerización titulado
con NaOH. La Figura 11A muestra los cambios en el tiempo de la absorbancia
o señal de dispersión de luz (unidades arbitrarias, u.a.) debido a la
polimerización de BtubAIB en ausencia de KCI. BtubAIB 20 1-JM no polimerizó
con el amortiguador HEPES titulado con NaOH (resu ltado no mostrado), lo que
reafirmó que el requerimiento para la polimerización es específico para potasio.
Cuando se usó el amortiguador titulado con KOH , se observó a partir de una
concentración de BtubAIB 11,25 1-JM, un incremento en la señal de dispersión
de luz directamente proporcional a la concentración de BtubAIB.
Las tres curvas que describen el curso temporal de la polimerización de
BtubAIB sin KCI son sigmoideas y muestran claramente una etapa de latencia
o etapa de nucleación seguidas por la etapa de elongación y la aproximación a
un valor máximo que disminuye en forma más pronunciada a mayor
concentración de proteína (Figura 11A). El máximo valor de intensidad se
alcanzó aproximadamente a los 2,0 min (BtubAIB 20,0 1-JM), 2,8 min (BtubAIB
15,0 1-JM) y 5,0 min (BtubAIB 11 ,25 1-JM) y probablemente durante éste, los
filamentos son muy dinámicos y polimerizan y despolimerizan continuamente.
La disminución de la intensidad de la luz dispersada que sigue al máximo se
debe al agotamiento de GTP debido a la hidrólisis. Esta disminución de la señal
de dispersión de luz indica el inicio de la despolimerización de los filamentos.
56

Cinética de polimerización de BtubAIB en presencia de KCI. De acuerdo a
lo esperado, la polimerización de BtubA/B en presencia de KCI 3,13 mM,
produjo un aumento de la intensidad de dispersión de luz (unidades arbitrarias,
u.a.), en comparación a las concentraciones equivalentes de proteína en
ausencia de KCI (Figura 11A) y se obtuvo polimerización de BtubAIB a una
menor concentración (8,44 1-JM) (Figura 12A) en comparación a sin KCI (11 ,25
¡.¡M). Las curvas muestran un comportamiento sigmoideo. De la misma forma,
el incremento de la concentración de KCI a 12,5 mM en el amortiguador de
polimerización produjo un aumento de la velocidad de polimerización y
aumentó el valor del máximo (Figura 128). Con KCI100,0 mM (Figura 12C), se
observó la polimerización de BtubA/B a una concentración de 3,46 1-JM . A
concentraciones mayores de proteína se observó una rápida polimerización y
un gran aumento de la intensidad de dispersión de luz, la que incluso se salió
de la escala a una concentración de BtubA/B 20 1-JM. Prácticamente no se pudo
observar una etapa de nucleación y las cinéticas de polimerización
aparentemente no son sigmoídeas, sino más bien parecen tener dos fases, una
muy rápida y una segunda un poco más lenta al aproximarse al máximo. Este
comportamiento probablemente se debe a la cinética de formación de los
manojos de filamentos de BtubA/B. Con KCI 500,0 mM (Figura 120), el
aumento de dispersión de luz es muy rápido y sólo se pudo analizar las curvas
bajo valores de concentración de BtubA/B 8,44 1-JM , pues valores más altos se
salieron de la escala de medición. A esta concentración de KCI se obtuvo
polimerización a partir de una concentración de BtubA/B 2,67 1-JM,
concentración a la cual se pudo apreciar claramente el período de nucleación.
A concentraciones mayores de BtubA/B hubo que aumentar la resolución en el
campo (hasta 3 min) para observar el período de nucleación (resultado no
mostrado). No se observó claramente en el período de elongación las dos
cinéticas que se observó en la Figura 12C y con KCI 200,0 mM (resultado no
mostrado). Sin embargo, las curvas no tienen una apariencia sigmoídea, lo que
59

podría indicar que, en presencia de KCI 500,0 mM , la segunda cinética es la
que predominaría durante la elongación o una combinación de ambas (Figura
120). Por otro lado, se observa un "plateau" con el incremento de la
concentración de KCI (Figura 12C) cuando se alcanza el máximo de
polimerización y que es producto de una disminución de la velocidad de la
despolimerización, la que prácticamente no se observó a una concentración de
KCI 500,0 mM (Figura 120). Esta es una conducta propia de los microtúbulos.
Se determinó la concentración crítica de la polimerización de BtubAIB en
función de las distintas concentraciones de KCI, a partir del gráfico del cambio
del máximo de la intensidad de dispersión de luz en función de la
concentración de la proteína (Figura 13A) y cuyos valores se obtuvieron a partir
de las cinéticas de polimerización de BtubA/B de la Figura 12. Además , se
incluyó en el análisis las cinéticas de polimerización realizadas en presencia de
KCI: 6,25; 25,0; 50 ,0; 200,0; 1000,0 y 2.000,0 mM (cinéticas de polimerización
no mostradas). Se observan dos poblaciones de líneas rectas, una con menor
pendiente hasta KCI 50,0 mM y la otra con mayor pendiente entre KCI 100,0 y
500,0 mM (Figura 13A). Este cambio en la pendiente es propio de un cambio
en la forma de los polímeros que en este caso podría corresponder a una
primera población de filamentos simples formados por dos protofilamentos y
una segunda población de manojos de filamentos simples. El incremento de la
concentración de KCI disminuye la concentración crítica de la polimerización de
BtubA/8 (Figura 138 y Tabla 1 ). Este valor indica la mínima cantidad de
BtubA/8 necesaria para polimerizar. En otras palabras, el aumento de la
velocidad de cambio de la señal de dispersión y el aumento de la intensidad
máxima en el estado estacionario, en función de la concentración de KCI, se
deben a que hay más proteína disponible para polimerizar. Se calculó el valor
de la constante de equilibrio de asociación de BtubAJB con los extremos del
polímero (Kec ) en cada condición salina (Tabla 1) y se observó que ésta
aumenta de un valor de O, 12 x 10 6 M- 1 , en ausencia de sal, a un valor de 1 ,49 x
60

10 6 M- 1 en presencia de KC\ 2,0 M. Este resultado muestra que el incremento
de KCI favorece fuertemente la asociación de las subunidades de BtubAJB con
los polímeros, los que se estabilizan probablemente por interacciones laterales
que refuerzan las longitudinales.
Tabla 1. Concentración crítica de la polimerización de BtubA/8 en función
de la concentración de KCI. Lista de los valores de las concentraciones
críticas calculados a partir del gráfico de la Figura 13A. El valor de la constante
de equilibrio equivale al inverso de la concentración crítica (Ce = 1/Kec).
KCI Concentración crítica Constante de equilibrio Kec
(mM) (IJM) (x 10 6 M- 1 )
0,0 9,47 O, 12
3,13 7,25 0,14
6,25 6,47 0,15
12,5 4,46 0,22
25,0 3,76 0,27
50,0 3,08 0,32
100,0 2,30 0,43
200,0 1,85 0,54
500,0 0,79 1,27
1000,0 0,70 1,43
2.000,0 0,67 1,49
61

Figura 12. Cinéticas de polimerización de BtubA/8 en presencia de
concentraciones crecientes de KCI.
Se polimerizó 8tubA/8 con GTP 1 mM en las mismas condiciones descritas en la
Figura 11A. (A) Polimerización de BtubA/8 en amortiguador de polimerización con KCI
3,13 mM. (B) Polimerización de 8tubA/8 en amortiguador de polimerización con KCI
12,5 mM . (C) Polimerización de BtubA/B en amortiguador de polimerización con KC\
100,0 mM. 8tubA/8 20 1-1M se salió de la escala de medición. (D) Polimerización de
8tubA/8 en amortiguador de polimerización con KCI 500,0 mM. Las tres primeras
concentraciones de BtubA/8 se salieron de \a escala de medición.
62

Cinética de polimerización de BtubA/8 a baja y alta concentración de KCI.
El incremento de la señal de dispersión de luz debido al aumento de la
concentración de KCI se debe a la disminución de la concentración crítica de la
polimerización, lo que permite que la proteína disponible para polimerizar sea
mayor, y también se debe a la formación de manojos de filamentos, porque
éstos dispersan la luz más efectivamente que los filamentos simples (Polka y
cols. , 2009). Esto dificulta el análisis y comparación del efecto de KCI sobre las
cinéticas de polimerización de BtubNB. Por este motivo, para poder comparar
la cinética de polimerización a baja y alta concentración de KC\, se utilizó
condiciones experimentales para cada concentración de KCI en las que se
mantuvo constante la concentración de polímeros formados en el máximo o
estado estacionario (==4 ¡JM). Este valor equivale a la proteína disponible para
polimerizar y se calculó a partir de la diferencia entre la concentración de
BtubNB usada y la concentración crítica de cada condición salina determinada
por dispersión de luz. Estas condiciones experimentales fueron:
8tubA/8 (IJM) KCI (mM) Ce (IJM) [8tubA/8] - Ce
11 ,25 3,13 7,25 4 ,00
8,44 12,50 4,46 3,98
6,33 100,0 2,30 4,03
4,75 500,0 0,79 3, 96
Se observa que las cinéticas de polimerización en presencia de KCI 3,13
y 12,5 mM tienen un máximo de intensidad parecido, con un comportamiento
sigmoídeo en el cual se aprecian claramente las etapas de nucleación y de
elongación y la despolimerización (Figura 14A). Sin embargo, las cinéticas de
polimerización en presencia de KCI 100,0 y 500,0 mM muestran una señal de
64

dispersión mucho mayor y las curvas de polimerización parecen no ser
sigmoídeas (Figura 14A).
Para comparar las velocidades de polimerización con una baja y alta
concentración de KCI, se normalizaron las curvas de polimerización con
respecto al máximo valor de la intensidad de dispersión de luz. La etapa inicial
de polimerización muestra que las velocidades iniciales del cambio de
dispersión de luz de BtubAIB son levemente mayores en presencia de una
concentración alta de sal (Figura 148). Sin embargo, en presencia de KCI
100,0 y 500,0 mM el máximo de intensidad se alcanzó en un tiempo mayor que
con una concentración menor de KCI. Se observa que hay dos fases de
crecimiento después de 30 segundos de iniciada la polimerización con KCI
100,0 mM: una rápida seguida de una más lenta que se aproxima a un estado
estacionario. La velocidad de despolimerización es mucho menor con altas
concentraciones de KCI.
65

A
B
500 J
---:-- 400
ro
:::l
- 300
"O
ro
"O
(/) 200
e
Q)
.......
e 100
o
1.0
ro
"O
ro 0.8
.!:::!
ro
E 0.6
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z
"O 0.4
ro
"O
(/)
e
Q) 0 .2
-e
0.0
o 2 4 6 8 10 12 14
Tiempo (min)
o 2 4 6 8 10 12 14
Tiempo (min )
Figura 14. Características de las cinéticas de polimerización a bajas y altas
concentraciones de KCI.
(A) Polimerización de BtubA/B 11 ,25 !JM en presencia de KCI 3,13 mM (curva negra);
BtubA/B 8,44 1-1M en presencia de KCI 12,5 mM (curva roja); BtubA/8 6,33 1-1M en
presencia de KCI 100,0 mM (curva verde) y BtubA/B 4,75 1-1M en presencia de KCI
500,0 mM (curva amarilla). En presencia de KCI _ 3,13 y 12,5 mM la señal es de
intensidad más baja y las curvas son sigmoídeas, en comparación a la polimerización
en presencia de KCI 100,0 y 500,0 mM , en donde la intensidad de las curvas es
mucho mayor y no tienen una apariencia sigmoídea. (B) Las cinéticas de
polimerización normalizadas con respecto a la intensidad muestran que la velocidad
de polimerización de BtubA/B es levemente menor a concentraciones bajas de KCI y
tienen una conducta sigmoídea, a diferencia de concentraciones altas de KCI , en las
que la polimerización no exhibe un comportamiento sigmoídeo y el tiempo para
alcanzar el máximo o estado estacionario es mayor.
66

deba al error experimental o al cambio de la forma de los polímeros que se
observa en la Figura 13A. En presencia de KCI 100,0 y 200,0 mM hubo un
incremento de la velocidad de nucleación de 2,5 veces. A una concentración de
KCI 0,5 y 1,0 M, la velocidad de nucleación aumentó aproximadamente 4 veces
respecto a lo observado en ausencia de KCI. El valor de la velocidad de
nucleación que se obtuvo en presencia de KCI 2,0 M probablemente se deba a
errores de la medición debido a la alta velocidad de polimerización.
Estos resultados indican que el incremento de la concentración de KCI
produjo un aumento del tamaño del núcleo de 1 a 4 subunidades o
heterodímeros de BtubNB y un aumento de la velocidad de nucleación.
69

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0,0 0,2
e KCI 0,0 mM ; y= 0,3402x- 2,0461
O KCI12,5 mM ; y= 1 ,0071x- 2,4878
..- KCI200 mM ; y = 1,5442x - 2,8548
6 KCI500 mM; y= 2,1832x- 3,2777
0,4 0,6 0,8 1 ,O 1,2
log([BtubA/8] - Ce)
Figura 15. Determinación del tamaño del núcleo y de las velocidades relativas de
nucleación de BtubA/8.
Para obtener cada punto se dividió la velocidad max1ma Wmáx) de la curva de
dispersión de luz por la máxima intensidad de la señal Umáx) y se graficó el logaritmo
de ese valor en función del logaritmo de la concentración de proteína disponible para
polimerizar. La pendiente de la regresión lineal equivale a n/2, en donde n es el
número de subunidades que se requieren para formar el núcleo de polimerización, y la
intersección con el eje "y" equivale a log (..Jkk*) que es una medida relativa de la
velocidad de nucleación.
1,4
70

3.2.1.3. Cuantificación de la polimerización de BtubAIB por
sedimentación a alta velocidad
Para analizar la cantidad de polímeros formados en las distintas
concentraciones de KCI, se usó sedimentación a alta velocidad para precipitar
los polímeros formados. Para esto se incubaron distintas concentraciones de
BtubA/B con diferentes concentraciones de KCI. Se indujo la polimerización
con GTP 1 mM a 25°C y se ultracentrifugó inmediatamente a 100.000 x g por
15 minutos a la misma temperatura y se visualizó el precipitado por SDS­
PAGE, como se indica en Materiales y Métodos. Se observó que el incremento
de KC I indujo la aparición de la proteína en el precipitado a menores
concentraciones respecto al ensayo sin KCI (Figura 16A). Este experimento se
repitió con geles de acrilamida en gradiente "Precast" (BioRad) para cuantificar
los polímeros formados con KCI 12,5; 50,0 y 200,0 mM (Figura 168). Se
cuantificó la intensidad de las bandas de cada gel con el programa IMAGEJ, se
calculó la concentración de proteína en el polímero precipitado (Ver Materiales
y Métodos) y se graficó en función de la concentración inicial de proteína
(Figura 16C). La intersección de la recta de la regresión lineal con el eje "x"
equivale a la concentración crítica de la polimerización: 4,59 IJM para KCI 12,5
mM; 3,75 ¡.JM para KCI 50 mM y 2,84 ¡.JM para KCI 200,0 mM . Estos valores son
similares a los obtenidos por dispersión de luz (Tabla 1 ).
71

3.2.2. Efecto de KCI sobre la actividad GTPásica de BtubA/8
La despolimerización de los microtúbulos y los filamentos de FtsZ se
debe a la hidrólisis de GTP, es decir, la hidrólisis del nucleótido hace al
polímero más inestable. En los experimentos de dispersión de luz (Figura 12)
se observó que el incremento de KCI produjo una reducción de la velocidad de
despolimerización con una retención de la permanencia de la señal de
dispersión. En otras palabras, el incremento de KCI produjo un aumento de la
estabilidad de los polímeros formados, lo que podría deberse a que KCI afecta
directa o indirectamente la hidrólisis de GTP de 8tubA/8 al polimerizar.
Para determinar el efecto de KCI sobre la actividad GTPásica de
8tubA/8, cantidades crecientes de 8tubA/8 se polimerizaron con GTP 1 mM en
presencia de diferentes concentraciones de KCI y se midió la velocidad de
hidrólisis de GTP (liberación del fosfato inorgánico (P¡)) a los 5 minutos de
iniciada la reacción con el método de verde de malaquita (ver Materiales y
Métodos). Se graficaron las velocidades de liberación del fosfato inorgánico en
función de la concentración de proteína (Figura 17 A). Se observa que en
ausencia de KCI, la velocidad de hidrólisis de GTP es proporcional a la
concentración de 8tubA/8 por sobre una concentración crítica de 10,84 f.! M,
valor muy similar al determinado por dispersión de luz. Esto indica que es
necesaria la polimerización para que ocurra la hidrólisis del nucleótido. La
pendiente de este gráfico corresponde al valor de la constante catalítica (kcat)
de 1,75 mol de GTP por minuto por mol de 8tubA/8. En presencia de KCI 3,13;
6,25; 12,5; 25,0 y 50,0 mM, los valores de las concentraciones críticas
disminuyen con el aumento de la concentración (Tabla 3) y son parecidos a los
determinados por dispersión de luz (Tabla 1 ). Por sobre KCI 100,0 mM, los
valores de las concentraciones críticas son diferentes a los obtenidos por
dispersión de luz, y la velocidad de hidrólisis de GTP y la kcat disminuyeron con
el incremento de KCI (Figura 178 y Tabla 3) .
73

Tabla 3. Constantes catalíticas y concentración crítica de la actividad
GTPásica de BtubAIB en función de la concentración de KCI. Los valores
de la kcat corresponden a la pendiente de la línea de regresión de la Figura
17 A cuya intersección con el eje "x" equivale a la concentración crítica de la
polimerización.
KCJ Constante catalítica, k cat Concentración crítica R¿
(mM) (min" 1 ) (IJM)
0,0 1,75 10,84 0,9862
3,13 1,91 8,76 0,9949
6,25 1,64 6, 80 0,9971
12,5 1,71 5,75 0,9981
25,0 2,04 4,56 0,9947
50,0 1,50 2,44 0,96 16
100,0 1,62 3,86 0,9138
200,0 1,29 6,29 0,9689
500,0 0,96 3,78 0,9435
1000,0 0,78 2,73 0,9698
2.000,0 0,63 3,23 0,9968
La hidrólisis de GTP favorece la despolimerización, en otras palabras, la
hidrólisis de GTP hace al polímero más inestable. En el caso de los
microtúbulos, cuando se alcanza la polimerización en el estado estacionario, el
hecho que se mantenga la actividad GTPásica constante refleja la adición y
liberación cíclica de los heterodímeros de la tubulina en los extremos de los
microtúbulos (David-Pfeuty y cols., 1977). En consecuencia, la disminución de
la hidrólisis de GTP inducida por KCI indica que esta sal favorece la cohesión
de los filamentos de BtubAIB desfavoreciendo la despolimerización. Esto
74

sugiere que la formación de manojos a altas concentraciones de KCI disminuye
la hidrólisis de GTP, pues los polímeros se hacen más estables y por lo tanto el
recambio de las subunidades es menor. De todos modos, no se puede
descartar un efecto directo de KCI sobre la actividad GTPásica de BtubNB.
75

3.3. Determinación de la polaridad cinética y estructural de los
filamentos de BtubA/8
Una pregunta básica con respecto al ensamblaje de los polímeros del
citoesqueleto es sobre la polaridad de crecimiento, es decir, si las subunidades
se adicionan con igual velocidad a cualquiera de los dos extremos del
filamento, como el homólogo bacteriano de la actina ParM (Garner y cols.,
2004) o si el crecimiento es mayor en un extremo del filamento con respecto al
otro, como los filamentos de actina y los microtúbulos. En el caso de BtubA/B,
el análisis de la estructura cristalina mostró que los heterodímeros de BtubA/B
se encuentran de forma alternada y continua en el cristal (que no corresponde
a un fi lamento), y además, BtubA y BtubB polimerizan en cantidades
equimolares (Schlieper y cols ., 2005), lo que indicaría que los filamentos de
BtubA/B tienen polaridad estructural. Se investigó in vitro , por microscopía
confocal, la polaridad de ensamblaje de los filamentos de BtubA/8. Se
polimerizó filamentos de BtubA/B marcados con la sonda fluorescente TAMRA
(roja) con un análogo no-hidrolizable de GTP (GMPCPP) y luego se adicionó
BtubA/B marcada con la sonda Alexa Fluor 488 (verde). Esto se hizo en
presencia de KCI a distintas concentraciones (Figura 18A). En presencia de
KCI 25,0 mM (Figura 188) se observó claramente que la mayoría de los
filamentos observados (90%) tenían un extremo rojo y el otro verde. Este
resultado demuestra que, al igual que los microtúbulos eucariontes, el
crecimiento de los filamentos de BtubA/B es polar o cinéticamente asimétrico.
La polaridad se observó hasta una concentración de KCI 100,0 mM , pues por
encima de ésta aparecieron filamentos amarillos que corresponden a manojos
de filamentos.
77

A
B
Figura 18. Determinación de la polaridad de ensamblaje de los filamentos de
BtubAIB.
78

Figura 18. Determinación de la polaridad de ensamblaje de los filamentos de
BtubA/8.
(A) Se polimerizó BtubNB 5 1-JM (BtubNB-TAMRA 30%) con GMPCPP 0,5 mM por 2
m in a temperatura ambiente, en ausencia y presencia de KCI: 3, 13; 6,25; 12,5; 25,0;
50,0; 100,0; 200,0 y 500,0 mM. Después se adicionó a cada condición BtubA/B 5 1-JM
(BtubA/B-Aiexa 488 30%), se incubó por 2 min y se diluyó la reacción 200 veces para la
observación en el microscopio. (B) Polimerización con KCI 25,0 mM. La imagen de la
izquierda es todo el campo visualizado con un objetivo 63x. Barra= 10 1-Jm . La imagen
de la derecha es una magnificación de la imagen de la izquierda. Barra= 5 1-Jm.
79

elongación neta es más rá pida en un extremo que se denominó extremo "más" y
el otro extremo que crece más lento se denominó extremo "menos". Esta
denominación es la que se utiliza en los microtúbulos y se refiere a una
polaridad estructural intrínseca del filamento.
3.4.1. Polimerización de BtubA/8 a diferentes concentraciones de KCI :
inestabilidad dinámica y "treadmilling"
3.4.1.1 . Observación directa de la polimerización
Para determinar las diferencias en la polimerización a diferentes
concentraciones de KCI y correlacionarlas con los resu ltados anteriores, se
visualizó la polimerización de BtubA/B en presencia de KCI 12,5 y 100,0 mM.
Para comparar la polimerización a estas dos concentraciones de KCI se eligió
una concentración de BtubA/B 3,0 ¡.J M. Esto significa que para KCI 12,5 mM la
concentración de BtubA/B se encuentra por debajo del valor de la concentración
crítica determinado por el método de dispersión de luz (4,5 1-J M). Sin embargo,
con KCI 100,0 mM , BtubA/B está por sobre el valor de la concentración crítica
(2,3 IJM) determinada por el mismo método.
Para iniciar la reacción se agregó GTP 1 ,O mM final a una solución de
BtubA/B 3,0 ¡JM, BtubA/B-TAMRA 30%, en amortiguador de po limerización con
KCI 12,5 mM , se mezcló y se hizo fluir inmediatamente en el canal (cámara) de
la reacción. Se registró la reacción de polimerización por 1 O minutos a intervalos
de 2 segundos y se observó crecer a los filamentos de BtubA/B a partir de sólo
un extremo de las "semillas" (Figura 198; Video Suplementario 2). No se
observó crecimiento a partir del otro extremo de la "semilla". Esto se debería a
que en el ensamblaje de un polímero polar que hidroliza GTP durante la
81

polimerización, la concentración crítica del extremo "más" (Ci ) es diferente a la
del extremo "menos" (C¿-) (Wegner, 1976). Por lo tanto, la Ce se sitúa entre la
concentración crítica de cada extremo del filamento (Erickson y O'Brien , 1992).
En este caso, BtubA/B 3,0 IJM está bajo la Ce de 4,6 1-1M con KCI 12,5 mM y por
ende también de la ce- (Ci < Ce < C¿-) , pero por sobre el valor de la e¿ del
extremo de crecimiento rápido (Ci < 3 11M < Ce). Esto impide la polimerización
neta de los filamentos a una concentración de BtubA/B entre la e¿ y la Ce,
debido a que la velocidad de despolimerización en el extremo "menos" excede a
la velocidad de polimerización del extremo "más" y sólo se observa
polimerización en este rango de co ncentración cuando el extremo "menos" está
anclado o estabilizado (Kirschner, 1980) y ésta es la función que cumplen las
"semillas" de BtubA/B. Cuando se usó KCI 100,0 mM (Figura 19C; Video
Suplementario 2) , también se observó el crecimiento de los fi lamentos a partir
de las "semillas". Sin embargo, los filamentos fueron más largos, con una
densidad de población mayor que con KCI 12,5 mM y con una tendencia a
interactuar entre si para formar manojos de filamentos largos y que se observan
con una intensidad de fluorescencia mucho mayor. Además, se observó que
con KCI 100,0 mM, las "semillas" también interactuaron entre sí (aumentó la
intensidad de fluorescencia) y se observó varios filamentos individuales que
crecieron para ambos lados y con igual velocidad a partir de estos manojos de
"semillas" (resultado no mostrado; Video suplementario 2). Si el crecimiento
para ambos lados se debió a la elongación a partir del extremo "más" y del
extremo "menos" de la "semilla", las velocidades deberían haber sido distintas.
No se observó una "semilla" de BtubA/B con un rápido crecimiento por un
extremo y uno más lento por el otro, lo que muestra que en presencia de KCI
100,0 mM la relación de las concentraciones críticas en cada extremo es:
Ce < 311M < e¡ y además, indicaría que los manojos de los filamentos de
BtubA/B tienen una polaridad mixta, es decir, no hay una alineación con
82

especto a la polaridad del filamento individual, sino que la polaridad del manojo
es mezclada.
3.4.1.2. Visualización de las fases y transiciones características del
mecanismo de inestabilidad dinámica
Se analizó el cambio de la longitud de los filamentos individuales de
BtubA/B en función del tiempo (Figura 190 y E), a partir de las secuencias de
polimerización de las Figuras 198 y 19C. Se tomó como origen el inicio de la
"semilla" y se midió la longitud del filamento a lo largo del tiempo con el
programa IMAGEJ. La mayoría de las veces los puntos quedan en una línea
recta que intercepta con el origen . La longitud de los filamentos con KCI 12,5
mM (8 a 14 ¡.Jm; Figura 190) fue menor en comparación a la longitud de los
filamentos con KCI100,0 mM (12 a 20 ¡Jm; Figura 19E). Se calculó la velocidad
de crecimiento de cada filamento de las rectas de cada gráfico y se estimó con
KCI 12,5 mM un promedio de velocidad de crecimiento de 1,54 ± 0,21 IJm min· 1
(n= 7) y con KCI 100 mM de 2,07 ± 0,2 ¡Jm min· 1 (n= 8). Esto indica que la
disminución de la concentración crítica de la polimerización, debido al
incremento de la concentración de KCI, produjo un aumento del número de los
filamentos y un aumento de la velocidad de polimerización, lo que es predicho
por el modelo de nucleación-elongación.
A partir del gráfico de la Figura 190 se observó que los filamentos de
BtubA/B, después de elongar a partir de las "semillas" durante un tiempo
variable, cambian abrúptamente (catástrofe) a una fase de rápido acortamiento.
Un filamento de BtubA/B en la fase de acortamiento puede despolimerizarse
completamente hasta el inicio de la "semilla" o experimentar una transición
abrupta a la fase de elongación (rescate). El tiempo para crecer y la máxima
longitud alcanzada antes del desensamblaje fueron variables entre los distintos
83

filamentos, lo que sugiere que el cambio de la fase de elongación a la fase de
rápido acortamiento es estocástico. Como resultado de esto, algunos filamentos
de BtubAIB se acortan mientras que otros crecen dentro del campo de
observación del microscop io. Esta propiedad de cambio entre fases de
elongación y acortamiento rápido es conocida como inestabilidad dinámica
(Mitchison and Kirschner, 1 984) y ha sido observada sólo en los microtúbulos
eucariontes y en los filamentos de ParM (Garner y cols., 2004). La Figura 20
(Video Suplementario 3) muestra un único filamento de BtubAIB que crece a
partir de una "semilla" y que muestra el extremo "más" que se detiene
repentinamente e inmed iatamente comienza a despolimerizarse a una velocidad
más alta que la de polimerización. La etapa de acortamiento también se detiene
repentinamente y el filamento de BtubAIB comienza a crecer nuevamente. La
velocidad promedio de las tres fases de elongación de este filamento fue de
1 ,41 ± 0,14 IJm min- 1 y para la fase de acortamiento no se pudo establecer una
velocidad, debido a los pocos puntos que se tienen en esta etapa, pero si se
considera el largo de la disminución del filamento, que fue de 3 ¡Jm
aproximadamente en 2 segundos, la velocidad de despolimerización varió entre
20 y 100 ¡Jm min- 1 en los tres eventos de catástrofe observados. De esta forma,
el extremo del filamento puede estar ya sea en la fase de crecimiento o en la
fase de acortamiento y puede alternar entre las dos fases en una manera
estocástica. Además, de acuerdo a lo postulado por la inestabilidad dinámica , la
fase de rápido acortamiento parece no ser una despolimerización de una
subunidad por unidad de tiempo, sino que más bien involucra la pérdida de
cientos de subunidades en cada incursión (Erickson y O'Brien, 1 992). Esto se
visualizó como la perdida de pequeños segmentos del filamento en lugar de una
despolimerización continua (Figura 20; Video Suplementario 3) .
Con KCI 100,0 mM no se observó este cambio de fases (Figura 1 9E), al
contrario, los filamentos crecen continuamente y después de cierto tiempo no es
84

posible seguirlos individualmente, pues interactúan entre si para formar los
manojos de filamentos.
85

Figura 19. Microscopía confocal de la polimerización in vitro de los filamentos
individuales de BtubAIB.
(A) Cámara de reacción para la polimerización de los filamentos individuales de
BtubA/B, donde se fijaron a la superficie del cubreobjetos a través de un anticuerpo
anti-rodamina. El filamento crece a partir de la "semilla" de BtubA/B. (B)
Microfotografías de fluorescencia a los 0,3; 5,0 y 10,0 minutos después de agregar a la
cámara de reacción una mezcla de BtubA/B 3,0 1-JM, BtubA/B-TAMRA 30% y GTP 1 ,O
mM en amortiguador de polimerización con KCI 12,5 mM. Los filamentos crecieron a
partir de filamentos preformados o "semillas" de BtubA/B marcados con BtubA/B­
TAMRA 50%. Barra= 10 ¡Jm. (C) El mismo experimento que en (B) pero con
amortiguador de polimerización con KCI 100,0 mM. Barra= 10 ¡Jm . (D) Cambio de la
longitud del extremo "más" de los filamentos (7 filamentos de la secuencia) que crecen
a partir de las "semillas" en función del tiempo con KCI 12,5 mM y que se muestra en
(B). (E) Cambio de longitud de los filamentos de BtubA/B en función del tiempo para 8
filamentos de la polimerización con KCI1 00,0 mM y que se muestra en (C).
87

pues se sintetizaron con GMPCPP. Sin embargo, con BtubAIB 3 ¡.JM y KCI 100,0
mM se observó "treadmilling" en varios filamentos (Figura 21 ; Video
Suplementario 4) y como se señaló anteriormente, en esta condición la
concentración de BtubAIB tiene una diferencia de 0,9 IJM por sobre la Ce. A
medida que la reacción continúa, la longitud del filamento tiende a estabilizarse,
lo que indica que se aproxima al estado estacionario.
Este resultado muestra que los extremos de un filamento de BtubA/B
tienen concentraciones críticas diferentes, lo que se traduce en que la velocidad
de polimerización y la velocidad de despolimerización son mayores en un
extremo del filamento con respecto al otro. Esto produce que en el estado
estacionario los filamentos de BtubAIB exhiban la dinámica de "treadmilling".
90

18
1- 11
16 1-
10
9
r 7 8 • • •
1- 6 extremo "+"
E 1- 4 5
• ••
:::1. 12 1- 3
• •
1- 2
1
(O 10 .... • • •
• •• • •
u - extremo "-"
e: 8 1-
- 14
._.,
·- •
...., (O - •
"'
•
• • •
6 -
:- ·- e 4 - •••••
• • •
- • • longitud total
2 - •
:o
1 1 1 1 1 1 1 1 1
o 1 2 3 4
Tiempo (m in)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Figura 21. "Treadmilling" de un filamento individual de BtubAJB.
Se polimerizó BtubA/B 3 iJM (BtubAIB-TAMRA 30%) en presencia de KCI 100 mM con
la adición de GTP 1 mM y se observó por microscopía confocal el curso temporal de la
reacción . El gráfico muestra el curso temporal de "treadmilling" de un filamento de
BtubAIB, cuya secuencia de micrografías de fluorescencia se muestra abajo. El
movimiento hacia adelante se consideró como el extremo en crecimiento y se
denominó extremo "más" ("+") (círculo en azul, flecha azul) y el extremo que se acortó
se denominó extremo "menos" ("-") (círculo en rojo, flecha roja ). El origen de la
coordenada se fijó con una marca dentro del campo de observación y que corresponde
a un agregado fluorescente. La longitud total del filamento es la diferencia de las
longitudes entre los dos extremos. Un valor casi idéntico se obtuvo para la longitud total
del filamento que se extrajo directamente de la secuencia del filamento en
"treadmilling". Barra= 5 ¡.Jm.
1
91

3.4.2. Determinación de las constantes de velocidad de asociación y de
disociación del extremo "más"
Para determinar la relación entre la velocidad de polimerización y la
concentración de BtubAIB, se analizó el cambio de longitud de los filamentos de
BtubAIB por 1 O minutos después de iniciada la observación con el microscopio y
a tres concentraciones de BtubAIB (Figura 22A-C). Debido a que el análisis de
las velocidades de polimerización se restringió a los filamentos que crecieron a
partir de las "semillas", la determinación de la velocidad de polimerización y por
ende, de la constante de asociación y de disociación se restringió al extremo de
rápido crecimiento o extremo "más" del filamento de BtubAIB . No fue posible
incrementar la concentración de la proteína para observar el crecimiento a partir
del extremo "menos", pues al aumentar la concentración de BtubAIB se hizo
muy difícil diferenciar a los filamentos del "background". Además, este análisis
sólo se realizó con una concentración de KCI 12,5 mM, pues a esta
concentración los filamentos son individuales y no se observó la formación de
manojos de filamentos. Se observó un incremento de la longitud de los
filamentos con el incremento de la concentración de BtubA/B (Figura 22A-C).
Con las tres concentraciones de proteína usadas se visualizó la fase de
catástrofe de los filamentos y la fase de rescate, la que a diferencia de la
catástrofe, sí parece aumentar con el incremento de la concentración de
BtubAJB. No hay forma de predecir cuándo va a ocurrir una transición de una
fase en particular, es decir, no se puede establecer que un filamento de BtubA/B
crece o se acorta en una distancia determinada antes de experimentar otra
transición abrupta. Además, la duración de la elongación y el acortamiento varió
considerablemente entre los distintos filamentos de BtubAIB y también en un
mismo filamento. Se determinó la velocidad promedio de la elongación de los
filamentos de BtubAIB a partir de las pendientes de las rectas de elongación de
cada filamento, previas al primer evento de catástrofe. Así , la velocidad de
92

Figura 22. Dependencia de la velocidad de polimerización de BtubAIB en función
de la concentración de proteína.
Curso temporal de la polimerización de los filamentos individuales de BtubA/B 2 IJM (A),
3 !JM (B) y 5 IJM (C) en presencia de KCI 12,5 mM. Sobre de cada gráfico (A-C) se
indica la velocidad promedio de la polimerización de los filamentos individuales de
BtubA/B que se determinó a partir del promedio de las pendientes de los filamentos
antes del primer evento de catástrofe , la desviación estándar (D.S.) y el número de
filamentos usados (n). (D) Relación entre la velocidad promedio de la polimerización y
la concentración de BtubAIB. La flecha indica la concentración crítica de la
polimerización del extremo "más". Con la regresión lineal de este grafico (y= 0,6416x -
0,657; R 2 = 0.9416) y asumiendo que 1 ¡.Jm del filamento corresponden a 250
heterodímeros o subunidades, se determinó la constante de velocidad de asociación ki
que se obtuvo a partir de la pendiente y la constante de velocidad de disociación k: 1
que se obtuvo a partir del intercepto de extrapolación de la recta de la regresión lineal
con el eje "y".
96

3.4.3. Polimerización de BtubA/8 en presencia de GMPCPP
Como ya se mencionó, los mecanismos dinámicos de los microtúbulos y
de los filamentos de actina son dependientes de la hidrólisis del nucleótido. Para
demostrar que las dinámicas de los filamentos de BtubAIB dependen de la
hidrólisis de GTP, se observó la polimerización de BtubAIB 5,0 ¡.¡M, KCI 12,5
mM, en presencia del análogo no hidrolizable GMPCPP 1,0 mM (Figura 23A).
Se observó una gran cantidad de filamentos cortos de aproximadamente 5 ¡.¡m
de longitud y que cuyo largo final se alcanzó a los 5 minutos de iniciada la
polimerización. A los 50 minutos de reacción, los filamentos cortos se visualizan
iguales que a los 1 O minutos (resultado no mostrado), lo que indica que estos
filamentos no exhiben mecanismos dinámicos de polimerización y
despolimerización. Como control se visualizó la polimerización de BtubAIB 5,0
¡.¡M, KCI 12,5 mM y GTP 1,0 mM. Se observó una menor densidad de
fi lamentos, pero de longitud mayor (Figura 238). Además, los filamentos
exhiben inestabilidad dinámica y "treadmilling", lo que se visualizó como un
continuo reordenamiento de los filamentos a lo largo del tiempo. Este
comportamiento continuó hasta los 45 minutos de iniciada la reacción . Este
resultado demuestra que, al igual que en los microtúbulos, la hidrólisis del
nucleótido es necesaria para la despolimerización pero no para la
polimerización de los filamentos de BtubAIB . Además, este resultado indicaría
que BtubAIB tiene mayor afinidad por GMPCPP que por GTP y/o que el
GMPCPP disminuye la concentración crítica de la po limerización , pues se
forman un gran número de pequeños filamentos de BtubAIB y como ya se
señaló, el número de filamentos es determinado en la fase de nucleación y
depende de la concentración crítica . Esto impidió el crecimiento de los
filamentos cortos debido a la poca disponibilidad de proteína libre para
polimerizar.
97

A
B
Figura 23. Microscopía confocal de la polimerización de los filamentos
individuales de BtubAIB con GMPCPP y GTP.
Se polimerizó una solución de BtubA/8 5,0 IJM (BtubA/8-TAMRA 30%) y KCI 12,5 mM
con GMPCPP y GTP por separado y se visualizó la reacción por microscopía confocal.
Los números indican el tiempo en minutos después de la adición del nucleótido. (A)
Polimerización con GMPCPP 1 ,O mM. Se observó una gran cantidad de filamentos
cortos de BtubA/8, los que elongaron aproximadamente sólo hasta los 5 minutos. (8)
Polimerización con GTP 1 ,O mM. Los filamentos individuales polimerizan y
despolimerizan a lo largo del tiempo y exhiben inestabilidad dinámica y "treadmilling".
Después de 45 minutos de reacción, la dinámica de los filamentos continuó. Barra= 1 O
IJm.
99

4. DISCUSIÓN
La función celular de BtubA/B es aún desconocida y se cree que
contribuye a la peculiar forma de tallo que tienen las especies de
Prosthecobacter. Por este motivo, en este trabajo de tesis se determinó in vitro
el mecanismo de polimerizacion y la estructura de los polímeros de BtubA/B,
pues esta aproximación es fundamental para entender el control del
ensamblaje de los filamentos de BtubA/B en la célula en el contexto del
citoesqueleto bacteriano. Los tres principales resultados obtenidos en este
trabajo son:
1. El ensamblaje de los filamentos de BtubA/B se ajusta al modelo de
nucleación-condensación.
2. Los filamentos de BtubA/B son estructuralmente polares.
3. Los filamentos de BtubA/B exhiben inestabilidad dinámica y
"treadmilling".
La caracterización de la polimerización de BtubA/B en función de la
concentración de cloruro de potasio permitió desarrollar un nuevo método para
purificar la proteína y también permitió controlar la polimerización para el
desarrollo de los ensayos de polaridad y los ensayos de la visualización de las
dinámicas de polimerización de los filamentos individuales de BtubA/B. Al
considerar la alta concentración de potasio intracelular que debería tener
Prosthecobacter (200-400 mM en el citoplasma de E. co/1) (Cayley y cols.,
1991 ; Record y cols., 1998), se hizo necesario determinar el mecanismo de la
estimulación de la polimerización de BtubA/B por KCI, en términos de entender
el control del ensamblaje de BtubA/B in vivo.
101

4.1. Purificación de BtubA/8 por ciclos de polimerización y
despolimerización
Muchos trabajos sobre la polimerización de tubulina en la década de los
80's se vieron alterados por proteínas que ce-purificaban con tubulina. De allí
que para caracterizar e! mecanismo de polimerización de BtubAIB es necesario
contar con una proteína pura y en gran cantidad , lo que obligó a mejorar y
optimizar la purificación de esta proteína. El desarrollo de un nuevo método de
purificación se basó en la polimerización de BtubAIB en presencia de GTP y
KCI (Schlieper y cols., 2005), y en la despolimerización de los polímeros al
disminuir la temperatura de la solución a 4°C. Las tres ventajas de este nuevo
método son:
1. Alto rendimiento en la purificación. Se obtuvo un rendimiento de 9 mg de
proteína por litro de cultivo de Escherichia co/i BL21 (ADE3) inducido con
IPTG. Este valor equivale al triple del rendimiento del procedimiento de
purificación que se usó previamente (Schlieper y co ls., 2005). Además,
este método no contempla el uso de columnas de filtración ni de
afinidad, pues sólo requiere de ultracentrifugación.
2. Obtención de BtubA y BtubB en cantidades equimolares y pura. Cuando
se sobre-expresa BtubAIB en !a cepa de Escherichia coli BL21 (ADE3),
se observa por SDS-PAGE que la expresión de BtubA es
aproximadamente 4 veces más alta que la de BtubB. Sin embargo,
cuando se analiza por SDS-PAGE el producto de la purificación de
BtubA/B por los ciclos de polimerización y despolimerización, se observa
que el precipitado está compuesto por BtubA y BtubB en cantidades
equimolares. Este nuevo método de purificación asegura que ambas
proteínas se encuentran en las mismas cantidades, lo que es muy
importante para la determinación de los parámetros cinéticos de la
102

polimerización. Además, después de tres ciclos de polimerización y
despolimerización, BtubNB se obtiene prácticamente pura.
3. Obtención de un heterodímero funcional. La proteína que se obtiene
después del tercer ciclo de polimerización carece de proteína no
funcional y de agregados.
Con la proteína resultante de este método de purificación se hicieron
todos los ensayos de polimerización descritos, además del marcaje de BtubNB
con las sondas fluorescentes.
4.2. Ensamblaje cooperativo: modelo de nucleación-elongación
En este trabajo de tesis se determinó que, al igual que los microtúbulos
y los filamentos de actina, los filamentos de BtubNB se ensamblan
cooperativamente con características que se ajustan al modelo de nucleación­
elongación y la nucleación es la etapa limitante de la reacción. En la
polimerización cooperativa el ensamblaje ocurre en dos etapas: una etapa de
nucleación desfavorable seguida de una etapa de elongación más favorable,
pues la afinidad de una subunidad por un extremo del filamento es mayor que
la afinidad entre dos subunidades. Esto se debe a que la subunidad entrante
interactúa simultáneamente con más de dos subunidades en el polímero, lo
que la estabiliza. Además, la polimerización cooperativa exhibe otras
características que pueden ser detectadas, como la existencia de una
concentración crítica para el ensamblaje y la presencia de un retraso durante el
inicio de la cinética de ensamblaje que es dependiente de la concentración de
proteína. Durante esta etapa de retraso o de latencia se forma el núcleo. En
este trabajo se determinó que KCI estimula la polimerización de BtubNB en la
etapa de nucleación y de elongación.
103

4.2.1. Concentración crítica
En los sistemas de polimerización cooperativos, la concentración crítica
representa no sólo la cantidad mínima de proteína necesaria para que ocurra la
polimerización, si no que también la máxima concentración de subunidades
que puede existir en una solución en el equilibrio con los polímeros y su valor
está determinado por la afinidad de las subunidades a los extremos del
polímero. En este trabajo se determinó que el incremento de la concentración
de cloruro de potasio produce una disminución de la concentración crítica (Ce)
de la polimerización (Figura 13; Figura 16), la que tiene un valor de 9,4 1-JM en
ausencia de KCI y un valor mínimo de 0,67 1-1M con KCI 2,0 M. Es necesario
recordar que la condición sin KCI aún contiene potasio proveniente de la
titulación del amortiguador HEPES-K y que cuando se utiliza la sal de sodio del
amortiguador no se observa polimerización a altas concentraciones de
proteína, lo que indica que el potasio es fundamental para que ocurra la
polimerización de BtubA/B. La disminución de la Ce indica que la cantidad de
proteína disponible para polimerizar es mayor o que la afinidad de la subunidad
por el polímero se incrementó, pues la Ce es igual a 1/ Kee (Kee es la constante
de equilibrio de asociación-elongación). A partir de los valores de la Ce se
calculó que el rango de los valores de Kee estuvo entre O, 12 x 10 6 M- 1 en
ausencia de KCI y 1 ,49 x 1 0 6 M- 1 a la concentración máxima de KCI 2,0 M. Con
KCI 100 y 200 mM se obtuvieron valores de Kee de 0,43 y 0,54 X 10 6 M- 1 ,
respectivamente. Así, KCI favorece fuertemente la asociación de subunidades
de BtubA/B durante la polimerización. De acuerdo a lo predicho por la ecuación
(2) , la disminución de la concentración crítica produjo un aumento del número
de filamentos que se formaron en la etapa de nucleación (Figura 9A; Figura 1 O;
Figura 18; Figura 198, C) y también se produjo un aumento de la velocidad de
polimerización de 1,54 ± 0,21 1-1m min- 1 con KCI 12,5 mM a 2,07 ± 0,2 1-1m min- 1
con KCI 100 mM (ecuación (6); Figura 190 y E) . El incremento de la densidad
104

de los filamentos indujo una interacción lateral entre ellos para formar los
manojos de filamentos (Figura 9A; Figura 1 O; Figura 19C). En el gráfico del
cambio de intensidad de la señal de dispersión en función de la concentración
de BtubA/B (Figura 13A) se observó que existe un cambio en la pendiente de la
recta de la regresión a partir de una concentración de KCI 50 mM. Este cambio
en la pendiente indicaría que a partir de KCI 50 mM, la formación de manojos
de filamentos comienza a influir en la cantidad de luz dispersada. A partir de
KCI 100 mM es evidente el cambio en la pendiente, lo que indica que hay dos
poblaciones de polímeros: filamentos simples con KCI entre O y 25 mM y
manojos de filamentos a partir de KCI 100 mM. En los ensayos de
sedimentación a alta velocidad también se determinó que KCI disminuye la Ce
(Figura 16C). Sin embargo, se observó que las pendientes de las regresiones
lineales son más similares entre sí , pues este tipo de ensayos permite
determinar la cantidad de polímero total. En el caso de los microtúbulos, la Ce
tiene un valor de entre 7,5 y 15,0 1-JM y éstos no necesitan KCI para polimerizar
(Mitchison y Kirschner, 1984a). En un trabajo reciente se determinó una Kee
para la tubulina eucarionte de O, 19 X 10 6 M- 1 , la que aumentó a 1,4 X 10 6 M- 1
en presencia de TOGp, una proteína asociada a microtúbulos que estimula la
polimerización, (Bonfils y cols., 2007). Para la polimerización de FtsZ existen
discrepancias con respecto al origen de la Ce, pues los filamentos de FtsZ
corresponden a un protofilamento simple de una subunidad de ancho y por lo
tanto, la polimerización de FtsZ no debería tener una fase de nucleación ni Ce .
Sin embargo, el ensamblaje de FtsZ muestra una Ce de entre 0,46 y O, 12 1-JM,
dependiendo del pH del amortiguador y de la concentración de potasio (Chen y
cols. , 2005), pues el incremento de potasio también produce una disminución
de la Ce, pero ese cambio es menor que en BtubA/B y FtsZ puede polimerizar
en ausencia de potasio. Se cree que la cooperatividad del ensamblaje de FtsZ
se debe a que las subunidades de FtsZ tienen una conformación de baja y alta
afinidad. La conformación de baja afinidad estaría favorecida para los
105

ausencia de KCI, el tamaño del núcleo era de sólo una subunidad (o un
heterodímero de BtubA/B), pero con el incremento de KCI , el tamaño del
núcleo aumentó consecutivamente a 2, 3 y 4 subunidades (Tabla 2) . En el caso
de un polímero helicoidal de doble hebra como la actina o su homólogo ParM ,
el núcleo está compuesto de tres subunidades (Garner y cols ., 2004; Oosawa y
Kasai, 1962). Para BtubA/B un núcleo de tres subunidades se forma a
concentraciones de KCI fisiológicas (1 00-200 mM) (Tabla 2). Es evidente que el
aumento de la concentración de proteína en cada condición de KCl disminuyó
el tiempo de la fase de latencia (Figura 11 ; Figura 12) y aumentó la velocidad
relativa de nucleación (Figura 148; Tabla 2). Esto sugiere que la formación del
núcleo se debe a varias reacciones de asociación secuenciales entre las
subunidades de BtubA/B. A partir de esto surge la pregunta: ¿por qué a mayor
concentración de KCI la velocidad de nucleación es mayor? Esto parece
contradictorio, pues para formar un núcleo con un número mayor de
subunidades se requiere de más reacciones de asociación entre las
subunidades de BtubA/B, lo que llevaría a incrementar la duración de la fase de
latencia. Una posible respuesta es que el incremento de KCI favorecería la
formación del heterodímero de BtubA/B, pues un paso esencial del ensamblaje
de BtubA/B es la formación del heterodímero antes de que se puedan
ensamblar en protofilamentos (Sontag y cols., 2009). La constante de
disociación de la dimerización en ausencia de GTP determinada por
sedimentación al equilibrio está entre 3 y 7 1-JM (HEPES 50 mM (pH 7,7) ; MgAc
5 mM; KAc 350 mM ; EGTA 1 mM) y la adición de GMPCPP a dímeros
mutantes de BtubA/B incapaces de polimerizar tiene un efecto mínimo en la
formación del dímero (Sontag y cols., 2009). Sin embargo, la constante de
disociación de la dimerización (KD) es casi un orden de magnitud más pequeña
que la concentración crítica de la polimerización que es de 0,5 1-JM (Sontag y
cols., 2005) y ésta se obtuvo en una alta concentración de potasio (350 mM).
Sontag señala que el mecanismo de ensamblaje cooperativo que produce esa
107

concentración crítica no es conocido y no está claro como la formación del
dímero podría ajustarse al mecanismo de cooperatividad (Sontag y cols.,
2009). Además, no hay más datos de la K 0 de dimerización de BtubAJB a
concentraciones más bajas de KCI , salvo por el bajo valor reportado por
Schlieper de 50 !JM (Schlieper y cols., 2005). Sin embargo, ese valor se obtuvo
en ausencia de MgCI 2 . Otra posibilidad es que la fracción de heterodímeros
que se forma interactúe con KCI y pasen a una conformación activa de
BtubAJB-K. La naturaleza de esta activación podría deberse a la neutralización
de cargas en las superficies de polimerización o a un efecto sobre la capa de
solvatación del heterodímero. A favor del efecto sobre la capa de solvatación
está la disminución de la concentración crítica de actina-GDP en presencia de
cosolventes (Frederick y cols ., 2008). Esto produce un incremento de la
afinidad de los heterodímeros entre sí. En el caso del mecanismo de
polimerización de la actina, ésta procede a través de 3 etapas sucesivas
(Greer, 2002) : (a) activación, en donde a través de un mecanismo aún
desconocido, el monómero de actina interactúa con sales (KCI, MgCI 2) y
cambia a una conformación activada; (b) nucleación , que consiste en la
formación de un dímero de dos monómeros activados y luego la adición de otro
para formar un trímero de actina que cambia de conformación para formar un
núcleo helicoidal para la polimerización; (e) elongación , en la cual se adicionan
los monómeros de actina a los filamentos. Para explicar la cinética de
ensamblaje de FtsZ, ésta se ajustó al modelo de ensamblaje de la actina y se
postuló que incluye un paso de activación del monómero de FtsZ, la formación
de un núcleo dimérico muy débil y la elongación (Chen y cols ., 2005). Esta
cooperatividad en el ensamblaje de FtsZ se debería a un cambio
conformacional que permite a las subunidades en un oligómero asociarse con
alta afinidad mientras que una conformación de baja afinidad es favorecida en
los monómeros (Miraldí y cols ., 2008). En el caso de la formación del núcleo de
BtubAJB, una vez que el heterodímero está activado, éste interactuaría primero
108

lateralmente en vez de longitudinalmente con otro heterodímero, pues esto
produce mayores zonas de contacto y se estabilizan mutuamente los
monómeros de ambos heterodímeros. A medida que aumenta la concentración
de KCI, se favorece la activación de los heterodímeros y las velocidades de
asociación entre ellos aumentan, se introducen nuevas constantes de
velocidades de nucleación y el tamaño del núcleo aumenta. Sin embargo, con
esta aproximación no hay forma de saber, por ejemplo, si la formación de un
tetrámero a partir de dos dímeros es un proceso más o menos favorable que la
formación del trímero a partir de un dímero y un monómero. Para conocer
exáctamente el mecanismo por el cual el KCI induce la formación de núcleos
de mayor tamaño y como participa la formación del heterodímero en este
mecanismo, es necesario modelar la cinética de polimerización de BtubA/B y
ajustarla a los resultados experimentales para poder extraer las constantes de
asociación y disociación de los distintos pasos que forman el núcleo,
procedimiento que no se realizó en este trabajo de tesis.
4.2.3. Elongación
En esta etapa todos los agregados del tamaño del núcleo (n) o más
grandes crecen por la adición secuencial de los monómeros a los extremos de
los filamentos hasta que la concentración de monómeros baja hasta su valor en
el equilibrio o estado estacionario. En este trabajo, esta etapa se analizó con
los ensayos de dispersión de luz y con la observación de la polimerización de
los filamentos individuales por microscopía confocal. Después de la etapa de
latencia en ausencia de KCI y con KCI 3, 13; 6,25; 12,5 y 25,0 mM , la
concentración de subunidades disminuye con una cinética exponencial de
pseudo-primer orden (resultado no mostrado) lo que indica que la elongación
procede a una concentración constante de filamentos de BtubA/8 y por lo
tanto, la nucleación se completó en la etapa de latencia. Sin embargo, es
109

evidente que en la elongación participan dos procesos a partir de KCI 100,0
mM, uno rápido seguido de uno más lento que es el que llega al máximo valor
de dispersión de luz (Figura 12C; Figura 14). Es muy probable que este cambio
de la cinética de polimerización se deba a la interacción lateral de los
filamentos para formar manojos y que cuya formación es estimulada por la
concentración de KCI, pues cuando se comparó la polimerización de dos
condiciones de KCI que debían producir la misma cantidad de filamentos de
acuerdo a las concentraciones críticas, sólo se observó un gran incremento de
dispersión de luz con una alta concentración de KCI (Figura 14A), lo que
indicaría que la formación de manojos no sólo se debe a la concentración de
proteína disponible para polimerizar sino que también al efecto de KCI. Este
resultado también indica que la interacción entre los filamentos en los manojos
no es electrostática, pues con KCI 2,0 M los manojos persisten (Figura 1 OC) y
probablemente sería de tipo hidrofóbica o por un efecto sobre la capa de
hidratación del polímero. Además , como ya se mencionó en los resultados, la
formación de estos manojos produce una estabilización de los filamentos, pues
la señal de dispersión de luz se mantiene constante una vez que se alcanza el
estado estacionario (Figura 12C y O; Figura 148), a diferencia de lo observado
a bajas concentraciones de KCI, en donde una vez que se alcanza el máximo
se inicia la despolimerización (Figura 12A y 8 ; Figura 148). La visualización por
microscopía confocal de la polimerización de 8tubA/8 demostró que con KCI
12,5 mM la formación de filamentos simples es favorecida y éstos filamentos
polimerizan y despolimerizan continuamente, mientras que con KCI 100,0 mM
los filamentos simples tienden a formar manojos estables.
4.3. La hidrólisis de GTP
En la familia de las tubulinas la hidrólisis de GTP está estrechamente
acoplada al auto-ensamblaje de los polímeros. En la tubulina eucarionte, el
110

FtsZ y no permite el posicionamiento de la molécula catalítica de agua. Es
posible que en BtubNB ocurra un efecto similar, pues hay un leve incremento
de la hidrólisis de GTP a bajas concentraciones de KCI. Sin embargo, ese
incremento se podría deber a que la concentración crítica disminuyó, por lo
tanto se forman más polímeros y por ende la hidrólisis de GTP aumenta.
4.4. Polaridad estructural y dinámica de polimerización de los
filamentos de BtubA/8
Dos parámetros fundamentales permitieron determinar que los
filamentos de BtubA/B son estructuralmente polares (Figura 188). El primero se
basó en la regulación de la concentración crítica de la polimerización por KCI,
pues permitió el control del número de filamentos en la reacción , paso
fundamental para evitar la formación de los manojos que impedían observar
filamentos individuales en el campo de observación del microscopio (Figura
18A). El segundo factor, la estabilización de los filamentos por GMPCPP, un
análogo no hidrolizable de GTP, que permitió diluir la reacción para tener los
filamentos separados en el campo visual. Además, al igual que en los
microtubulos, los filamentos de BtubA/B se hicieron más estables a la dilución
con GMPCPP que con el otro análogo no hidrolizable GTP-y-S (Hyman y cols.,
1991) (resultado no mostrado). Esta conducta mostró que los filamentos
simples de BtubA/B son polares y por lo tanto, los dos protofilamentos que lo
componen interactúan de forma paralela. No está claro aún si los extremos de
los filamentos de FtsZ tienen polaridad. La polaridad no es una característica
común a la misma familia de proteínas, pues ParM es bipolar y sus filamentos
crecen en ambas direcciones y a igual velocidad (Garner y cols ., 2004), a
diferencia de su homólogo eucarionte actina que es polar.
113

4.4.1. Treadmilling
De acuerdo a la predicción teórica de Wegner (Wegner, 1976), los
filamentos de BtubA/B exhiben el comportamiento dinámico de "treadmilling",
en el cual el flujo de subunidades por un extremo es balanceado por la salida
de subunidades por el otro (Figura 21 ; Figura 25A). Esto produce una
sensación de desplazamiento del filamento y se produce debido a que en un
filamento polar las concentraciones críticas en los dos extremos son diferentes
y además, la polimerización va acompañada de la hidrólisis de GTP (Ver
Apéndice C para el desarrollo del modelo teórico de "treadmilling"). En los
ensayos de polimerización de BtubA/B (Figura 19) se observó habitualmente
"treadmilling" de pequeños fragmentos que se originaban a partir de la
fragmentación de filamentos más largos que crecían a partir de las "semillas".
Así, el "treadmilling" se observó a concentraciones de proteína que estaban
levemente por sobre el valor de la concentración crítica. A concentraciones de
proteína que estaban bajo la concentración crítica, los filamentos que se
or"iginaban a partir de la fragmentación de filamentos más largos desaparecían
rápidamente por el extremo "menos" debido a que en esa condición los valores
de la velocidad de despolimerización en un extremo son más altos que los de
polimerización por el otro. Esto corroboró que los dos extremos tienen
concentraciones críticas diferentes y que el "treadmilling" se da en un rango
característico de concentración de proteína. También se observó pequeños
fragmentos en "treadmilling" que interactuaban con fragmentos más largos y se
desplazaban a lo largo de ellos en forma paralela o antiparalela, lo que
indicaría que en los manojos los filamentos pueden desplazarse uno con
respecto al otro y que la polaridad de los manojos es mezclada. In vitro, los
microtúbulos también exhiben "treadmilling" (Marg olis y Wilson, 1978) e in vivo ,
los microtúbulos citoplasmáticos se liberan de sitios de nucleación como el
centrosoma y se mueven hacia la periferia con un mecanismo de "treadmilling",
permitiendo un intercambio de subunidades por el extremo "menos" y un
114

eordenamiento de los microtúbulos en la periferia de la célula (Rodionov y
Borisy, 1997). También es posible que el "treadmilling" genere la fuerza
necesaria para producir tensión en el huso mitótico (Waters y cols., 1996).
También se observó la fragmentación de filamentos de BtubA/B debido a la
polimerización perpendicular de otro filamento , lo que indica que la
polimerización de BtubA/B también puede ejercer fuerza o trabajo mecánico.
No hay evidencia de que los polímeros de FtsZ exhiban "treadmilling" o
inestabilidad dinámica, pues se piensa que el sitio de unión al nucleótido en
FtsZ es accesible al citoplasma, el cual es rico en GTP y por lo tanto
rápidamente uniría un nuevo GTP (Romberg y Levin, 2003). Esto produce que
los polímeros de FtsZ estén formados por FtsZ-GTP, los cuales son resistentes
a la despolimerización. Aún se desconoce el mecanismo por el cual la
polimerización de FtsZ ejerce fuerza de constricción. Por último, TubZ forma
polímeros dinámicos que exhiben "treadmilling" y que participarían en la
estabilidad del plasmidio que la codifica (Larsen y cols. , 2007).
4.4.2. Inestabilidad dinámica
En 1984 se postuló un nuevo mecanismo dinámico para los
microtúbulos llamado inestabilidad dinámica y que se basó en el análisis de las
distribuciones de longitud de microtúbulos fijados (Mitchison y Kirschner,
1984a, b). De acuerdo a este modelo, aunque la población de microtúbulos
exhibe un estado estacionario que corresponde a un comportamiento promedio
de todos los filamentos, individualmente, los microtúbulos nunca alcanzan una
longitud constante en el estado estacionario sino que están continuamente en
estados de polimerización y despolimerización que se interconvierten
estocásticamente. La observación directa de la inestabilidad dinámica de los
microtúbulos se describe por cuatro parámetros: (1 y 2) las velocidades de
115

polimerización y de despolimerización, (3) las frecuencias de catástrofe (la
transición desde la polimerización a la despolimerización y (4) el rescate (la
transición desde la despolimerización a la polimerización) (Figura 6) (Desai y
Mitchison, 1997). En este trabajo de tesis se observaron estos cuatro
parámetros cuando se siguió la polimerización de los filamentos de BtubAIB
con KCI 12,5 mM (Figura 190; Figura 20; Figura 22). Con KCI 100,0 mM no se
observó inestabilidad dinámica, probablemente debido a la mayor velocidad de
crecimiento de los filamentos, lo que llevaba rápidamente a la formación de los
manojos. Con KCI 12,5 mM no es posible predecir cuando un filamento
cambiará de una fase de crecimiento a una fase de acortamiento, ni viceversa,
lo que indica el carácter estocástico de este mecanismo. Se midió las
velocidades de polimerización y de despolimerización con KCI 12,5 mM a
varias concentraciones de BtubAIB y se determinó que las constantes de
velocidad de asociación y de disociación tenían un valor de 2,67 x 10 6 M- 1 s- 1 y
2,74 s-\ respectivamente. Para la tubulina, la constante de velocidad de
asociación está en el rango de 2-1 O x 10 6 M- 1 s- 1 y la de disociación está en el
rango de 0,1-45 s- 1 (Desai y Mitchison, 1997). Si se supone el modelo de la
"tapa" de GTP para los filamentos de BtubAIB (Figura 6B, C; Figura 258),
durante o después de la polimerización las subunidades de BtubA/B hidrolizan
el GTP unido y se libera el fosfato inorgánico. Mientras mayor es el tiempo que
pasan las subunidades formando parte del polímero, mayores son las
probabilidades que hidrolicen el nucleótido unido. Por lo tanto , la identidad del
nucleótido en el extremo del filamento depende de la velocidad de hidrólisis
relativa a la velocidad de adición de subunidades. Si la velocidad de adición de
subunidades es alta, es decir, el filamento está creciendo rápidamente, es más
probable que una nueva subunidad se adicione antes de que el nucleótido en
la subunidad terminal sea hidrolizado y la punta del polímero permanecerá
cubierta de subunidades con GTP. Sin embargo, si la velocidad de adición de
subunidades es lenta, es más probable que la hidrólisis ocurra primero y la
116

punta del polímero estará cubierta de subunidades con GDP unido. En la fase
de despolimerización las subunidades con GDP son más inestables y se
liberan desde los extremos de los filamentos de BtubAIB a una velocidad muy
rápida. Cuando la concentración de proteína es baja, la velocidad de
polimerización es baja y los filamentos que se despolimerizan rara vez retoman
el crecimiento (Figura 22A). Sin embargo, al aumentar la concentración de
proteína, hay más probabilidades de formar una nueva tapa de GTP en el
extremo del filamento que se despolimerizó y de esta forma, el incremento de
la concentración de proteína produce un aumento de las frecuencias de rescate
de los filamentos que se despolimerizan rápidamente (Figura 22B y C). Dentro
de los microtúbulos los protofilamentos son rectos , mientras que los productos
de la despolimerización son curvos (Figura 6C). No se sabe si BtubAIB
presenta estas dos conformaciones dependiendo del estado del nucleótido,
pues las conformaciones de BtubA con GTP y BtubA con GDP se superponen
a pesar del estado del nucleótido. Sin embargo, es claro que tanto el
mecanismo de inestabilidad dinámica como el de "treadmilling" necesitan de la
hidrólisis de GTP, pues cuando se usó el GMPCPP, sólo se observó
crecimiento de los filamentos y la formación de manojos, pero ningún evento de
despolimerización (Figura 23A; Figura 24A). Aparte de los microtúbulos
eucariontes, el homológo bacteriano de la actina, ParM , también exhibe
inestabilidad dinámica, lo que indica que este mecanismo surgió en ParM por
evolución convergente debido a un conjunto de limitaciones impuestas a
polímeros que segregan DNA (Garner y cols. , 2004).
117

4.5. Significancia biológica del mecanismo de polimerización de
BtubA/8.
El mecanismo de polimerización de los filamentos de BtubA/B descritos
en esta tesis provee de una base plausible para la función y organización de
los filamentos de BtubA/B en Prosthecobacter. In vitro hay por lo menos tres
reacciones distintas que in vivo podrían estar controladas por separado:
nucleación, elongación y despolimerización. En este trabajo se analizó la
polimerización de BtubA/B en función de distintas concentraciones de KCI. La
concentración de potasio intracelular en E. coli está entre 200 y 400 mM. La
concentración de potasio en Prosthecobacter debería ser similar, por lo que la
polimerización de BtubA/B estaría favorecida principalmente por la condición
iónica del medio. En los microtúbulos, FtsZ, actina y otras proteínas
citoesqueléticas, la regulación de la polimerización, está controlada por otras
proteínas que favorecen y desfavorecen alternativamente la nucleación,
elongación, acortamiento y anclaje de sus polímeros. Desafortunadamente,
aún no se sabe si BtubA/B estaría regulada por otras proteínas, salvo por la
presencia del gen bklc (bacteria/ kinesin light chain) río abajo del gen de btubB
(Jenkins y cols., 2002), el cual sería parte esencial de una unidad funcional,
como un operón , representado por una tubulina bacteriana A, una tubulina
bacteriana B y una cadena liviana de la quinesina bacteriana (operón-btub)
(Pilhofer y cols. , 2007a). La función de bklc en Prosthecobacter es
desconocida. Sin embargo, Bklc posee dominios TPR que participan en
muchas funciones como la interacción proteína-proteína (Pilhofer y cols.,
2007b), por lo que Bklc podría estar participando en el ensamblaje o
estabilización del heterodímero de BtubA/B o mediando la interacción con otras
proteínas. El analisis del ambiente genético del operón-btub muestra que los
genes río arriba de las tubulinas bacterianas aparecen siempre relacionados a
los genes que se encuentran río abajo del gen de la cadena liviana de la
quinesina (Pilhofer y cols. , 2007a). Ninguno de los genes de los bordes tiene
119

En E. coli se observó que los filamentos de BtubAIB estaban agrupados
en manojos que recorrían toda la longitud de la célula y se ubicaban en el
centro en algunas células o contiguos a las membranas en otras (Sontag y
cols., 2005) (Figura 4E). Además, las células adoptan una morfología peculiar
curva (Martin Pilhofer, comunicación personal), lo que se podría deber a que
los filamentos de BtubAIB están empujando en cada extremo de la célula. Los
estudios in vitro de este trabajo confirman la tendencia de los filamentos de
BtubAIB a interactuar entre sí y a formar manojos en altas concentraciones de
potasio. Además, los filamentos dentro de los manojos estan mezclados con
respecto a su polaridad individual, por lo que los dos extremos del manojo de
filamentos crecerían a la misma velocidad. En Prosthecobacter dejongeii se ha
observado por microscopía de transmisión de electrones estructuras de
protofilamentos que forman manojos y se loca lizan en el centro de las células y
también justo debajo de la membrana. Un resultado similar se observó con
ensayos de inmunocitoq uímica con anticuerpos anti-BtubA o anti-BtubB (Martin
Pilhofer, resultados no publicados). La formación de manojos estabiliza a los
filamentos de BtubAIB contra la despolimerización (Figura 12C; Figura 14) y
además le confiere elasticidad a las células (Heidemann y Wirtz, 2004), lo que
indicaría que los manojos de filamentos de BtubAIB tienen una función
estructura l que determinaría la forma alargada de Prosthecobacter. Otras
proteínas del citoesqueleto de bacterias, como crescentina y MreB, participan
en la determinación de la forma celular y también se ubican debajo de la
membrana celular y forman manojos de filamentos (Michie y Lowe, 2006).
Además, los manojos de filamentos de BtubAIB podrían estar regulados por
Bklc, afectando su geometría y/o dinámica de polimerización.
¿Qué importancia tiene el mecanismo de "treadmilling" y de inestabilidad
dinámica dentro de la función de los filamentos de BtubA/B? Una posibilidad es
que ambos mecanismos sean sólo un reflejo de las propiedades dinámicas de
un filamento polar cuya polimerización va asociada a un paso irreversible como
121

es la hidrólisis de GTP. El "treadmilling" se predijo teóricamente previo a su
descubrimiento en los filamentos de actina. Sin embargo, en este trabajo se
observó "treadmilling" a altas concentraciones de potasio y también se observó
que los filamentos podían interactuar entre sí y deslizarse el uno con respecto
al otro dentro del manojo, en la misma dirección o en sentidos opuestos. Esto
indica que es probable que los filamentos de 8tubA/8 exhiban "treadmilling" en
Prosthecobacter y que este mecanismo sirva para el reordenamiento de los
filamentos y/o para ejercer fuerza en los extremos del manojo, como ocurre con
los microtúbulos (Waters y cols. , 1996). La función biológica de la inestabilidad
dinámica es permitir a los microtúbulos buscar y encontrar blancos específicos
dentro de la célula, de forma más eficiente que la polimerización al equilibrio
(modelo de búsqueda y captura). Es poco probable que los filamentos de
8tubA/8 exhiban inestabilidad dinámica en Prosthecobacter, pues ésta se
observó in vitro en condiciones de filamentos simples y no con la formación de
manojos. Si in vivo los filamentos de 8tubA/8 exhibieran inestabilidad dinámica,
probablemente ésta ocurriría en los extremos de los manojos donde existen
filamentos simples de 8tubA/8 que no estarían estabilizados, pero
probablemente no participarían en la segregación de moléculas como DNA.
122

5. CONCLUSIONES
1. El nuevo método de purificación de BtubA/B (tubulina bacteriana), por
ciclos de polimerización y despolimerización, permitió obtener una
proteína prácticamente pura, funcional y con cantidades equimolares de
BtubA y BtubB.
2. El ensamblaje de BtubA/B se ajusta a la teoría de nucleación-elongación
que establece que la formación del polímero es un proceso cooperativo.
3. El aumento de la concentración de potasio reduce la concentración
crítica de la polimerización de BtubA/B e incrementa el tamaño del
núcleo de polimerización. Esto produce un incremento del número de
filamentos, los que tienden a interactuar lateralmente entre si para
formar manojos largos. Esto confiere estabilidad a los filamentos de
BtubA/B.
4. Los filamentos de BtubA/B tienen polaridad cinética y estructural, lo que
produce que un extremo del filamento tenga una velocidad de
crecimiento mayor al otro extremo. Sin embargo, los manojos están
formados por filamentos paralelos y antipara lelos, es decir, el manojo no
tiene una polaridad intrínseca.
5. Los filamentos de BtubA/B exhiben inestabilidad dinámica y
"treadmilling".
123

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134

Apéndice A: Proteínas del citoesqueleto bacteriano
Proteínas homólogas de actina: MreB, ParM y MamK
Actina
La actina es una de las proteínas más abundantes y altamente
conservadas de todas las células eucariontes y participa principalmente en la
motilidad celular, como la contracción muscular y en propiedades mecánicas
de la matriz celular citoplasmática (Pollard y Cooper, 1986). En presencia de
sal y ATP forma filamentos helicoidales de doble hebra (Korn et al. , 1987), los
que se asocian para formar diferentes estructuras con bifurcaciones de
filamentos . El citoesqueleto de actina se ensambla y desensambla
continuamente debido a la unión e hidrólisis de ATP. Esto permite cambios en
el tamaño, número y distribución topológica de los filamentos en respuesta a
señales regulatorias. Además, los filamentos de actina están asociados a otras
proteínas que participan en la regulacion de la dinámica de crecimiento del
filamento, el desensamblaje, la formación de manojos, etc. (Shih y Rothfield ,
2006).
La primera evidencia de homólogos de actina en bacterias vino de la
búsqueda de secuencias homólogas al núcleo catalítico de actina y de otras
proteínas que unen e hidrolizan ATP (Bork y cols. , 1992). Esa aproximación
identificó a las proteínas FtsA, MreB y StbA (ParM) como posibles homólogos
bacterianos de actina. Posteriormente, esa relación evolutiva se corrobó con la
similitud estructural de esas proteínas con actina, siendo el dominio ATPásico
la región más conservada (van den Ent y cols. , 2001 ; van den Ent y Lowe,
2000; van den Ent y cols., 2002). Los homólogos bacterianos de actina han
135

sido agrupados en dos clases (Shih y Rothfield, 2006): las proteínas MreB y
Mbl (Mreb-like) que son codificadas por la mayoría de los genomas
bacterianos, y ParM que es codificada por un plasmidio extracromosomal
(Gerdes y cols., 2000).
MreB y los homólogos de MreB
MreB y sus homólogos se encuentran en la mayoría de las bacterias no­
esféricas, donde participan de un gran número de funciones celulares como la
regulación de la forma celular, (Doi y cols., 1988; Jones y cols., 2001; Shih y
Rothfield , 2006; Wachi y Matsuhashi, 1989), la segregación de cromosomas, la
polaridad celular y la organización de organelos membranosos (Shih y
Rothfield, 2006). Algunas especies de bacterias como Escherichia coli y
Caulobacter crescentus poseen sólo una proteína MreB, mientras que otras
especies como Bacillus subtilis poseen dos o más proteínas relacionadas a
MreB, como Mbl (MreB-Iike) y MreBH (mreB homolog) (Abhayawardhane y
Stewart, 1995; Levin y cols. , 1992) y que tienen funciones y localizaciones
distintas (Jones y cols., 2001 ; Soufo y Graumann, 2003). La proteína MreB y
sus parálogos forman estructuras filamentosas en forma de espiral muy cerca
de la cara citoplasmática de la membrana celular y que recorren toda la
longitud de la célula e in vitro polimerizan en presencia de ATP y GTP (Jones y
cols., 2001; van den Ent y cols. , 2001) (Figura 1 ). Los filamentos helicoidales
de MreB regularían directamente la forma celular, dirigiendo la localización o
actividad de enzimas que sintetizan y reorganizan el peptidoglicano que forma
la pared celular (Carballido-Lopez y Errington, 2003; Errington y cols., 2003;
Figge y cols., 2004).
136

ParM
ParM es un homólogo bacteriano de actina diferente de MreB, que es
codificado por un plasmidio de 100 kb llamado R1 , presente en muchos
patógenos entéricos y codifica genes que confieren resistencia a antibióticos y
metales pesados, genes requeridos para la retención de los plasmidios y para
la transferencia por conjugación (Garner y cols., 2004). El operan par del
plasmidio R1 forma un huso mitótico minimalista de segregación de DNA
((Garner y cols., 2004) a partir de tres componentes: pare, ParR y ParM
(Moller-Jensen y cols., 2002). ParR es una proteína represora que se une al
locus pare de dos plasmidios y este complejo promueve el ensamblaje de los
filamentos de ParM entre los dos plasmidios, empujándolos aparte (Moller­
Jensen y cols. , 2003) , lo que les permite asegurar su segregación (Gerdes y
cols. , 2004). ParM polimeriza en presencia de ATP y forma filamentos de doble
hebra helicoidales, muy similares a los filamentos de actina (van den Ent y
cols., 2001 ; van den Ent y cols., 2002). Sin embargo, la dinámica de
polimerización es más similar a la de tubulina (Garner y cols., 2004). Estas
características convierten al sistema de ParM en la maquinaria mitótica más
simple conocida.
MamK
Recientemente se ha identificado en bacterias magnetotácticas a la
proteína MamK como un nuevo homólogo bacteriano de actina. MamK forma
filamentos que posicionan y organizan a los magnetosomas (Komeili y cols.,
2006). Los magnetosomas son organelos intracelulares membranosos que
contienen cristales de magnetita (hierro) y se organizan en cadenas lineales
para orientar a las bacterias magnetotácticas en los campos geomagnéticos, lo
que causa que las células se alinien y naden con respecto a las líneas del
137

campo magnético local o inducido (Carballido-Lopez, 2006). Este hallazgo
definió una nueva función de las proteínas homólogas de la actina en el
posicionamiento de organelos en células bacterianas (Komeili y cols. , 2006).
Homólogo de los filamentos intermedios: Crescentina
Filamentos intermedios
Todas las células eucariontes contienen actina y tubulina. Sin embargo,
la tercera clase de proteína citoesquelética, el filamento intermedio, sólo forma
filamentos en algunos animales que incluyen a los vertebrados, nemátodos y
moluscos (Aiberts, 2008). La función principal de los filamentos intermedios es
servir como un esqueleto de soporte que ayuda a mantener la forma e
integridad celular y nuclear, protegiendo a las células contra el estrés mecánico
(Shih y Rothfield , 2006). Sin embargo, a diferencia de actina y tubulina, la
subunidad de los filamentos intermedios polimeriza en ausencia de nucleótidos
(Aiberts, 2008).
Crescentina
Crescentina (CreS) es hasta el momento el único homólogo identificado
de los filamentos intermedios en células procariontes. Crescentina es una
proteína "coiled-coil" que se encuentra en el organismo Caulobacter crescentus
(Figura 1) y cuyas propiedades bioquímicas y estructura de dominios se
asemejan a la de los filamentos intermedios (IFs) (Ausmees y cols. , 2003). Al
igual que los filamentos intermedios de los eucariontes, crescentina polimeriza
in vitro sin la adición de nucleótidos e in vivo polimeriza en la curvatura interna
de Caulobacter crescentus (Figura 1) y regula la forma de coma de la célula;
138

cuando el gen que codifica para crescentina es eliminado en Caulobacter
crescentus las células crecen rectas (Ausmees y cols., 2003).
La clase MinO/ParA de proteínas del citoesqueleto de bacterias.
Además de los homólogos de las proteínas citoesqueléticas eucariontes,
las bacterias poseen un cuarto sistema de proteínas citoesqueléticas que no
tiene homología con elementos del citoesqueleto de eucariontes. Esas
proteínas pertenecen a la superfamilia de MinO/PaR y se caracterizan por la
presencia de un motivo ATPásico, forman estructuras filamentosas al interior
de la célula e in vitro se ensamblan y forman filamentos largos (Shih y
Rothfield, 2006). Las proteínas de la familia MinO/PaR se dividen en dos
subgrupos: los filamentos de las proteínas del primer subgrupo MinO, junto a
MinC y MinE se asocian a la membrana, recorren la célula de polo a polo y su
función es asegurar la colocación correcta del septo de división celular en la
mitad de la célula. El segundo grupo corresponde al de las proteínas del grupo
ParA que participan en la segregación de plasmidios.
139

Apéndice B: Análisis de la nucleación de Nishida y Sakai
La siguiente derivación de la ecuación que permite determinar el tamaño
del núcleo se adaptó del trabajo de Jessica Polka (Polka y cols. , 2009), el cual
se basó en el formalismo introducido por Nishida y Sakai (Nishida y Sakai,
1983). Éste establece que en base a que el número de filamentos se determina
en el período de nucleación y se mantiene constante durante el período de
elongación, es posible estimar el tamaño del núcleo al analizar la velocidad
máxima de polimerización en función de la concentración de las subunidades
libres.
Si la despolimerización o pérdida de los filamentos en las etapas
tempranas de la polimerización es despreciable, la velocidad de formación de
los filamentos en el período de nucleación puede ser descrita por:
dP
- = k* [S*]n (7)
dt
donde P es la concentración en número de los filamentos o sus extremos, n es
el número de subunidades en el núcleo, k* es una constante de velocidad de
orden-n que describe la nucleación y [S* ] es la concentración inicial de
subunidades menos la concentración crítica. De la misma forma, si la
despolimerización de los filamentos formados en la nucleación es despreciable,
la velocidad de polimerización, que equivale al negativo de la velocidad de
desaparición o agotamiento de las subunidades libres, está dada por:
dS
- dt = k2 [P] [S*] (8)
La velocidad máxima de la polimerización ocurre en el punto de
inflección de la curva de polimerización, es decir, en el punto en donde el valor
140

Apéndice C: Modelo teórico del mecanismo de "treadmilling"
La orientación regular y paralela de las subunidades de los filamentos de
actina y de los microtúbulos les confiere polaridad estructural, es decir, los dos
extremos del polímero son diferentes. Esto produce un gran efecto en la
direccionalidad de las velocidades de crecimiento del polímero. Wegner
demostró teóricamente, a partir del estudio del intercambio de subunidades
radioactivas con los filamentos de actina , que cuando la formación de un
polímero lineal y polar se acopla a una reacción exergónica irreversible (en
este caso la hidrólisis de ATP), el estado estacionario que resulta puede ser
caracterizado por el flujo constante de subunidades desde un extremo del
polímero al otro extremo, y en el cual la polimerización neta en un extremo
iguala a la despolimerización neta en el otro y la longitud promedio del polímero
permanece constante ("Head to tail Polymerization" (Wegner, 1976)). Este
mecanismo es comúnmente llamado "treadmilling".
La concentración crítica para la polimerización bidireccional y
unidireccional
Para entender cómo funciona el "treadmilling" consideremos el caso más
simple de crecimiento bidireccional de un polímero polar en el cual no hay
hidrólisis del nucleótido de trifosfato (NTP ; ATP para la actina, GTP para la
tubulina) (Figura 26A). En un polímero lineal y polar, ambos extremos pueden
servir como centros de elongación. La adición de una subunidad a cualquier
extremo de un polímero de n subunidades produce un polímero de n + 1
subunidades. En ausencia de la hidrólisis del NTP no existe una diferencia
energética entre las dos vías diferentes que forman el polímero de n + 1
subunidades, ya que ambas forman el mismo producto a partir de los mismos
143

eactantes. Por lo tanto, la constante de equilibrio Kec para la asociación de una
subunidad con el polímero es la misma para ambos extremos (Theriot, 2000;
Wegner, 1976). Sin embargo, en un polímero estructuralmente polar, la
constante cinética de velocidad de asociación k 2 y de disociación k_ 1 en los
dos extremos del polímero no necesitan ser iguales, pues los estados de
transición de las reacciones de unión son diferentes y generalmente k 2 y k_ 1
son más grandes en un extremo en comparación al otro. Esto produce que si
un exceso de subunidades se ensambla en fragmentos de filamentos polares
preformados, se observará que un extremo elonga más rápido que el otro o se
acorta más rápido que el otro. En los filamentos de actina, el extremo más
dinámico de los filamentos es llamado "barbed end" y el menos dinámico
"pointed end". En el microtúbulo, el más dinámico es llamado extremo "más"(+)
(plus end) y el menos dinámico es el extremo "menos" (minus end). Por lo
tanto, la única restricción para las constantes de velocidad es que sus
cuocientes sean iguales:
k! k2
Kec = k+ - k - (14)
-1 -1
en donde kt y k2 son las constantes de velocidad de segundo orden para las
reacciones de asociación en el extremo "más" y en el extremo "menos",
respectivamente y k"!:. 1 y k: 1 son las constantes de velocidad de primer orden
para las reacciones de disociación en los dos extremos del polímero. k! > k2
y k!:.1 > k:1.
Las velocidades de crecimiento del extremo "más" (+) y del extremo
"menos" (-) de un filamento en particular son :
dn+ _ + ] + _ + [ ]
dt - kz [S - k_1 - k2 ( S - Ce) (15a)
144

(15b)
en donde dn+ 1 dt y dn-1 dt son las velocidades netas de elongación en
unidades de número de subunidades n adicionadas por segundo por polímero
en el extremo "más" y en el extremo "menos", respectivamente; [S] es la
concentración de subunidades; la concentración crítica e, equivale al inverso
de la Kec y se define como la concentración de subunidades en el equilibrio o
estado estacionario cuando dn/ dt = O.
Para este sistema de crecimiento bid ireccional, el gráfico de la velocidad
de polimerización en función de la concentración de subunidades para cada
extremo intersecta al eje de la abscisa en un punto en común que equivale a la
e, (Figura 26B). Se desprende de este gráfico y de las ecuaciones (15a) y
(15b) que ambos extremos crecen o se acortan al mismo tiempo, dependiendo
de si la concentración de las subunidades es mayor o menor al valor de la e,.
En otras palabras, la dirección del crecimiento depende de si la concentración
de subunidades excede a la concentración crítica. La dirección del crecimiento
es hacia fuera o hacia dentro desde el centro a los dos extremos del polímero.
Esta restricción se debe al mecanismo de polimerización en el cual la
disociación es la reacción reversa de la asociación. El filamento crece en una
sola dirección cuando ki >> k:¡ (Wegner, 1976).
La concentración crítica para el mecanismo de "treadmilling"
Cuando se incluye la hidrólisis del nucleótido es necesario incluir dos
especies de subunidades, ya que éstas pueden contener el nucleósido de
trifosfato NTP o el nucleósido de difosfato NDP. Además, es necesario
introducir un total de ocho eventos de asociación y disociación, cada uno
definido por una constante de velocidad individual (Figura 26C). Las constantes
145

de equilibrio para la asociación de subunidades con NDP (Kfc ) o con NTP (KJc)
están relacionadas a las constantes de velocidad por:
k +T k z- r
T - 2 Keq - k+T- k-T
- 1 -1
(16a)
(16b)
El esquema de la Figura 26C contiene una reacción que no ha sido
observada en soluciones de filamentos de actina ni de microtúbulos, la cual es
la disociación de la subunidad junto a la fosforilación del NDP para producir
NTP. Aunque esa reacción podría ser despreciable, ha sido incluida en el
modelo para obtener un esquema de reacciones reversibles (Wegner, 1976).
Las velocidades de crecimiento de los dos extremos son:
dndt
= k2T[S - NTP] - k=f[Pi] + k2° [S- NDP]- k=f (17b)
en donde [S - NTP] y [S- NDP] son las concentraciones de las subunidades
con NTP o NDP unido y [Pi] es la concentración del fosfato inorgánico. La
subunidad con NTP y la subunidad con NDP están en equilibrio:
r¡o _ [S- NTP][NDP] (lS)
Keq - [S - NDP][NTP]
donde [NDP] y [NTP] son las concentraciones de NDP y NTP.
Combinando las ecuaciones (16) , (17) y (18), se puede expresar la
velocidad de crecimiento en los dos extremos del polímero de la siguiente
forma:
146

donde [S] corresponde a la concentración de subunidades libres y equivale a
[S- NTP]. La velocidad de crecimiento de todo el filamento es la suma de las
velocidades de crecimiento en ambos extremos:
dn
- = (k+T + k-T) [S) - (k+D + k-D)
dt 2 2 -1 -1 (21)
La longitud promedio del filamento permanecerá constante (dn/ dt = O)
cuando la concentración de subunidades alcance el valor de la concentración
crítica (Ce) en el estado estacionario:
(22)
y las concentraciones críticas para el extremo "más" y el extremo "menos" son :
(23a)
(23b)
Como ktr con k.!f y k:¡r con lcf no son las reacciones de asociación y
disociación de la misma reacción , sus cuocientes no son generalmente iguales,
lo que produce que las concentraciones críticas sean diferentes en cada
extremo. Un gráfico de las velocidades de polimerización en función de la
concentración para un filamento con "treadmilling" se muestra en la Figura 260.
A diferencia de la Figura 26A, el intercepto a velocidad O con el eje de las
abcisas para los dos extremos no es la misma (C[ 1= C(). Bajo esta condición ,
el filamento crece por un extremo y se acorta por el otro. El extremo en
crecimiento es el extremo "más" y el que se acorta es el extremo "menos". Esta
caracterización refleja el resultado neto de asociación y disociación que puede
ocurrir en ambos extremos.
148

A
e
k+
2
8
velocidad de
polimerización
D
velocidad de
polimerización
extremo+
Figura 26. Diagrama de la polimerización de un filamento polar.
extremo-
concentración de subunidades
extremo+
extremo-
concentración de subunidades
149

Figura 26. Diagrama de la polimerización de un filamento polar.
(A) Crecimiento bidireccional en ausencia de hidrólisis del nucleótido. El extremo de
rápido crecimiento es el extremo "+" y el de lento crecimiento es el extremo "-". (B)
Velocidad de polimerización versus concentración de subunidades para la elongación
bidireccional del polímero polar que se muestra en (A). Bajo la concentración crítica Ce
los dos extremos del filamento se acortan, como se indica por los valores negativos de
la polimerización. (C) "Treadmilling" de un polímero polar en el que se muestran todos
los pasos cinéticos para el ensamblaje de la subunidad con el nucleósido de trifostafo
(NTP) y con el nucleósido de difosfato (NDP) en cualquier extremo del fi lamento polar.
Las princípales vías están remarcadas en negro. (D) Velocidad de polimerización
versus concentración de subunidades para un polímero que exhibe "treadmilling". El
punto Ce corresponde a la concentración crítica del estado estacionario, en donde la
velocidad total, que es la suma de las velocidades en los dos extremos, es O. En ese
valor de concentración ocurre el "treadmilling", debido a que hay un flujo neto de
subunidades que se adicionan por el extremo "+" y un flujo neto de subunidades que
se disocian por el extremo "-". El área sombreada indica el rango de concentración en
el cual la elongación en el extremo "+" ocurre , pero en donde los filamentos libres son
inestables.
150