DIAZ_CESAR_1167D.pdf

amortiguador HEPES 50 mM (pH 7 ,0); PMSF 1 mM y DTT 1 mM , en un
volumen final de 40 ml totales. Esta mezcla celular se traspasó a un vaso
precipitado de vidrio y se sonicó con 8 pulsos de 20 s y pausas de 1 min con
una salida de valor 8 (misonix Sonicator 3000) en hielo para evitar el
sobrecalentamiento. Se volvió a traspasar el lisado sonicado a tubos de 30 ml
y se ultracentrifugó a 100.000 x g por 90 mina 4°C. El precipitado se descartó
y al sobrenadante se le midió el volumen en una probeta y se colocó en un
tubo Falcon de 50 ml. De acuerdo al volumen del sobrenadante, se le agregó
cloruro de potasio sólido para lograr una concentración final de 0,5 M y cloruro
de magnesio a una concentración final de 5 mM. Esta mezcla se incubó a
temperatura ambiente (25°C) por 20 minutos, se traspasó a los tubos de 30 mL
de la ultracentrífuga, se les adicionó GTP 1 mM e inmediatamente se
ultracentrifugó a 100.000 x g por 20 min a 25°C. Después de esta primera
polimerización, el sobrenadante se descartó, se estimó el volumen del
precipitado y se suspendió con la pipeta con aproximadamente 3 a 4
volúmenes del amortiguador HE PES 50 mM (pH 7 ,0) y se incubó en hielo por
20 min. Posteriormente, se ultracentrifugó a 100.000 x g por 20 mina 4°C para
eliminar los agregados de proteína. Este paso indica el fin del primer ciclo de
polimerización y despolimerización. Se midió el volumen del sobrenadante y se
le agregó nuevamente cloruro de potasio 0,5 M; cloruro de magnesio 5 mM y
se incubó a temperatura ambiente por 20 min para iniciar un segundo ciclo de
polimerización y despolimerización con la adición de GTP 1 mM. Este
procedimiento se realizó 3 veces. El último sobrenadante se dializó a 4°C por
12 h contra amortiguador HEPES 50 mM (pH 7,0). Se tomó la proteína
dializada y se centrifugó a 20.000 x g por 30 min para eliminar agregados. Por
último, se alicuotó en tubos "Eppendorf' y se congeló a -80oc para su posterior
uso.
32