DIAZ_CESAR_1167D.pdf

4.1. Purificación de BtubA/8 por ciclos de polimerización y
despolimerización
Muchos trabajos sobre la polimerización de tubulina en la década de los
80's se vieron alterados por proteínas que ce-purificaban con tubulina. De allí
que para caracterizar e! mecanismo de polimerización de BtubAIB es necesario
contar con una proteína pura y en gran cantidad , lo que obligó a mejorar y
optimizar la purificación de esta proteína. El desarrollo de un nuevo método de
purificación se basó en la polimerización de BtubAIB en presencia de GTP y
KCI (Schlieper y cols., 2005), y en la despolimerización de los polímeros al
disminuir la temperatura de la solución a 4°C. Las tres ventajas de este nuevo
método son:
1. Alto rendimiento en la purificación. Se obtuvo un rendimiento de 9 mg de
proteína por litro de cultivo de Escherichia co/i BL21 (ADE3) inducido con
IPTG. Este valor equivale al triple del rendimiento del procedimiento de
purificación que se usó previamente (Schlieper y co ls., 2005). Además,
este método no contempla el uso de columnas de filtración ni de
afinidad, pues sólo requiere de ultracentrifugación.
2. Obtención de BtubA y BtubB en cantidades equimolares y pura. Cuando
se sobre-expresa BtubAIB en !a cepa de Escherichia coli BL21 (ADE3),
se observa por SDS-PAGE que la expresión de BtubA es
aproximadamente 4 veces más alta que la de BtubB. Sin embargo,
cuando se analiza por SDS-PAGE el producto de la purificación de
BtubA/B por los ciclos de polimerización y despolimerización, se observa
que el precipitado está compuesto por BtubA y BtubB en cantidades
equimolares. Este nuevo método de purificación asegura que ambas
proteínas se encuentran en las mismas cantidades, lo que es muy
importante para la determinación de los parámetros cinéticos de la
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