DIAZ_CESAR_1167D.pdf

2.2.8. Microscopía electrónica
Se polimerizó BtubAIB 5 ¡.JM con GTP 1 mM en amortiguador de
polimerización con diferentes concentraciones de KCI y a temperatura
ambiente. Después de 5 min, se adicionó 4 ¡.JL de la mezcla de la reacción a
una grilla de cobre cubierta con carbón. Despúes que las grillas se lavaron tres
veces en el amortiguador de polimerización respectivo, se tiñeron
negativamente con formato de uranílo O, 75%. Las imágenes de las muestras se
obtuvieron a 25°C en un microscopio electrónico Tecnai T12 y con una
magnificación de 52.000X.
2.2.9. Ensayos de precipitación de polímeros a alta velocidad
Se prepararon soluciones de BtubAIB a distintas concentraciones en el
amortiguador de polimerización con distintas concentraciones de KCI. Las
reacciónes se iniciaron a temperatura ambiente con la adición de GTP 1 mM e
inmediatamente se ultracentrifugaron a 100.000 x g en un rotor TLA 100.4 a
25°C por 15 min. Se suspendieron los precipitados en amortiguador de
polimerización sin KCI, se combinaron con amortiguador de carga, se hirvieron
por 1 O m in y se separaron por electroforesis en geles de acrilamida al 1 O% o
en geles en gradiente de acrilamida "Precast" (4-20%; Biorad) cuando se
estimó necesario cuantificar las muestras. Los geles se tiñeron con azul de
Coomassie y se cuantificaron con el programa tmageJ
(http://rsbweb.nih.gov/ij/). Se calibraron las concentraciones con estándares de
BtubAIB cargados en el mismo gel.
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