DIAZ_CESAR_1167D.pdf

amino terminal de las proteínas (pKa= 8,0) y el grupo r.-amino de las lisinas
(pKa=1 0,5). Para no marcar las lisinas (que generalmente se ubican en la
superficie de las proteínas) se debe usar un amortiguador más cercano al pH
neutro, el cual permite marcar específicamente el extremo amino terminal. Esto
se hizo con el amortiguador HEPES 50 mM (pH 7,0), el cual se usó también
para la purificación y todos los ensayos de polimerización. Además del pH del
amortiguador, también se consideró la relación molar sonda/proteína de la
reacción de conjugación. Se hicieron varios ensayos de marcaje a distintas
relaciones molares sonda: proteína. Una relación molar sonda:proteína de 10:1
permitió la obtención de un DOL de 1:1. Para la cuantificación precisa de las
sondas (TAMRA o Alexa Fluor 488), se disolvió aproximadamente 0,5 mg de
cada una en 50 ¡JL de DMSO. Se tomó 1 ¡.¡L y se hizo una dilución de 1:10.000
en el amortiguador HEPES 50 mM (pH 7,0) y se calculó la concentración de
cada una de las sondas utilizando los valores de la absorbancia máxima y el
coeficiente de extinción indicados por el fabricante (lnvitrogen; TAMRA 555
nm/65.000 M- 1 cm- 1 ; Alexa Fluor 488 519 nm/ 73.000 M- 1 cm-\ Se prepararon
150 ¡.¡L de una solución de BtubAJB 200 ¡.¡M en amortiguador HEPES 50 mM
(pH 7,0) y se le adicionó la sonda previamente cuantificada a una
concentración final de 2 mM . La mezcla se incubó en hielo por 1 h con
agitación ocasional suave y en oscuridad. Después se separó la proteína
marcada de la sonda libre con dos columnas "Micro Bio-Spin" (Bio-Rad;
previamente equilibradas con el amortiguador HEPES 50 mM (pH 7,0)) y se le
adicionó KCI 200 mM y MgCI2 5 mM . Se incubó a temperatura ambiente por 1 O
min y en oscuridad. Para seleccionar la proteína marcada competente para
polimerizar, se adicionó GTP 1 mM y se ultracentrifugó a 100.000 x g por 15
min a 25°C. El precipitado se suspendió en amortiguador HEPES 50 mM (pH
7,0), se incubó en hielo por 20 min y en oscuridad y se ultracentrifugó a
100.000 x g por 15 min a 4 oc para eliminar los agregados. La proteína
marcada se microdializó por 6 horas en oscuridad a 4°C contra 100 ml de
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