DIAZ_CESAR_1167D.pdf

amortiguador HE PES 50 mM (pH 7 ,0). Se ultracentrifugó la proteína marcada
por 15 mina 100.000 x g y 4°C, y se guardó en alícuotas de 20 1-JL a -80°C para
su posterior uso. Para determinar el DOL de la proteína marcada, se
descongeló una alícuota de 20 1-JL de BtubAIB-TAMRA y se incubó en hielo con
GTP 1 mM, como se indica en el método de cuantificación de BtubAIB (2.2.4).
Se hizo un espectro de absorción de una solución 1:100 de la proteína
marcada que se obtuvo desde la columna "Micro Bio-Spin" (Bio-Rad). Para
calcular la concentración de proteína, se determinó su absorbancia a 280 nm
sin la contribución de la sonda unida, utilizando la siguiente relación:
Aproteína 280 nm = A2a0 - Amáx X (CF)
donde A28o es la absorbancia a 280 nm que se obtuvo del espectro de
absorción; Amáx es la absorbancia en la longitud de onda de máxima absorción
de la sonda, y CF es la contribución de la sonda a la A2ao (C F= A2ao sonda
libre/Amáx sonda libre) y que en estas condiciones tuvo un valor de 0,23 para el
TAMRA y de 0,17 para el Alexa Fluor 488 (lnvitrogen da un valor de 0,30 para
el TAMRA y de O, 11 para el Alexa Fluor 488 a pH 8,0). A partir del valor de la
absorbancia de la proteína a 280 nm se determinó su concentración
aproximada con el coeficiente de extinción molar teórico (1 03.754,2 M- 1 cm- 1 ) .
La concentración de la sonda se determinó con el valor de la absorbancia en
sus respectivos máximos de absorción y con los coeficientes de extinción molar
dados por el fabricante. La razón entre la concentración molar de la sonda y la
concentración molar de la proteína es igual al DOL.
2.2.6. Ensayos de la actividad GTPásica
La actividad GTPásica de BtubAIB se determinó midiendo la
concentración del fosfato liberado con el ensayo de verde de malaquita
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