DIAZ_CESAR_1167D.pdf

3.2. Caracterización del efecto de potasio sobre la polimerización y la
actividad GTPásica de 8tubA/8
3.2.1. Efecto de potasio sobre la polimerización de 8tubAIB
El desarrollo del nuevo método de purificación de BtubA/B empleado en
este trabajo de tesis permitió corroborar que la polimerización de BtubA/B es
estimulada fuertemente con la adición de KCI (Schlieper y cols., 2005) y que
esta estimulación es específica para el potasio, pues con la utilización de cloruro
de sodio no se pudo purificar la proteína. Sin embargo, no se conoce como el
potasio produce esta estimulación de la polimerización . Por esta razón , se
propuso como objetivo determinar el efecto de potasio sobre la polimerización
de BtubA/8. Para esto, se visualizó los polímeros formados en presencia de
potasio por microscopía confocal y microscopía electrónica, se analizó la
cinética de polimerización de BtubAIB mediante dispersión de luz, y se
cuantificó la cantidad de polímeros por sedimentación a alta velocidad.
3.2.1.1. Microscopía de fluorescencia y microscopía
visualización de los filamentos de 8tubA/8
concentraciones de cloruro de potasio
electrónica:
a distintas
Microscopía confocal. Para observar en solución los polímeros que BtubAIB
forma en presencia de distintas concentraciones de KCI, se incubó BtubA/B 5
!JM (15% del total corresponde a proteína marcada con la sonda TAMRA
denominada BtubA/B-TAMRA) en amortiguador de polimerización (HEPES 50
mM (pH 7,0); MgCI2 5 mM) en ausencia y con diferentes concentraciones de KCI
(50; 1 00; 200; 500 y 1.000 mM) y se adicionó GTP 1 mM para iniciar la
polimerización. Después de 5 min de reacción , se adicionó una alícuota de cada
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