DIAZ_CESAR_1167D.pdf

Soluciones "stock":
1. Solución "stock" de verde de malaquita 1,32 mM en H2S04 3,1 M:
agregar 8,3 mL de H2S0 4 95% a 41 ,7 mL de agua nanopura. Esperar
que se enfríe y agregar 61 mg de verde malaquita.
2. Solución "stock" de molibdato de amonio al 15% en agua nanopura.
3. Solución "stock" de Tween 20 al11 % en agua nanopura.
2.2.7. Ensayos de polimerización por dispersión de luz
Se siguió la cinética de polimerización de BtubA/B con ensayos de
dispersión de luz en un ángulo de 90 grados en un espectrofluorímetro Perkin­
Eimer LS-508, usando una longitud de onda de excitación y emisión de 350
nm, anchos de banda de excitación y emisión de 5 nm y un filtro de transmisión
de 4%. A partir de una solución de BtubA/B 400 1-JM que se encuentra en
amortiguador de polimerización sin KCI (HEPES 50 mM (pH 7,0); MgCI2 5 mM),
se preparó una solución de BtubA/B 20 1-JM en amortiguador de polimerización
con cantidades crecientes de KCI (0,0; 3,13; 6,25; 12,5; 25,0; 50,0; 1 00,0;
200,0; 500,0; 1.000,0 y 2.000,0 mM). La preparación de esta solución de
BtubA/B 20 !JM produjo una dilución de KCI de un 5% con respecto al valor que
se indica. La solución de BtubA/B 20 1-JM se diluyó en serie, con el
amortiguador respectivo, al 75% de su valor inicial para alcanzar las
concentraciones de BtubA/B de 20 ,0; 11,25; 8,44 ; 6,33; 4,75; 6,33; 4,75; 3,55;
2,67; 2,0 y 1,5 !JM. Cada solución se colocó en una cubeta de cuarzo de 500
1-JL y 1 cm de paso óptico y se registró la dispersión de la solución por 5 min a
temperatura ambiente y sin la adición de GTP para establecer la línea base. La
reacción se inició con la adición de GTP 1 mM y la solución se homogeneizó
por inversión de la cubeta (3 veces). Las medidas de dispersión de luz
comenzaron 15-20 s después de la adición del nucleótido.
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