DIAZ_CESAR_1167D.pdf

necesario titularlo con una base fuerte para alcanzar el pH 7,0. Para determinar
el efecto de potasio del amortiguador, se incubó por 5 minutos a temperatura
ambiente diferentes concentraciones de BtubAIB (2,0; 2,67; 3,56; 4,75; 6,33;
8,44; 11 ,25; 15,0; 20,0 1-1M) en amortiguador de polimerización sin KCI (HEPES
50 mM (pH 7,0); MgCb 5 mM) para establecer la línea base de la señal de
dispersión y luego, se indujo la polimerización de BtubAIB a 25°C con una
concentración saturante de GTP (1 mM) . Si se considera que KOH se disocia
completamente en solución, la concentración de potasio sería de
aproximadamente 1 O mM, de acuerdo al volumen usado de KOH 5 M. Como
control se polimerizó BtubAIB 20 1-1M en amortiguador de polimerización titulado
con NaOH. La Figura 11A muestra los cambios en el tiempo de la absorbancia
o señal de dispersión de luz (unidades arbitrarias, u.a.) debido a la
polimerización de BtubAIB en ausencia de KCI. BtubAIB 20 1-JM no polimerizó
con el amortiguador HEPES titulado con NaOH (resu ltado no mostrado), lo que
reafirmó que el requerimiento para la polimerización es específico para potasio.
Cuando se usó el amortiguador titulado con KOH , se observó a partir de una
concentración de BtubAIB 11,25 1-JM, un incremento en la señal de dispersión
de luz directamente proporcional a la concentración de BtubAIB.
Las tres curvas que describen el curso temporal de la polimerización de
BtubAIB sin KCI son sigmoideas y muestran claramente una etapa de latencia
o etapa de nucleación seguidas por la etapa de elongación y la aproximación a
un valor máximo que disminuye en forma más pronunciada a mayor
concentración de proteína (Figura 11A). El máximo valor de intensidad se
alcanzó aproximadamente a los 2,0 min (BtubAIB 20,0 1-JM), 2,8 min (BtubAIB
15,0 1-JM) y 5,0 min (BtubAIB 11 ,25 1-JM) y probablemente durante éste, los
filamentos son muy dinámicos y polimerizan y despolimerizan continuamente.
La disminución de la intensidad de la luz dispersada que sigue al máximo se
debe al agotamiento de GTP debido a la hidrólisis. Esta disminución de la señal
de dispersión de luz indica el inicio de la despolimerización de los filamentos.
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