DIAZ_CESAR_1167D.pdf

3.2.1.3. Cuantificación de la polimerización de BtubAIB por
sedimentación a alta velocidad
Para analizar la cantidad de polímeros formados en las distintas
concentraciones de KCI, se usó sedimentación a alta velocidad para precipitar
los polímeros formados. Para esto se incubaron distintas concentraciones de
BtubA/B con diferentes concentraciones de KCI. Se indujo la polimerización
con GTP 1 mM a 25°C y se ultracentrifugó inmediatamente a 100.000 x g por
15 minutos a la misma temperatura y se visualizó el precipitado por SDS­
PAGE, como se indica en Materiales y Métodos. Se observó que el incremento
de KC I indujo la aparición de la proteína en el precipitado a menores
concentraciones respecto al ensayo sin KCI (Figura 16A). Este experimento se
repitió con geles de acrilamida en gradiente "Precast" (BioRad) para cuantificar
los polímeros formados con KCI 12,5; 50,0 y 200,0 mM (Figura 168). Se
cuantificó la intensidad de las bandas de cada gel con el programa IMAGEJ, se
calculó la concentración de proteína en el polímero precipitado (Ver Materiales
y Métodos) y se graficó en función de la concentración inicial de proteína
(Figura 16C). La intersección de la recta de la regresión lineal con el eje "x"
equivale a la concentración crítica de la polimerización: 4,59 IJM para KCI 12,5
mM; 3,75 ¡.JM para KCI 50 mM y 2,84 ¡.JM para KCI 200,0 mM . Estos valores son
similares a los obtenidos por dispersión de luz (Tabla 1 ).
71