DIAZ_CESAR_1167D.pdf

2.2.4. Cuantificación de la tubulina bacteriana BtubA/8
Antes de los experimentos de polimerización, alícuotas de BtubA/B se
descongelaron en hielo y se incubaron con un exceso de GTP (0,5 mM) por 1 h
y en hielo. Después se separó la proteína del nucleótido libre usando una
columna "Micro Bio-Spin" (Bio-Rad), previamente equilibrada con amortiguador
de polimerización sin KCI (HEPES 50 mM (pH 7,0) ; MgCI2 5 mM). Se realizó
una dilución de 1:100 con la proteína equilibrada y se determinó su
concentración a partir de su valor de absorbancia a 280 nm. Los valores de los
coeficientes de extinción, de acuerdo a la composición de aminoácidos ,
corresponden a 47.900 M- 1 cm· 1 y 39.880 M- 1 cm· 1 para BtubA y BtubB,
respectivamente. Además, se debe incluir la contribución de GTP a la
absorbancia a 280 nm. El coeficiente de extinción de GTP a pH 7,0 es de
13.700 M- 1 cm· 1 a una longitud de onda de 254 nm. A una longitud de 280 nm,
GTP absorbe aproximadamente un 58,3% con respecto a su máximo valor de
absorbancia. Esto significa que el coeficiente de extinción de GTP a 280 nm es
aproximadamente 7.987,1 M- 1 cm· 1 . Suponiendo que BtubA y BtubB unen cada
una un mol de GTP, el coeficiente de extinción molar corregido corresponde a
103.754,2 M- 1 cm· 1 .
2.2.5. Marcación fluorescente de la tubulina bacteriana BtubAIB
Para observar la polimerización de los filamentos de BtubA/B, se
estandarizó un método de marcaje fluorescente que permitió obtener una
relación de marcaje sonda:proteína (DOL) de aproximadamente 1:1 . La
relación 1:1 del marcaje se consiguió en base a las propiedades químicas de la
sonda fluorescente. La tubulina bacteriana se modificó con las sondas 5,6-
carboxitetrametilrodamina, succinimidil éster (TAMRA) y Alexa Fluor 488, las
que reaccionan con los grupos amina alifáticos no protonados que incluyen el
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