DIAZ_CESAR_1167D.pdf

3.4.3. Polimerización de BtubA/8 en presencia de GMPCPP
Como ya se mencionó, los mecanismos dinámicos de los microtúbulos y
de los filamentos de actina son dependientes de la hidrólisis del nucleótido. Para
demostrar que las dinámicas de los filamentos de BtubAIB dependen de la
hidrólisis de GTP, se observó la polimerización de BtubAIB 5,0 ¡.¡M, KCI 12,5
mM, en presencia del análogo no hidrolizable GMPCPP 1,0 mM (Figura 23A).
Se observó una gran cantidad de filamentos cortos de aproximadamente 5 ¡.¡m
de longitud y que cuyo largo final se alcanzó a los 5 minutos de iniciada la
polimerización. A los 50 minutos de reacción, los filamentos cortos se visualizan
iguales que a los 1 O minutos (resultado no mostrado), lo que indica que estos
filamentos no exhiben mecanismos dinámicos de polimerización y
despolimerización. Como control se visualizó la polimerización de BtubAIB 5,0
¡.¡M, KCI 12,5 mM y GTP 1,0 mM. Se observó una menor densidad de
fi lamentos, pero de longitud mayor (Figura 238). Además, los filamentos
exhiben inestabilidad dinámica y "treadmilling", lo que se visualizó como un
continuo reordenamiento de los filamentos a lo largo del tiempo. Este
comportamiento continuó hasta los 45 minutos de iniciada la reacción . Este
resultado demuestra que, al igual que en los microtúbulos, la hidrólisis del
nucleótido es necesaria para la despolimerización pero no para la
polimerización de los filamentos de BtubAIB . Además, este resultado indicaría
que BtubAIB tiene mayor afinidad por GMPCPP que por GTP y/o que el
GMPCPP disminuye la concentración crítica de la po limerización , pues se
forman un gran número de pequeños filamentos de BtubAIB y como ya se
señaló, el número de filamentos es determinado en la fase de nucleación y
depende de la concentración crítica . Esto impidió el crecimiento de los
filamentos cortos debido a la poca disponibilidad de proteína libre para
polimerizar.
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