DIAZ_CESAR_1167D.pdf

2.2.10. Observación de la polimerización de BtubA/8 por microscopía
confocal
Este protocolo lo diseñó Viviana Risca en el laboratorio de Dan Fletcher
(Universidad de California, Berkeley) y está basado en el protocolo del lavado
ácido de los cubreobjetos del laboratorio de T ed Salman:
(http://www.bio.unc.edu/faculty/salmon/lab/protocolscoverslippreps.html)
Preparación de los cubreobjetos
Se calentaron sin hervir en un microondas 150 ml de agua nanopura,
dentro de un vaso precipitado de 250 ml, y se adicionó los cubreobjetos uno
por uno al agua caliente para evitar que se pegaran entre si. Bajo campana se
adicionó HCI 1 M al vaso precipitado con el agua caliente y los cubreobjetos, se
mezclaron y cubrieron con parafilm y papel aluminio. Las etapas de este
procedimiento de lavado ácido de los cubreobjetos son:
1. Se calentaron los cubreobjetos (22 x 40 mm para los canales de
reacción; 22 x 22 mm para los cubiertos de poli-L-Iisina) en el vaso
precipitado con HCI1 M a 50-60°C por 4-16 h.
2. Se enfriaron a temperatura ambiente.
3. Se eliminó el HCI con 100 ml de agua nanopura, tres veces.
4. Se llenó el vaso con 150 ml de agua nanopura y se sonicó en un baño
de agua por 20 minutos. Alternativamente, se puede sonicar
directamente el vaso con agua nanopura con los cubreobjetos con un
pulso de 20 min y con una salida de valor 8 (Misonix Sonicator 3000).
5. Se repitió dos veces el paso 4.
6. Se agregó 200 ml de etanol 50% (Merck, grado HPLC) en agua
nanopura y se sonicó igual que en el paso 4.
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