La fuerza protón-motriz

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370 21 La fuerza protón-motriz ? PREGUNTA RÁPIDA 1 ¿Por qué las subunidades F1 de la ATP sintasa aisladas catalizan la hidrólisis de ATP? O ADP + P i α β β γ α α β ATP ADP + P i T ADP + P i Figura 21.4 Los lugares de unión a nucleótidos de la ATP sintasa no son equivalentes. La subunidad g ocupa el centro del hexámero a 3b 3 y hace que los lugares de unión a nucleótidos de las subunidades b sean distintos entre sí. L El flujo de protones a través de la ATP sintasa da lugar a la liberación del ATP fuertemente unido La ATP sintasa cataliza la formación de ATP a partir de ADP y ortofosfato. ADP 32 1 HPO 4 22 1 H 1 N ATP 42 1 H2O Hay tres centros activos en la enzima y, en todo momento, cada uno está llevando a cabo una de las tres funciones distintas. La fuerza protón-motriz hace que los tres centros activos cambien de función de manera secuencial, a medida que los protones fluyen a través del componente de la enzima que está integrado en la membrana. De hecho, se puede considerar que la enzima está formada por una parte móvil y una parte estacionaria: (1) la parte móvil, también llamada rotor, está formada por el anillo c y el tallo g y (2) la parte estacionaria, también llamada estátor, está formada por el resto de la molécula. ¿Cómo responde cada uno de los tres centros activos de la ATP sintasa al flujo de protones? Una serie de observaciones experimentales sugirieron un mecanismo de cambio de unión para la síntesis de ATP impulsada por los protones. Esta propuesta establece que, mediante un cambio de conformación, una subunidad b puede realizar cada uno de los tres pasos secuenciales del proceso de síntesis de ATP. Estos pasos son (1) la captura del ADP y del P i, (2) la síntesis de ATP y (3) la liberación del ATP y la unión del ADP y del P i. Como ya se ha comentado, las interacciones con la subunidad g hacen que las tres subunidades b no sean equivalentes (Figura 21.4). En un momento dado, habrá una subunidad b que estará en la conformación L, relajada. Esta conformación se une al ADP y al P i. Una segunda subunidad b estará en la conformación T, tensa. Esta conformación se une al ATP con gran avidez, hasta tal punto que convertirá al ADP y al P i unidos en ATP. Tanto la conformación L como la T se encuentran lo suficientemente constreñidas como para no ser capaces de liberar los nucleótidos unidos. La última subunidad b estará en la forma O, abierta. Esta forma adopta una conformación más abierta y se puede unir a nucleótidos de adenina o liberarlos. La rotación de la subunidad g impulsa la interconversión de estas tres formas (Figura 21.5). El ADP y el P i unidos a la subunidad b en la forma T se combinan para formar ATP. Supongamos que la subunidad g gira 120 grados en sentido contrario a las agujas del reloj (si miramos desde la matriz). Esta rotación convierte al centro activo de la forma T en un centro activo de la forma O con el nucleótido unido en forma de ATP. Al mismo tiempo, el centro activo de la forma L se convierte en un centro activo de la forma T, lo que permite la transformación de otro ADP y otro P i en ATP. El ATP que se encuentra en el centro activo de la forma O puede ahora abandonar la enzima para ser sustituido por ADP y P i. Una nueva rotación de 120 grados convierte este centro activo de la forma O en un centro activo de la forma L, con lo que estos sustratos quedan atrapados. Cada subunidad pasa de la forma T a la forma O y, posteriormente, a la forma L sin que en ningún momento haya dos subunidades que estén en la misma conformación. Este mecanismo sugiere que el ATP se puede sintetizar y liberar impulsando la rotación de la subunidad g en el sentido correcto. Hay que O L Rotación de 120° de γ L ATP T L ATP T L ATP T ADP + Pi γ ADP + Pi (en sentido antihorario) ADP + Pi γ ADP + Pi ADP + Pi γ ADP + Pi ADP + Pi γ ADP + Pi ATP ATP ADP ATP + ADP + P P i i T O ADP + P i O O Figura 21.5 Mecanismo de cambio de unión para la ATP sintasa. La rotación de la subunidad g interconvierte las tres subunidades b. La subunidad en la forma T (tensa) convierte el ADP y el P i en ATP, pero no permite que se libere el ATP. Cuando la subunidad g rota 120° en sentido antihorario, la subunidad en forma T se convierte en la forma O, lo que permite la liberación del ATP. A continuación, nuevas moléculas de ADP y de Pi pueden unirse a la subunidad en forma O. Otra rotación de 120° (que no se muestra en la figura) atrapa estos sustratos en una subunidad en forma L
señalar que el papel del gradiente de protones no consiste en participar directamente en la formación de ATP sino en impulsar la disociación del ATP del enzima. La catálisis rotativa es el motor molecular más pequeño del mundo ¿Es posible observar directamente la rotación propuesta? Ingeniosos experimentos han demostrado la rotación utilizando un sencillo sistema experimental formado únicamente por las subunidades a 3b 3g clonadas (Figura 21.6). Las subunidades b se modificaron por ingeniería genética para que presenten colas de polihistidina en su extremo amino, que tienen una elevada afinidad hacia los iones níquel. Gracias a esta propiedad de las colas de polihistidina, se pudo inmovilizar el complejo a 3b 3 sobre una superficie de vidrio recubierta de iones níquel. La subunidad g estaba unida a un filamento de actina marcado fluorescentemente para proporcionar un largo segmento que pudiese ser observado mediante un microscopio de fluorescencia. Curiosamente, la adición de ATP hacía que el filamento de actina rotase en una dirección contraria a las agujas del reloj. La subunidad g estaba girando, impulsada por la hidrólisis del ATP. De este modo, se podía observar la actividad catalítica de una molécula individual. La rotación en sentido antihorario es consistente con la dirección que cabría esperar para la hidrólisis porque la molécula se estaba observando desde abajo si tomamos como referencia la perspectiva mostrada en la Figura 21.5. Un análisis más detallado en presencia de concentraciones menores de ATP puso de manifiesto que la subunidad g gira en incrementos de 120 grados. Cada incremento corresponde a la hidrólisis de una única molécula de ATP. Además, a partir de los resultados obtenidos con filamentos de actina de distinta longitud (lo que contribuye a incrementar la resistencia al giro) y midiendo la velocidad de rotación, parece ser que la enzima funciona con una eficacia cercana al 100%; es decir, prácticamente toda le energía liberada por la hidrólisis del ATP se convierte en movimiento rotacional. Filamento de actina γ α β ATP + H 2 O ADP + P i Figura 21.6 Observación directa de la rotación de la ATP sintasa impulsada por el ATP. Se fija el hexámero a3b3 de la ATP sintasa sobre una superficie, con la subunidad g proyectándose hacia arriba y unida a un filamento de actina marcado fluorescentemente. La adición y posterior hidrólisis de ATP da lugar a la rotación de la subunidad g en sentido antihorario, que puede observarse directamente a través de un microscopio de fluorescencia. El flujo de protones en torno al anillo c impulsa la síntesis de ATP La observación directa del movimiento rotatorio de la subunidad g es una sólida evidencia a favor del mecanismo rotacional para la síntesis de ATP. La última pregunta que queda por responder es: ¿cómo impulsa el flujo de protones a través de F0 la rotación de la subunidad g? Howard Berg y George Oster propusieron un elegante mecanismo que ofrece una clara respuesta a esta cuestión. El mecanismo depende de la estructura de las subunidades a y c y de F0 (Figura 21.7). La subunidad a se apoya directamente en el anillo formado por entre 8 y 15 subunidades c que atraviesa la membrana. Las evidencias experimentales relacionadas con la estructura de la subunidad a son consistentes con un modelo que presenta dos semicanales hidrofílicos que no atraviesan por completo la membrana (ver la Figura 21.7). Por tanto, los protones son capaces de introducirse en cualquiera de estos dos canales pero no pueden atravesar completamente la membrana. La subunidad a está colocada de forma que cada semicanal interacciona directamente con una subunidad c. Cambios secuenciales de las formas que adoptan los tres centros activos de la ATP sintasa Subunidad 1 L S T S O S L S T S O… Subunidad 2 O S L S T S O S L S T… Subunidad 3 T S O S L S T S O S L… Ácido aspártico Semicanal del lado citoplasmático Semicanal del lado de la matriz Subunidad c Subunidad a Figura 21.7 Componentes de la unidad transportadora de protones de la ATP sintasa. La subunidad c está formada por dos hélices que atraviesan la membrana. En una de las hélices hay un residuo de ácido aspártico situado en el centro de la membrana. La estructura de la subunidad a parece incluir dos semicanales que permiten la entrada de los protones, que sólo pueden atravesar parte de la membrana, no toda. 371
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