QUANTA LiteTM dsDNA - inova

NOVA Lite ® Monkey Oesophagus/Jejunum IFA Slides
Per uso diagnostico In Vitro
Solo para exportación. No comercializable en Estados Unidos.
Codice Prodotto: 504215, 504215.10
Complessità CLIA: elevata
Finalità d’uso
Las secciones de esófago/yeyuno de mono se utilizan como sustrato para la detección de anticuerpos antiendomisio
en suero humano, como ayuda en el diagnóstico de la enfermedad.
Sumario y Explicación de la prueba
Los anticuerpos anti-endomisio se dirigen contra las fibras de reticulina que se encuentra en el tejido
conectivo que rodea a las fibras de músculo liso de los tractos intestinales de los primates. Se ha encontrado
una sensibilidad y especificidad de prácticamente el 100% para anticuerpos anti-endomisio clase IgA en
enfermedad celíaca activa. 1,2 Estos anticuerpos se detectan mediante anticuerpos anti-IgA humana
conjugados con fluoresceína. Se ha de valorar el estado de los anticuerpos IgG en el caso de pacientes con
deficiencia de IgA 3 , donde se recomienda el uso de un conjugado anti-IgG (H y L) humana (adsorbido para
mono). Las inmunoglobulinas del suero del paciente se unen de manera no específica al citoplasma de
algunas células en el yeyuno, y aunque esto no bloquea directamente el endomisio, el patrón anti-endomisio
se observará más claramente si las muestras se diluyen en suero normal de oveja en lugar de en PBS.
Las secciones de esófago de mono pueden utilizarse para la detección de anticuerpos anti-epidérmicos, sin
embargo recomendamos el uso de los portaobjetos y kit de el INOVA diseñados especialmente para este
propósito (704160, 704165, 504160 y 504160.10).
Procedimiento de trabajo
Se sigue la técnica de la inmunofluorescencia indirecta 4 , en la que las muestras de los pacientes y los
controles apropiados se incuban con el sustrato del portaobjetos. Los anticuerpos que no reaccionan se
eliminan mediante un lavado y se aplica el conjugado apropiado marcado con fluoresceína. Se elimina el
exceso de conjugado mediante un lavado y se observan los portaobjetos con un microscopio de
fluorescencia. Las muestras positivas producen una fluorescencia verde que corresponde a las áreas de la
sección a las que se ha unido el autoanticuerpo.
Reactivos
Secciones de esófago/yeyuno de mono sobre portaobjetos de 5 pocillos, empaquetados en sobres
individuales con un desecante.
Advertencias/Precauciones
Se han de establecer métodos de manipulación y eliminación correctos, del mismo modo que para todo
material potencialmente infeccioso. Únicamente se debe permitir la realización de estos procedimientos a
personal adecuadamente entrenado en dichos métodos.
Condiciones de almacenamiento
Los portaobjetos se han de conservar a 2-8ºC y pueden utilizarse hasta la fecha de caducidad indicada. NO
CONGELAR. Una vez se ha extraído el portaobjetos de su envoltorio individual, debe utilizarse
inmediatamente.
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Recolección de Muestras
Las muestras de sangre se han de obtener mediante punción en vena. Se ha de permitir su coagulación
espontánea y separar el suero lo antes posible para prevenir la hemólisis. El suero puede conservarse a 2-
8°C durante un máximo de 7 días antes del ensayo 7 o para periodos más largos, distribuir el suero en
alícuotas y conservarlo a -20°C, o temperatura inferior. No congelar y descongelar el suero más de una vez.
Se ha de evitar el uso de sueros lipémicos, hemolizados o con contaminación microbiana ya que pueden
originar títulos más bajos o patrones poco claros.
Procedimiento
Materiales Suministrados
1. 10 x Monkey Oesophagus/jejunum slide (5-well) (1 x o 10 x portaobjetos de esófago/yeyuno de
mono, 5 pocillos).
Material necesario no incluido
1. Agua destilada o desionizada para diluir el PBS concentrado.
2. Contenedor para el tampón PBS.
3. Micropipetas y puntas desechables para aplicar las muestras.
4. Cámara húmeda para las incubaciones
5. Microscopio de fluorescencia con filtro de excitación de 495nm y filtro barrera de 515nm.
6. Botella lavadora para los lavados iniciales con PBS.
Los componentes adicionales pueden obtenerse de INOVA Diagnostics: PBS (508002), control negativo IFA
Sistema (508186), control positivo anti-endomisio (504050), conjugado (H&L) adsorbida para mono FITC
(504011, 504071), conjugado anti-IgA humana (cadena α) AFF FITC (504023, 504045), conjugado-IgA
adsorbida para mono FITC no EB (504015), azul de Evans (504049) y medio de montaje (508001, 508005,
508006).
Procedimiento del test
Control de calidad
Deben utilizarse controles positivos y negativos cada vez que se ensayen las muestras.
1. Medio de montaje. Llevar el medio de montaje a temperatura ambiente (18-28ºC) antes de utilizarlo.
2. Dilución de muestras de pacientes y controles. Diluir las muestras de pacientes 1/10 añadiendo 20µL
de suero a 180µL de suero de oveja o PBS.
3. Portaobjetos. Llevar los portaobjetos con el sustrato a temperatura ambiente (18-28ºC) antes de
extraerlos de su envoltorio individual. Marcar los portaobjetos adecuadamente, colocarlos en la
cámara húmeda y añadir una gota de control positivo y negativo en los pocillos adecuados. Añadir
50µL de las muestras de paciente diluidas en los pocillos restantes.
4. Incubación. Incubar los portaobjetos durante 30 minutos en una cámara húmeda a temperatura
ambiente (18-28ºC).
5. Lavado con PBS. Retirar los portaobjetos de la cámara húmeda y lavar con PBS utilizando la botella
lavadora. No aplicar el líquido directamente en los pocillos. Colocar los portaobjetos en un rack,
sumergir en PBS y agitar durante 5-10 minutos.
6. Adición del conjugado con fluoresceína. Eliminar el exceso de PBS sacudiendo ligeramente el
portaobjetos y secar alrededor de los pocillos. Colocar de nuevo los portaobjetos en la cámara
húmeda y aplicar una gota de conjugado cubriendo completamente el tejido. NO DEJAR LOS
POCILLOS DESCUBIERTOS DURANTE MÁS DE 15 SEGUNDOS. Los resultados se ven
enormemente afectados si el sustrato se seca. El uso conjugado adsorbida para mono aumentará en
gran medida los resultados (por ejemplo, 504011)
7. Incubación del portaobjetos. Incubar los portaobjetos durante 30 minutos en una cámara húmeda a
temperatura ambiente (18-28ºC) en la oscuridad.
8. Lavado con PBS. Lavar de nuevo como se indica en el paso 5 CONTRASTE OPCIONAL. Añadir 2 o
3 gotas de Azul de Evans al 1% por 100mL de PBS antes de la inmersión de los portaobjetos.
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9. Montaje con el cubreobjetos. Retirar los portaobjetos uno a uno del lavado con PBS para proceder a
la colocación del cubreobjetos. Secar alrededor de los pocillos de forma rápida y añadir una gota de
medio de montaje a cada pocillo. Colocar cuidadosamente el cubreobjetos, evitando la formación de
burbujas de aire, pero sin tratar de eliminarlas si se forman. Limpiar el exceso de medio de montaje
alrededor de los bordes del cubreobjetos.
10. Visualización de los portaobjetos con el microscopio de fluorescencia. Los portaobjetos pueden
guardarse hasta 3 días a 2-8ºC, en la oscuridad sin una pérdida significativa de fluorescencia.
Resultados
Control de calidad
El control positivo anti-endomisio IgA, utilizado con un conjugado anti-IgA ha de dar una fluorescencia verde
brillante en las fibras de reticulina en el tejido conectivo alrededor de las fibras de músculo liso. Un patrón de
fluorescencia similar se ha de observar cuando se utiliza un control anti-endomisio IgG con un conjugado
adsorbido para mono anti-IgG (H&L). El control negativo ha de mostrar un color verde apagado en todo el
tejido, sin fluorescencia discernible. Si los controles no aparecen tal como se describe, el ensayo no es
válido y se ha de repetir.
Interpretación de los resultados
Ver las referencias 3 y 5 como ejemplos fotográficas para estos patrones. Los resultados se informan como
positivo o negativo.
Cada laboratorio debe establecer en qué punto un resultado positivo se considera como clínicamente
significativo.
Limitaciones del Procedimiento
1. Este test por sí sólo no debe considerarse diagnóstico. Todos los demás factores incluyendo la
historia clínica de los pacientes y otros resultados serológicos o de biopsia también han de tenerse
en cuenta.
2. Pueden darse reacciones cruzadas debidas a anticuerpos de grupo sanguíneo anti-A y anti-B, ya que
la mucosa del esófago contiene ciertas sustancias de grupo sanguíneo (ref. 6). En algunos pacientes
el patrón de tinción puede imitar al de anticuerpos anti-pénfigo, aunque los anticuerpos de grupo
sanguíneo marcarán también los capilares de la musculatura esofágica.
3. La fuente de luz, filtros y ópticas de distintos tipos de los microscopios de fluorescencia influye en la
sensibilidad del ensayo. La funcionalidad del microscopio se ve significativamente afectada por un
mantenimiento correcto especialmente de la lámpara de vapor de mercurio y por el cambio de dicha
lámpara al transurrir el período de tiempo recomendado.
4. La conveniencia de uso con reactivos de otros fabricantes de IFA no ha sido comprobada, aunque no
se excluye su uso con dicho tipo de reactivos.
Resumen del procedimiento
1. Llevar el medio de montaje a temperatura ambiente.
2. Diluir el PBS con agua destilada o desionizada.
3. Diluir los sueros de los pacientes y controles 1/10 con suero ovino o PBS.
4. Llevar los portaobjetos con el tejido a temperatura ambiente (18-28ºC).
5. Añadir 50µL de suero diluido al pocillo.
6. Incubar en cámara húmeda duarante 30 minutos.
7. Lavar durante 5-10 minutos en PBS.
8. Secar alrededor de cada pocillo y cubrir inmediatamente cada uno con una gota de conjugado.
9. Incubar como en el paso 6.
10. Lavar como en el paso 7.
11. Monte.
12. Observar el portaobjetos utilizando el microscopio de fluorescencia.
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Referencias
1. Sacchetti L., Ferrajolo A. et al (1996): Diagnostic value of various serum antibodies detected by
diverse methods in childhood coeliac disease. Clinical Chemistry 42: 11: 1838 – 1842.
2. Sategna-Guidetti C. et al (1995): Comparison of serum anti-gliadin, anti-endomysium and antijejunum
antibodies, in adult coeliac sprue. J. Clin. Gastroenterol. 20 (1) 17 – 21.
3. Bradwell A. R., Stokes R. P. and Mead G. P. (1999) Advanced atlas of autoantibody patterns. Pub:
The Binding Site Ltd., Birmingham UK.
4. Weller, T. H. Coons, A. H. (1954): Fluorescent antibody studies with agent of Varicella and Herpes
Zoster propagated in vitro: Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86: 789-794.
5. Bradwell A. R. et al (1997): Atlas of autoantibody patterns on tissues. Pub: The Binding Site Ltd.,
Birmingham UK.
6. Szulman A E. (1962): The histological distribution of blood group substances A and B in man. J. Exp.
Med. 115: 977
7. Protein Reference Handbook of Autoimmunity (3 rd Edition) 2004. Ed. A Milford Ward, GD Wild. Publ.
PRU Publications, Sheffield. 14.
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