QUANTA LiteTM dsDNA - inova

6. Solución de Lavado Concentrada HRP, 1 frasco de concentrado 40x color rojo conteniendo tampón conTris y Tween 20, 25ml. Referirse a la Sección “Metodología” para instrucciones de dilución.7. Conjugado HRP IgG, con anti- IgG humana de cabra, 1 frasco - color azul conteniendo tampón,estabilizante de proteína y conservante, 10ml8. Cromógeno TMB, 1 frasco conteniendo estabilizantes, 10ml9. Solución de Parada HRP, Acido Sulfúrico 0.344 M, 1 frasco, incolora, 10 mlAdvertencias1. Aviso: Este producto contiene cloramfenicol al 0.02% en el Diluyente de muestras, controles y conjugadoconsiderado en el estado de California como causante de cáncer.2. Todo material de origen humano usado en la preparación de los controles para este producto se haexaminado resultando negativo para anticuerpos contra HIV, HbsAg, y HCV por métodos aprobados porla FDA. Ningún método puede sin embargo ofrecer garantía completa que HIV, HBV, HCV o otrosagentes contagiosos estén ausentes. Por lo tanto, los controles GPA ELISA positivo fuerte, GPA ELISApositivo débil y ELISA negativo deben manejarse como si fueran material potencialmente contagioso. 163. Dado que se utiliza azida sódica como conservante, este producto puede ser tóxico por ingestión oabsorción a través de piel o mucosas. La azida sódica puede reaccionar con el plomo o cobre de lastuberías para formar azidas metálicas potencialmente explosivas. Si se utilizan desagües para laeliminación de reactivos se recomienda lavarlos con abundante agua para prevenir la formación dedichas azidas metálicas.4. El Conjugado HRP contiene diluido un producto químico venenoso y corrosivo que puede ser tóxico si seingiere. Para impedir quemaduras, evitar el contacto con piel o ojos.5. El Cromógeno TMB contiene un irritante. Puede ser dañino si es inhalado, ingerido o absorbido por lapiel. Evitar la inhalación, ingestión o contacto con piel y ojos.6. La Solución de parada HRP consiste de una solución diluida de ácido sulfúrico. Evitar exposición a bases,metales, u otros compuestos que puedan reaccionar con ácidos. El ácido Sulfúrico es venenoso ycorrosivo, puede ser tóxico si ingerido. Para impedir quemaduras, evitar contacto con piel y ojos.7. Se recomienda utilizar el equipo protector apropiado al trabajar con este kit.8. Los reactivos derramados deben limpiarse inmediatamente. Siga las normas aplicables en su laboratorioacerca de la eliminación de residuos.Precauciones1. Este producto es para ser usado en el Diagnóstico In Vitro.2. La sustitución de componentes diferentes de los incluidos en el sistema puede generar resultadosinconsistentes.3. Un lavado incompleto o ineficiente y una eliminación insuficiente de líquido de los pocillos puede dar lugara una pérdida de precisión y/o un fondo elevado.4. La adaptación de este ensayo para su uso en procesadores automáticos u otros dispositivos, totalmenteo en parte, puede producir diferencias en los resultados en comparación con el procedimiento manual. Esresponsabilidad de cada laboratorio de validar sus procedimiento automatizado y comprobar que produceresultados dentro de los límites aceptables.5. Existe una variedad de factores que influyen en la realización del ensayo. Esto incluye la temperaturainicial de los reactivos, la temperatura ambiente, la exactitud y reproducibilidad de técnica de pipeteo, lacalidad de la técnica de lavando, el fotómetro que se utiliza para medir los resultados, y los tiempos deincubación durante el ensayo. Es necesario un exquisito cuidado y un trabajo consistente para obtenerresultados exactos y reproducibles.6. Se recomienda seguir estrictamente el protocolo.7. El sellado incompleto de la bolsa “zip-lock” que contenga tiras sin usar y desecante provocará ladegradación del antígeno que se apreciará en un empeoramiento de la precisión de resultados.8. Pueden observarse absorbancias inaceptablemente bajas tras dos o más usos separados de unconjugado HRP. Es importante seguir todas las recomendaciones de manipulación específicas para esteproducto para evitar que esto ocurra.9. La contaminación química del conjugado HRP puede ocurrir como resultado de una limpieza o secadoinadecuados del equipo o instrumentos. Residuos de productos químicos comunes en el laboratorio comoformalina, lejía, etanol, o detergente causan la degradación del conjugado HRP con el tiempo. Enjuaguebien todo equipo o instrumentos después de usar dichos productos.Condiciones de Almacenaje1. Guardar todos los reactivos del kit en nevera a 2-8°C. No congelar. Los reactivos son estables hasta lafecha de caducidad si son almacenados y manipulados correctamente.2. Las tiras sin utilizar deben volverse a guardar en la bolsa de aluminio que contiene desecantes cerrándolaherméticamente y almacenándola a 2-8ºC.3. La solución de lavado diluida es estable 1 semana a 2-8°C.Recolección de MuestrasEste kit requiere suero como muestra. La adición de azida u otros conservantes a las muestras puede afectaradversamente los resultados. No deben utilizarse muestras contaminadas, tratadas por calor o que contenganpartículas visibles. Deben asimismo evitarse las muestras lipémicas o hemolizadas.Tras la recolección de las muestras de sangre, el suero debe ser separado del coágulo. El documento NCCLSH18-A2 recomienda las siguientes condiciones de almacenaje para muestras: 1) Guardar las muestras atemperatura ambiente no más de 8 horas. 2) Si el ensayo no se va completar en 8 horas, refrigerar la muestra a2-8°C. 3) Si el ensayo no se va completar entre 48 horas, o para enviar las muestras, congelar a -20°C o atemperatura inferior. Una vez descongeladas las muestras deben agitarse bien antes de utilizarse.2

ProcedimientoMateriales Suministrados1 Microplaca GPA ELISA (12-1 x 8 pocillos), con soporte1 1.2 ml control prediluido negativo ELISA1 1.2ml control prediluido GPA ELISA Positivo Débil1 1.2ml control prediluido GPA ELISA Positivo Fuerte1 50ml Diluyente de muestra HRP1 25ml Solución de lavado concentrada 40X1 10ml Conjugado IgG (cabra) anti IgG humana1 10ml Cromógeno TMB1 10ml Solución parada HRP (Ácido Sulfúrico 0.344M)Material necesario no incluidoMicropipetas para 5, 100, 200-300 y 500µlPuntas desechables para micropipetaTubos para dilución de muestras, 4mlAgua destiladaRecipiente de 1L para la solución de lavado reconstituidaLector de microplacas capaz de medir densidades ópticas a 450nm (y a 620nm para lecturas de doble longitud deonda)MetodologíaAntes de empezar1. Llevar todos reactivos y muestras a la temperatura ambiente (20-26°C) y agitar.2. Diluir la solución de lavado HRP 1:40 añadiendo el contenido del envase con concentrado a 975 ml deagua destilada. Si no va a utilizar toda la placa, puede preparar una cantidad menor de solución delavado añadiendo 2.0 ml del concentrado a 78ml de agua destilada para cada 16 pocillos que vayan autilizarse. El tampón diluido es estable 1 semana a 2-8°C.3. Preparar una dilución 1:101 de cada muestra a procesar añadiendo 5 µl de muestra a 500 µl de diluyente.Las muestras diluidas deben ser utilizadas dentro de las 8 horas de su preparación. NO DILUIR loscontroles GPA ELISA positivo débil, positivo fuerte y ELISA negativo.4. La determinación de la presencia o ausencia de anticuerpos anti ATPasa H+/K+, usando unidadesarbitrarias requiere dos pocillos para cada uno de los tres controles y uno o dos pocillos para cadamuestra. Se recomienda que las muestras se hagan por duplicado.Procedimiento de Ensayo1. TODOS REACTIVOS DEBEN ESTAR A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26°C) ANTES DE EMPEZAREL ENSAYO. Ponga el número necesario de tiras en el soporte. Devolver inmediatamente las tiras sinutilizar a la bolsa de aluminio y sellarla firmemente para minimizar la exposición a la humedad.2. Agregar 100µl de los controles prediluidos GPA ELISA Positivo Débil, GPA ELISA Positivo Fuerte, ELISANegativo y las muestras prediluidas a los pocillos. Cubrir los pocillos e incubar 30 minutos a temperaturaambiente en una superficie plana . El tiempo de incubación empieza después de la adición de la últimamuestra.3. Lavado: Aspirar el contenido de cada pocillo. Agregar 200-300µl de solución de lavado a todos pocillos yaspirar. Repetir esta secuencia dos veces más para un total de tres lavados. Invertir la placa y golpearlasuavemente en material absorbente para eliminar cualquier fluido residual tras el último lavado. Esimportante que cada pocillo esté completamente vacío después de cada paso de lavado. Mantener lamisma secuencia para la aspiración que la usada para la adición de muestras.4. Agregar 100µl de Conjugado HRP IgG a cada pocillo. El conjugado debe pipetearse en las condicionesmás asépticas posibles y siguiendo buenas técnicas de laboratorio. Aspirar solamente la cantidad deconjugado necesaria para el ensayo. PARA EVITAR CUALQUIER CONTAMINACIÓN POTENCIALMICROBIANA Y/O QUÍMICA, NUNCA DEVOLVER EL CONJUGADO SIN USAR A SU RECIPIENTEORIGINAL. Incubar los pocillos 30 minutos como en el paso 2.5. Lavado: Repetir el paso 3.6. Agregar 100µl de Cromógeno TMB a cada pocillo e incubar 30 minutos en oscuridad a temperaturaambiente.7. Agregar 100µl de Solución de parada a cada pocillo. Mantener la misma secuencia y temporalización quela efectuada en la adición de Cromógeno. Agitar suavemente la placa para mezclar bien los pocillos.8. Leer la absorbancia (DO) de cada pocillo a 450nm en un plazo máximo de una hora. Si se desea seguir elmétodo de lectura bicromática puede utilizarse 620 nm como longitud de onda de referencia.Control de Calidad1. Los controles GPA ELISA Positivo Débil, GPA ELISA Positivo Fuerte y Control Negativo ELISA debenprocesarse con cada lote de muestras para asegurar que todos reactivos y procedimientos funcionancorrectamente.2. El usuario debe notar que debido a que los controles GPA ELISA Positivo Débil, GPA ELISA PositivoFuerte y ELISA Negativo son prediluidos, no controlan procedimientos asociados con dilución deespecímenes.3. Pueden añadirse controles adicionales según las directivas o requisitos del laboratorio. Puedenprepararse controles válidos haciendo alícuotas de un “pool” de suero humano que debe almacenarse a

a. La absorbancia del control GPA Positivo debe ser superior a la del control GPA positivo débil y lade este debe ser superior a la del control negativo.b. El control GPA positivo fuerte debe tener una absorbancia mayor que 1.0 mientras que la delcontrol negativo no debe exceder de 0.2.c. La absorbancia del control GPA positivo débil debe ser superior al doble del control negativo, uoscilar entre 0.25.d. Los controles ELISA negativo y GPA positivo fuerte están pensados para monitorizar problemasde reactivo de magnitud substancial. El control GPA positivo fuerte no puede asegurar precisiónalguna en el punto de corte del ensayo.e. El usuario puede referirse al documento NCCLS (National Committee of Clinical LaboratoryStandards) C24-A para una guía adicional acerca de buenas prácticas de laboratorio. 17Cálculo de ResultadosDebe determinarse en primer lugar el promedio de densidades ópticas de cada juego de duplicados. Lareactividad para cada muestra se calcula dividiendo la densidad óptica promedio de la muestra por la densidadóptica promedio del control GPA positivo débil.DO MuestraValor de la Muestra = —————————————————— x Valor ELISA Positivo Débil(unidades) DO ELISA Positivo Débil (unidades)La reactividad de la muestra está relacionada de manera no lineal con la cantidad de anticuerpo presente.Mientras que los aumentos y disminuciones en la concentración de anticuerpos del paciente se reflejarán en elaumento o disminución correspondiente de la reactividad, los cambios no son proporcionales (por ejemplo, aldoblarse la concentración de anticuerpo no se dobla la reactividad). Si se deseara una cuantificación más precisade la cantidad de anticuerpo, puede informarse como el título de anticuerpo de la muestra la última diluciónpositiva de una serie de diluciones seriadas de la muestra.Interpretación de los ResultadosLa técnica ELISA es muy sensible y es capaz de detectar pequeñas diferencias entre poblaciones de pacientes.Los valores presentados a continuación son sólo valores sugeridos. Cada laboratorio debe establecer su propiorango normal basado en su propia metodología, controles, equipo y población de pacientes.La muestra puede clasificarse con un valor negativo, equívocos o positivos (anticuerpos ATPasa H+/K+ de claseIgG detectados)según la tabla siguiente.UnidadesNegativo 0.0 – 20.0Equívoco 20.1 – 24.9Positivo > 25Las muestras calificadas como equivocas deben ser analizadas de nuevo antes de informarlas.1. Un resultado positivo indica la presencia de anticuerpos anti-ATPasa H+/K+ y sugiere laposibilidad de anemia perniciosa o enfermedades relacionadas.2. Un resultado negativo indica la ausencia de anticuerpos anti-GPA o niveles inferiores al punto decorte del ensayo.3. Las muestras con niveles equívocos de anticuerpos anti-GPA no pueden evaluarse para saber elestado de los anticuerpos. Si los resultados siguen siendo equívocos después de repetir el test,deberán considerarse equívocos y/o deberá tomarse otra muestra.4. Se sugiere que los resultados informados por el laboratorio incluyan la afirmación “Los siguientesresultados se obtuvieron con el kit INOVA QUANTA Lite TM GPA ELISA. Los valores obtenidoscon kits de diferentes fabricantes pueden variar y no pueden intercambiarse entre ellos. Lamagnitud de los niveles informados de IgG no puede correlacionarse con un punto final”.Limitaciones del Procedimiento1. La presencia de inmunocomplejos u otros agregados de inmunoglobulinas en la muestra del pacientepuede producir un aumento de uniones inespecíficas y causar falsos positivos en este ensayo.2. Un resultado negativo para anticuerpos anticélula parietal gástrica no descarta la presencia de anemiaperniciosa.3. Un resultado negativo para anticuerpos anti-GPA no descarta la presencia de anticuerpos anti-GPA,puesto que la concentración de anticuerpos puede estar por debajo del límite de detección del ensayo.4. Un resultado positivo sólo indica la presencia de anticuerpos anti-ATPasa H+/K+ y no indicanecesariamente la presencia de enfermedades autoinmunes o de otro tipo.5. El rendimiento de este ensayo no ha sido aún establecida para pacientes pediátricos.6. Los resultados de este ensayo deben utilizarse conjuntamente con hallazgos clínicos y otras pruebasserológicas.7. La funcionalidad del ensayo no ha sido establecida para matrices diferentes del suero.Valores EsperadosLa capacidad de QUANTA Lite TM GPA ELISA para detectar anticuerpos anti-ATPasa H+/K+ se evaluó encomparación con una prueba de ELISA ATPasa H+/K+ disponible en el mercado. También se realizó unacomparación de los resultados obtenidos mediante el ensayo QUANTA Lite TM GPA ELISA y el deinmunofluorescencia indirecta utilizando secciones de tejido renal/gástrico de ratón.La incidencia de anticuerpos anti-GPA en la población normal crece con la edad desde aproximadamente un2.5%, entre los 30 y 40 años de edad, hasta el 9.6% a partir de los ochenta. La frecuencia con que se detectananticuerpos anti-GPA es normalmente más alta en las mujeres que en los hombres. En el grupo de hombresmenores de 55 años, un 5.5% dieron positivo para anticuerpos anti-GPA, en comparación con un 14.7% de4

mujeres pertenecientes al mismo grupo. En el grupo de sujetos mayores de 55 años, un 9.2% de hombres y un22.3% de mujeres presentaban anticuerpos anti-GPA. 4Rango NormalUn grupo de 210 muestras combinadas de sujetos asintomáticos y sanos fue sometido a test con el kit QUANTALite TM GPA ELISA. Sus edades variaban entre los 17y 77 años (promedio=32). De las 210 muestras, 154 (73.3%)procedían de hombres y 56 (26.7%) de mujeres. El valor medio fue de 7.3 unidades, con un margen de entre 1.3y 84.1 unidades. Dos de las 7 muestras GPA positivas también dieron positivo con el ensayo deinmunofluorescencia indirecta. Excluyendo 4 resultados equívocos, la especificidad fue del 96.6% (199/206).Sensibilidad y Especificidad RelativasEn la Tabla 1 se muestran los resultados de las pruebas realizadas con 20 muestras de pacientes con anemiaperniciosa mediante el kit QUANTA Lite TM GPA ELISA y otro kit GPA ELISA probado. La Tabla 2 muestra lacomparación de los resultados obtenidos mediante inmunofluorescencia indirecta con muestras de tejidorenal/gástrico de ratón. La Tabla 3 muestra los resultados comparativos del kit QUANTA Lite TM GPA ELISA y delkit GPA ELISA probado sobre un grupo de 41 muestras.Tabla 1: QUANTA Lite TM GPA (Gastric Parietal Antibody) y Predicate GPA ELISA resultados de las pruebasrealizadas de pacientes con anemia perniciosa.Kit GPA ELISARESULTADOS QUANTA Lite TM GPA ELISAprobado N=20 Pos (15) EQ (0) Neg (5)Positivos Pos (14) 14 0 0Equívocos EQ (5) 1 0 4Negativos Neg (1) 0 0 1Concordancia clínica (excluyendo los resultados equívocos): 100% (15/15)Tabla 2: Resultados de los ensayos QUANTA Lite TM GPA ELISA y ANA (muestras de riñón/estómago de ratón)por inmunofluorescencia indirecta para la detección de pacientes con anemia perniciosaGPARESULTADOS QUANTA Lite TM GPA ELISAinmunofluorescencia indirecta N= 20 Pos (15) EQ (0) Neg (5)Positivos Pos (15) 15 0 0Equívocos EQ (0) 0 0 0Negativos Neg (5) 0 0 5Concordancia clínica: 100% (20/20)Tabla 3: Resultados de los ensayos QUANTA Lite TM GPA (Anticuerpos anticélula parietal gástrica) y GPA ELISAaprobado para las muestras sometidas a test de anticuerpos anti-GPAKit GPA ELISARESULTADOS QUANTA Lite TM GPA ELISAprobado N=41 Pos (19) EQ (2) Neg (20)Positivos Pos (22) 17 2 3Equívocos EQ (0) 0 0 0Negativos Neg (19) 2 0 17Concordancia clínica (excluyendo los resultados equívocos): 89.7% (35/39)Estudio de la reactividad cruzadaSe sometieron a test muestras de suero de pacientes con anticuerpos de enfermedades autoinmunes oinfecciosas o con diversas afecciones clínicas, incluyendo H. pylori (7), peroxidasa tiroidea (5), tiroides M (5),tiroides T (4), beta-2 glicoproteína (5), LKM-1 (5), hepatitis autoinmune, tipo1 (14) o mitocondrias M2 (4), enbusca de interacciones con el ensayo QUANTA Lite TM GPA ELISA. Una muestra con H. pylori y 2 con peroxidasatiroidea dieron positivo con el ensayo QUANTA Lite TM GPA ELISA. Estas 3 muestras también dieron positivo paraanticuerpos anti-GPA con inmunofluorescencia indirecta.Precisión y ReproducibilidadEl rendimiento intra-ensayo para el método QUANTA Lite TM GPA ELISA se evaluó sometiendo a prueba 6muestras un total de 9 veces cada una. Los resultados, que se resumen en la Tabla 4, muestran la precisiónintra-ensayo.Tabla 4: Rendimiento intra-ensayo para el método QUANTA Lite TM GPA ELISAMuestra A Muestra B Muestra C Muestra D Muestra E Muestra FUnidades medias 40.7 93.4 35.4 58.3 47.0 10.5Desv. Est. 2.3 5.7 3.2 5.4 5.1 0.7CV % 5.6 6.1 9.0 9.2 10.8 6.9Se evaluó el rendimiento entre ensayos testando por duplicado un conjunto de 5 muestras, dos veces durante 3días.Tabla 5: Rendimiento entre ensayos para el método QUANTA Lite TM GPA ELISAMuestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5Unidades medias 32.7 95.2 11.4 32.9 5.9Desv. Est. 1.61 2.25 0.37 1.77 0.42CV % 4.9 2.4 3.2 5.4 7.15

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