NOVA Lite HEp-2 External EB Kits - inova

NOVA Lite ® HEp-2 External EB KitsPara Diagnóstico In VitroCódigo de Producto: 704230, 704235Complejidad de CLIA: AltoAplicaciónEste producto (kit o portaobjetos) es para el uso en el screening y titulación de autoanticuerposantinucleares mediante test de inmunofluorescencia. Debe utilizarse como apoyo en el diagnóstico ytratamiento de lupus sistemático eritematoso (SLE), síndrome de Sjögren, artritis reumatoide y otrasenfermedades del tejido conjuntivo.Sumario y Explicación de la pruebaEl anticuerpo antinuclear (ANA) es un término que describe una gran variedad de auto-anticuerposcontra componentes del núcleo celular, como p.ej. DNA, RNA y otras proteínas nucleicas 1 . Estos ANAse encuentran con elevada frecuencia en pacientes con enfermedades del tejido conjuntivo oreumáticas, particularmente en el lupus sistemático eritematoso (SLE). Existe una correlación grande deANA positivo con SLE y la ausencia de ANA descarta esencialmente la enfermedad 2 . No obstante,pacientes con otras enfermedades de tejido conjuntivo tales como artritis reumatóide, esclerodermia ydermatomiositis presentan a menudo ANA positivo. También se han encontrado títulos bajos de ANA enotras enfermedades o en personas mayores sanas.El método de inmunofluorescencia indirecto es el mejor método de determinación para el screening deANA circulantes. Se recomienda que todas las muestras de ANA positivas sean tituladas hasta el puntofinal y sean investigadas a autoanticuerpos contra DNA de doble filamento (dsDNA) y antígenos denúcleo extraibles (ENA).En el pasado, para la determinación de ANA se empleaba secciones del hígado de rata congelado pero,esto ha sido ya reemplazado por diferentes tipos de líneas celulares. Las células HEp-2 3 constituyenuna línea celular epitelial y están caracterizadas por un núcleo extremadamente grande comparado conotras líneas celulares. Con la utilización de células HEp-2 en el screening se pueden observar tresventajas diferenciales: 1. El substrato antigénico está estandarizado, por lo que existe una muy bajavariabilidad entre lote y lote contrariamente que con el tejido de roedor. 2. Las células HEp-2 son másgrandes que las del tejido de rata, permitiendo así una mejor visualización de la morfología de la célula ypor tanto un aumento de la sensibilidad del test. 3. La mayoría de células HEp-2 se dividen activamente,exponiendo así antígenos que normalmente no se manifiestan en las células del tejido de rata 3 .Procedimiento de trabajoEl test se basa en la inmunofluorescencia indirecta 4 . Tanto las muestras de los pacientes como loscontroles correspondientes se incuban con células HEp-2, mediante lavado se eliminan los anticuerposque no han reaccionado y después se aplica el conjugado de fluorescencia. El conjugado sobrante seelimina por medio del proceso de lavado. Los portaobjetos son examinados bajo un microscopio defluorescencia dando las muestras positivas una fluorescencia de verde manzana en las áreas de uniónentre las células HEp-2 y los anticuerpos.Reactivos1. Portaobjetos con substrato HEp-2 ANA en 6 o 12 portaobjetos/pocillos2. Suero de control positivo (patrón homogéneo, intensidad de coloración 3+), conteniendo azidasódica 0,09%. Listo para el empleo.3. Suero de control positivo (patrón centómero, intensidad de coloración 3+), conteniendo azidasódica 0,09%. Listo para el empleo.4. Suero de control negativo (negativo universalmente para todos los auto-anticuerpos),conteniendo azida sódica 0,09%. Listo para el empleo.5. FITC-IgG (H+L) conjugado de fluoresceína, conteniendo azida sódica 0,09%. Listo para elempleo.6. Azul de Evans 1%, como color de contraste opcional.7. Tampón PBS II, suministrado en forma liquida concentrado 40 veces, debe diluirse antes delempleo.8. Medio de montaje, conteniendo un agente anti-“fading”9. Cubreobjetos.1

Advertencias/ PrecaucionesEste producto (kit) es para ser usado en el Diagnóstico In Vitro.Esta prueba solo deberá efectuarse parael propósito indicado y por personal de laboratorio adecuadamente instruido. El material de partida parala elaboración de los calibradores y controles proviene de sangre humana (sólo los kits). Cada una delas muestras han sido examinadas y libres de anticuerpos del virus del Síndrome de InmunodeficienciaHumana (HIV 1 & 2), Hepatitis C así como antígenos superficiales de Hepatitis B (HBsAG). No obstante,hasta la fecha no existen métodos seguros para la exclusión de estos agentes infecciosos ni de otros.Por lo tanto, deben tratarse los reactivos como potencialmente infecciosos. Tanto la manipulación comolos métodos de eliminación de desechos deberán realizarse conforme a la normativa de materialesinfecciosos y solo personal adecuadamente instruido deberá efectuar el test. Algunos kits contienen deazida sódica 0,09% y deben tratarse según las medidas de seguridad correspondientes. Debe evitarsetanto la ingesta como el contacto con la piel y las mucosas. En caso de contacto, aclarar con abundanteagua y consultar a un médico. La azida sódica puede formar azidas metálicas explosivas en contactoprolongado con tubos de plomo o cobre. Tras la eliminación aclarar con gran cantidad de agua con el finde evitar depósitos de azida.Condiciones de AlmacenajeEl kit sin estrenar es estable hasta la fecha de caducidad indicada en el envase almacenándolo entre 2 y8ºC. ¡NO CONGELAR! Tras la extracción de los portaobjetos de su envase deberán ser empleadosinmediatamente. El tampón PBS II diluido es estable hasta 4 semanas a una temperatura entre 2 y 8ºC.El conjugado de fluoresceína debe mantenerse, en la medida de lo posible, al resguardo de la luz solar,fluorescente o ultraviolada. Todos los reactivos deben almacenarse entre 2 y 8ºC.Recolección de MuestrasLas muestras de suero se deben recolectar mediante extracción intravenosa y dejar coagular de formanatural. Separar rápidamente el suero del coagulo con el fin de evitar hemólisis. El suero puedeconservarse a 2-8°C durante un máximo de 7 días antes del ensayo 11 , o para periodos más largos,distribuir el suero en alícuotas y conservarlo a -20°C, o temperatura inferior. Evitar repetidascongelaciones y descongelaciones. No utilizar muestras de suero contaminado microbiológicamente ocon partículas, ni tampoco sueros hemolíticos o lipémicos ya que puede darse un título inferior opatrones de fluorescencia poco claros.ProcedimientoMateriales Suministrados70423010 HEp-2 ANA Substrate slide (6-well) (Portaobjetos con substrato HEp-2 ANA, 6 pocillos)1 1mL Homo. Ptn. (use w/Conj. 504070 or 504088) (ANA control positivo, Homo. Ptn. (Su oso conConj. 504070 o 504088), prediluido)1 1mL Centromere Positive Control (control positivo, centrómero, prediluido)1 1mL IFA System Negative Control (Control negativo, prediluido)1 7mL FITC IgG (H+L) HEp Conjugate (fluorescein) (Conjugado FITC IgG (H&L) HEp defluoresceína)1 3mL 1% Evans Blue Counterstain (Azul de Evans 1%)2 25mL PBS II Buffer (x40 conc.) (Tampón PBS II, concentración x40)1 3mL PVA Mounting Medium (Medio de montaje)1 10 Coverslips (Cubreobjetos)70423520 HEp-2 ANA Substrate slide (12-well) (Portaobjetos con substrato HEp-2 ANA, 12 pocillos)1 1mL Homo. Ptn. (use w/Conj. 504070 or 504088) (ANA control positivo, Homo. Ptn. (Su oso conConj. 504070 o 504088), prediluido)1 1mL Centromere Positive Control (control positivo, centrómero, prediluido)1 1mL IFA System Negative Control (Control negativo, prediluido)1 15mL FITC IgG (H+L) HEp Conjugate (Conjugado FITC IgG humanas (H&L) de fluoresceína)1 10mL 1% Evans Blue Counterstain (Azul de Evans 1%)2 25mL PBS II Buffer (x40 conc.) (Tampón PBS II, concentración x40)1 10mL PVA Mounting Medium (Medio de montaje)1 20 Coverslips (Cubreobjetos)Material Necesario No Incluido1. Agua destilada o desionizada para diluir el concentrado de PBS II y para humidificar las tiras depapel impregnadas con el conjugado.2. Recipientes y botella de plástico para el tampón PBS II.3. Pipetas y tubos de reacción desechables.4. Cámara húmeda para los pasos de incubación5. Microscopio de campo oscuro con filtros para una longitud de onda de excitación de 450nm yemisión de 515nm.2

En caso de utilizar sólo portaobjetos con substrato, deberá adquirirse de INOVA el siguiente material:controles positivos p.ej. Homo. Ptn. (Su oso con Conj. 504070 o 504088) (504090), centrómero(508184), control negativo (508186), conjugado anti-IgG humanas (H&L) FITC (504088, 504070),purificado por afinidad o (504032) (diluir 1/50-1/200 para emplear), PBS II (508998), Azul de Evans(504049), medio de montaje (504046, 504047) y cubreobjetos.Procedimiento de EnsayoControl de CalidadCada vez que se realice una serie de analisis deberán usarse controles positivo y negativo.1. Medio de montaje: Antes de su empleo, sacar el medio de montaje de la nevera y dejar quellegue a temperatura ambiente (18-28ºC) por sí solo.2. Preparación PBS II concentrado. Diluir el PBS II concentrado con agua destilada o desionizada(1 parte PBS II + 39 partes de agua destilada o desionizada) y mezclar. Nota: Preparar latotalidad del kit, solo si va a utilizarse en un plazo de un mes a partir de la fecha de lapreparación. El PBS II se emplea para la dilución de las muestras de suero y como tampón.3. Dilución muestras de pacientes.Screening: Diluir muestras de pacientes 1/40 (p.ej. 25µL de suero + 975µL de tampón PBS II).Titulación: Hacer diluciones en serie de las muestras positivas examinadas por screening con(p.ej. 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 y 1/640 etc.). Ejemplo: Tomar 500µL de la dilución 1/40 y mezclarcon 500µL de PBS II para obtener una dilución de 1/80 y así sucesivamente.4. Preparación de los portaobjetos. Sacar los portaobjetos de la nevera aproximadamente 30minutos antes de su empleo para que alcancen la temperatura ambiente (18-28ºC). ¡Abrir elembalaje, solo antes de su utilización inmediata! Manipular con cuidado los portaobjetos con elfin de evitar daños en el substrato. Colocar los portaobjetos correspondientemente marcados enla cámara húmeda y colocar una gota de los controles positivos en 2 pocillos, una gota de controlnegativo en otro y en los restantes 25µL de cada muestra de los pacientes.5. Incubación de los portaobjetos. Incubar los portaobjetos durante 30 minutos a temperaturaambiente (18-28ºC). (Unas toallitas de papel humedecidas en la base de la cámara mantendránla humedad.)6. Lavado con PBS II. Extraer el/los portaobjetos de la cámara húmeda y aclarar con cuidado con elfrasco lavador. ¡No dirigir el chorro directamente a los pocillos! Coloque los portaobjetos en unfrasco Coplin de PBS II diluido o en una gradilla sumergida en PBS II durante 5 minutos comomáximo.7. Adición del conjugado fluorescente. Sacudir el exceso de PBS II y volver a introducir losportaobjetos inmediatamente en la cámara húmeda. NO DEJAR LOS POCILLOS SIN TAPARMAS DE 15 SEGUNDOS. SI SE LLEGARA A SECAR EL SUBSTRATO, LOS RESULTADOS SEVERÍAN SERIAMENTE AFECTADOS.8. Incubación de los portaobjetos. Incubar los portaobjetos durante 30 minutos en la cámarahúmeda a temperatura ambiente (18-28ºC) y a oscuras.9. Lavado con PBS II. Lavar otra vez tal y como se describe en el paso 6. Color de contrasteopcional: añadir 2-3 gotas de Azul de Evans 1% por 100mL de PBS II antes del lavado.10. Colocación del cubreobjetos. Sacar de uno en uno los portaobjetos del PBS II. Secarrápidamente alrededor de los pocillos y añadir una gota del medio de montaje a cada pocillo.Cubrir con cuidado el portaobjetos con el cubreobjetos evitando la formación de burbujas. ¡Encaso de formarse burbujas, no intente quitarlas!11. Visión de los portaobjetos bajo el microscopio de fluorescencia. Los portaobjetos deberánvisionarse lo más pronto posible, pero pueden guardarse a una temperatura de 2-8ºC durante 1semana sin pérdida significativa de fluorescencia.Control de CalidadCon cada prueba realizar simultáneamente un control positivo y negativo. El control positivo homogéneodeberá dar un brillo verde manzana de 3+ en el núcleo de la célula. El control positivo centrómerodeberá dar un brillo de 3+ de patrón moteado discreto (generalmente en múltiplos de 46). El controlnegativo deberá dar una coloración verde sin brillo en todas las células HEp-2 sin llegar a percibirsefluorescencia. En caso de no asemejarse los controles a lo antes descrito, el test no es valido y deberárepetirse. Nota: En caso de emplear Azul de Evans como color de contraste, la muestra negativa deberádar un color rojo-naranja sin brillo. En la muestra positiva el núcleo brillará verde manzana y las áreascelulares no coloreadas serán de un color rojo apagado.Interpretación de los ResultadosNegativoUna muestra se considera negativa si la coloración del núcleo es igual o menor al control negativoPositivoUna muestra es positiva si la coloración del núcleo es mayor al control negativo y se perciba claramenteun patrón. Los controles del kit tienen por regla general una intensidad de 3+. Pueden encontrarse unagran variedad de patrones en relación con la cantidad y clases de autoanticuerpos. En el siguientecuadro se pueden identificar los patrones descritos.3

PATRON DEFLUORESCENCIAHomogéneoMoteadoNucleolarCentrómeroMitocondrialJo-1DESCRIPCIÓNColoración fuerte delnúcleo de la célula (Scl-70puede presentar unaspecto moteado)Motas finas o toscas:generalmente sincoloración de los núcleosManchas grandes y toscas(generalmente menos de 6manchas por núcleo, con osin patrón moteado fino)Manchas discretas(generalmente múltiplo de46)Coloración moteadatoscamente de filamentocitoplasmático alrededordel núcleo y de todo elcitoplasmaColoración fina moteadaconcentrada alrededor delnúcleoANTIGENOSNUCLEARESdsDNAssDNAHistonasScl-70SS-ASS-BSmRNP y otrosPm-SclNucleolinKuy otros antígenosnucleolares desconocidosENFERMEDADESASOCIADASTítulos altos: SLETítulos bajos: SLE u otrasenfermedades del tejidoconjuntivo 5Títulos altos:SLESíndrome de SjögrencomplejosiccaEnfermedad del tejido conjuntivomixtoEsclerodermaTítulos bajos:otras enfermedades de tejidoconjuntivoTítulos altos:Scleroderma & síndrome deSjögren 6Centrómeros cromosomales Síndrome de CREST 7M2 9,10Jo-1(histidil-tRNA sintetasa)Cirrosis biliar primaria (común)Escleroderma(40%) y algunas veces ensíndromes solapadosPolimiositis, dermatomiosítisasociada con enfermedadpulmonar intersticialLimitaciones del Procedimiento1. Un título alto de ANA sugiere con gran probabilidad una enfermedad del tejido conjuntivo, peroantes de hacer un diagnóstico, se deberá tener en cuenta el historial clínico y otros resultados deanálisis serologicos del paciente.2. Un pequeño porcentaje de pacientes con SLE pueden dar ANA negativo porinmunofluorescencia indirecta, pero positivo con otros métodos. 83. Pacientes con SLE inducido por fármacos suelen dar ANA positivos homogéneos o periféricos.Contrariamente, pacientes sujetos a terapia con esteroides suelen dar con otros métodos ANAnegativos 8 .4. En una muestra de paciente pueden haber diferentes autoanticuerpos. Por medio de dilucionesdel suero se puede alcanzar una diferenciación de los distintos patrones. De modo parecido, contítulos muy elevados puede darse un efecto prozona el cual puede enmascarar el título real.Todas las muestras sospechosas o con títulos aparentemente bajos deberán diluirse más veces.5. La sensibilidad de la prueba está influida por la fuente de luz, filtros así como la óptica de lasdistintas marcas de microscopios de fluorescencia. El buen funcionamiento del microscopio estásignificativamente influido por un correcto mantenimiento, centrándose especialmente en lalámpara de mercurio y el cambio de la lámpara después del tiempo recomendado.6. Un nivel bajo de ANA se puede notar en pacientes que tienen condiciones clínicas diferentes delas enfermedades reumáticas y del tejido conectivo. En individuos normales, la incidencia deresultados positivos de ANA aumenta con la edad.7. Al interpretar las estructuras, se deberá tener siempre en cuenta la posible presencia de más deun autoanticuerpo. La combinación de varios autoanticuerpos pueden influir en el patrónhomogéneo o moteado. Se recomienda, por lo tanto, que todas las muestras con patroneshomogéneos de fluorescencia sean analizadas a dsDNA así como ENA.8. Aunque generalmente para el screening se utiliza una dilución del suero del paciente de 1/40, esposible que algunas veces, a diluciones bajas de la muestra, se pueda ver un nivel bajo decoloración no específica de los núcleos.9. Este test de ANA no es suficiente para un diagnóstico por sí solo, sino que debe utilizarse comoun medio más. Debe tenerse en cuenta el cuadro clínico así como otros análisis.Los portaobjetos comercializados por separado se clasifican como “reactivos específicos para losanalitos”.Salvo que se trate de componentes del kit, las características analíticas y de rendimiento no estánestablecidas.4

Características de RendimientoPrecisiónEl control de calidad de cada lote se basa en ensayos múltiples de los portaobjetos, con el uso de unamuestra control conocida diluida hasta el punto final. Cada lote da, al punto final, un títulopredeterminado, demostrando que no hay diferencias significativas en el rendimiento de los portaobjetosdel mismo lote o de distintos lotes.SensibilidadLa sensibilidad de los tests y el límite de detección dependen del microscopio utilizado. No hay uncalibrador internacional disponible para poder estandarizarlo.EspecificidadSe ensayó un grupo de más de 50 muestras clínicas con diversas especifidades, incluídas 10 muestrasnegativas, con el uso del kit HEp-2 de The Binding Site y un kit HEp-2 equivalente comercialmentedisponible. El rendimiento del kit The Binding Site fue comparable a aquello del kit equivalente entérminos de especificidad e intensidad.Resumen del procedimiento1. Dejar que el medio de montaje alcance la temperatura ambiente.2. Diluir 1/40 el tampón PBS II con agua destilada o desionizada.3. Diluir 1/40 las muestras de suero con PBS II.4. Extraer los portaobjetos del refrigerador y dejar que alcancen la temperatura ambiente (18-28°C).5. Sacar los portaobjetos del envase y colocarlos en la cámara húmeda. Aplicar 25µL de cadacontrol y de suero. Incubar a temperatura ambiente (18-28°C) durante 30 minutos.6. Lavar los portaobjetos con PBS II: primero con el frasco lavador y después sumergiendo losportaobjetos en la bandeja de o cubeta de coplin coloración durante 5 minutos.7. Volver a colocar en la cámara húmeda, dispensar el conjugado fluorescente.8. Incubar otros 30 minutos.9. Lavar otra vez según descripción en el punto 6.10. Extraer los portaobjetos, poner medio de montaje sobre cada pocillo y cubrir con loscubreobjetos.11. Evaluar los portaobjetos bajo el microscopio de fluorescencia.5

Referencias1. Tan, E.M. (1982): Autoantibodies to nuclear antigens: Their immunobiology and medicine.Advances in Immunology. 33: 167-23.2. Tan, E.M. et al (1982): The 1982 revised criteria for classification of systemic lupuserythematosus. Arth and rheum. 25: 1271-1277.3. Miyachi, K., Fritzler, M.J., Tan, E.M. (1978): Autoantibody to nuclear antigen in proliferating cells.J. Immunol. 121: 2228-2234.4. Weller, T.H., Coons, A.H. (1954): Fluorescent antibody studies with agent of Varicella and HerpesZoster propagated in vitro: Prov. Soc. Exp. Biol. Med. 86: 789-794.5. Notman, D.D., Kurata, N., Tan, E.M. (1975): Profiles of antinuclear antibodies in systemicrheumatic diseases. Ann. Int. Med. 83: 464-469.6. Ritchie, R.F. (1970): Antinuclear antibodies. Their frequency and diagnostic application. N. Enr. J.Med. 282: 1174-1178.7. Tan, E.M., Rodman, G.P., Garcia, I. (1980) et al: Diversity of antinuclear antibodies in progressivesystemic sclerosis. Arthritis Rheum. 23: 617-625.8. Gladman, D.D., Chalmers, A., Urowitz, M.B. (1978): Systemic lupus erythematosus with negativeLE cells and anitnuclear factors. J. Rheum.: 142-147.9. MacKay, I.R., Gershwin, M.E. (1989): Molecular basis of mitochondrial autoreactivity in primarybiliary cirrhosis. Immunol.Today: 10: 9: 315-318.10. Laung, P.S.C., MacKay, I., Gershwin, M.E. (1994): Mitochondrial autoantigens. Man Biol. Mark;B8.1,1-14. Eds W.J.Van Venrooij and R.N. Maini. Kluwer Academic Pubs. Netherlands.11. Protein Refence Unit Handbook of Autoimmunity (3 rd Edition) 2004. Ed A Milford Ward. JSheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14.Fabricante:INOVA Diagnostics, Inc.9900 Old Grove RoadSan Diego, CA 92131United States of AmericaTechnical Service (U.S. & Canada Only) : 877-829-4745Technical Service (Outside the U.S.) : 1 858-805-7950support@inovadx.comRepresentante Autorizado:Medical Technology Promedt Consulting GmbHAltenhofstrasse 80D-66386 St. Ingbert, GermanyTel.: +49-6894-581020Fax.: +49-6894-581021www.mt-procons.com624230ESP Rev. 5January 2014NOVA Lite e INOVA Diagnostics, Inc., son marcas comerciales registradas. Copyright 2013 © Todos los derechosreservados6