Tema 7. TECNICAS BASICAS DE BM.pdf - VeoApuntes.com

Alberto Gómez Esteban & Laura del OlmoLa fluorescencia producida por el SYBR Green será máxima al final de laelongación, y será cuando vamos a medirla.II.Sondas específicas: FRET y TaqManSon específicas de la secuencia (al contrario que los intercalantes). Pueden ser de 5 tipospero las 2 que más se emplean son las siguientes:- Sondas FRETAprovechan la tecnología FRET, que es un análisis de trasferencia de energías resonantesfluorescentes.Para cada punto polimórfico que queramos estudiar vamos a necesitar 2 sondas: Una va marcada con un fluoróforo donante. La otra con un fluoróforo aceptor/receptor.Las sondas van a hibridar complementariamente en la secuencia de DNA (si encuentrancomplementariedad) y si hibridan las 2 van a quedar situadas muy próximas la una de laotra, a una distancia entre 1-5 Nt o 1-5 pb. Si esto sucede el fluoróforo donante excita alfluoróforo aceptor y en este momento (en el que las sondas han quedado próximas entre sí)se produce un cambio en la longitud de onda de la fluorescencia que está recibiendo nuestroaparato detector. El cambio en la longitud de onda nos indica que las sondas han hibridado ensu sitio correcto.- Sondas TaqMan de hidrólisis Extremo 3´ de la sonda: tiene un fluoróforo. Extremo 5´ de la sonda: tiene un bloqueante de la fluorescencia llamado “quencher”.En la etapa de anillamiento de la hibridación se hibridan tanto cebadores como las sondas,que están diseñadas para hibridar en la mitad de la sonda. Cuando llega la polimerasacomienza a elongar el producto y se topa con el “quencher” de la sonda TaqMan, el cuallibera (hidroliza), y en este momento se produce el desbloqueo de la fluorescencia queentonces podrá empezar a ser recogida.11