Tema 7. TECNICAS BASICAS DE BM.pdf - VeoApuntes.com

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Alberto Gómez Esteban & Laura del OlmoLas enzimas de restricción más conocidas son:Hae IIIBam HIEco RILos nombres de la enzima designan a la bacteria de la que proviene, y los números, el tipo deenzima o la cepa.• Clínica del fingerprintingHay enfermedades que identificamos utilizando digestión enzimática ya que son ocasionadaspor un cambio puntual en un nucleótido:‣ Hemofilia A (factor VIII). El alelo normal tiene una secuencia TCGA pero elalterado lo cambia por un TTGA. El cambio en este alelo produce que la enzima Taq Ino reconozca su diana.La hemofilia A ocasiona el defecto en el factor VIII de la coagulación, lo que impide lacorrecta hemostasia (hemorragias frecuentes). La información para el factor VIII seencuentra en el cromosoma X, lo que ocasiona que los hombres sean más proclives aesta patología ya que solo tendrán una copia de ese gen específico, con lo que siheredan un cromosoma con un gen dañado del factor VIII, es el único gen que recibeny no tienen información de respaldo, por lo que no podrán producir ese factor decoagulación.‣ Anemia falciforme. La hemoglobina está formada por cadenas y cadenas . Laanemia se produce por la mutación del gen de la -globina que se encuentra en elcromosoma 11 lo que produce un cambio de aminoácido que conlleva la perdida de ladiana para la enzima Mst I.La mutación del gen de la -globina da lugar a la hemoglobina S que produce daño enel eritrocito cambiando su forma de disco por forma de hoz, lo que provoca queademás de tener fallo en el transporte de oxígeno se queden atascados en loscapilares.La selección natural tiende a eliminar la prevalencia del alelo S, sin embargo enregiones endémicas de malaria, personas con el alelo funcional son afectados demalaria, sin embargo los heterocigotos para el alelo S se ven ligeramente afectadospor la anemia, pero tienen resistencia a la malaria, por ello hay una prevalencia altade esta enfermedad.4
Alberto Gómez Esteban & Laura del OlmoTécnicas de BM aplicadas al diagnóstico1) REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)Técnica mediante la cual se puede obtener un diagnóstico directo.La PCR (Polymerase Chain Reaction) se trata de una técnica descubierta en 1983 por KaryMullis, cuyo objetivo es amplificar un fragmento del genoma que deseamos estudiar. Permitela replicación in Vitro de DNA y cDNA (DNA copia).La reacción de PCR requiere una serie de reactivos indispensables:- DNA molde suficientemente puro y en cantidad (pequeña) suficiente.- Enzima bacteriana (Taq Polimerasa). Está aislada de una bacteria termorresistente loque permite llevar a cabo las reacciones a altas temperaturas sin degradarse.- Desoxinucleótidos. Son los 4 nucleótidos necesarios para formar la cadena de DNA.Permiten ciertas modificaciones de marcaje como la unión de digoxina, biotina ofluoróforos.- Solución tampón. Contiene sales que mantienen el pH y la fuerza iónica del medio.- Mg 2+ . Es el cofactor de la Taq Polimerasa.- Cebadores. Los necesitamos para delimitar la región de todo el genoma que nosotrosqueremos amplificar. Necesitamos 2, uno que delimite la secuencia por arriba y otropor abajo. Los cebadores son oligonucleótidos de DNA que tienen un tamaño variable(18-25 pb).- Agua libre de enzimas nucleasas.Consta de tres etapas:1. Desnaturalización. Se separan ambas hebras de DNA molde para que se puedan unirlos cebadores a su secuencia en el paso siguiente. Necesitamos aumentar latemperatura a 95º C (30-60’’).2. Hibridación o anillamiento. Debe ser específica entre la hebra molde y el cebador.Cuanto más tiempo se deje, más probable es que el anillamiento sea inespecífico.También es importante la temperatura, lo bastante alta para que la unión seaespecífica y lo bastante baja para que sea estable, y es de unos 45-65º C (30-60’’).3. Replicación. Se inicia la elongación de la hebra de interés. Se lleva a cabo de formasimilar a una replicación de DNA estándar. Oscila entre 25-40 ciclos de temperaturas yse lleva a cabo a una temperatura de 68-72 ºC.5
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