Tema 7. TECNICAS BASICAS DE BM.pdf - VeoApuntes.com

Alberto Gómez Esteban & Laura del Olmo Cuantificación de cargas microbianas en alimentos. Detección de citopatógenos en la industria agraria, especialmente en plantas que vandestinadas a grandes plantaciones para el consumo humano.Aplicaciones relacionadas con la clínica médica: Cuantificación de las cargas virales de hepatitis B o VIH. Muy importante paraconocer su eficacia exacta, la cual se puede averiguar cuantificando las cargas virales.Si estos virus disminuyen será que la carga es la adecuada. Cuantificación de la expresión génica: REAL TIME – Q – PCR (RT-Q-PCR). Paracuantificar la expresión génica necesitamos partir de todo el RNA (mRNA) del tejidoque se esté estudiando. Lo extraemos, lo pasamos a cDNA mediante laretrotranscripción y éste se podrá cuantificar de 2 maneras:I. En valores absolutos, empleando rectas de calibrado.II.En valores relativos, empleando un gen de referencia denominado genHouseKeeping, que codifica por una proteína cuya función es básica y que seva a expresar siempre en todas las situaciones fisiológicas (ej.: glicerofosfatoDH). Considerando a este gen como la expresión basal lo comparamos con laexpresión del gen que queremos estudiar para ver si la expresión estáaumentada o disminuida.Mide cambios en la fluorescencia relacionados con el producto de PCR que estásaliendo. Realmente lo que se compara son cantidades de fluorescencia.B. PCR a Tiempo Real CUALITITAVA: genotipan una muestra.- Objetivo: genotipar una muestra, es decir, averiguar su secuencia y qué nucleótidohay en una posición concreta. En prácticas lo hacíamos acoplando una reacciónenzimática con enzimas de restricción o con técnicas de hibridación.- ¿Cómo se hace? Siempre realizando una curva de “melting” y monitorizando lafluorescencia. Con la curva de “melting” somos capaces de obtener diferencias entreun fragmento amplificado que contenga la mutación y otro que no la contenga, lo quese consigue monitorizando la fluorescencia (la cual suele ir disminuyendo; se obtienenpicos de fluorescencia que serán fáciles de interpretar: solo habrá 2, uno quecorresponde a la mutación y otro que corresponde al "wild type" o tipo salvaje).9