Tema 7. TECNICAS BASICAS DE BM.pdf - VeoApuntes.com

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Alberto Gómez Esteban & Laura del OlmoTécnicas básicas Extracción de ácidos nucleicosLos ácidos nucleicos se sacan o bien de muestras de tejidos o de fluidos, aunque la técnica esdistinta según de donde provenga nuestra muestra. Podemos extraer muestras de:• Tejido hepático• Tejido muscular• Tejido intestinal• Sangre periférica• Tejidos tumorales• Piel• Raíz de pelo• Saliva• Exudados bucales• Exudados vaginales• Medula ósea• Huesos• Pulpa de dientes• Semen• Liquido amniótico• Liquido cefalorraquídeo• OtrosLas técnicas de extracción sirven tanto para la extracción de DNA <strong>com</strong>o para la de RNA, con ladiferencia que para trabajar con RNA es preciso la extracción en frío o con estabilizadores deRNA.Utilizamos el RNA para cuantificar la expresión de un RNA mensajero y por tanto laexpresión de determinadas proteínas, y cuantificar las respuestas celulares a determinadascircunstancias (diabetes, gestación…).Hemos de seguir un determinado protocolo:1. Lisis celular2. Precipitación de proteínas3. Centrifugación y separación de la fase acuosa con ácidos nucleicos4. Precipitación de DNA con alcoholes orgánicos ElectroforesisLa electroforesis se basa en la cualidad que tienen los ácidos nucleicos de desplazarse en unmedio con carga con una velocidad inversamente proporcional a su tamaño (esto es, losDNA grandes van mas despacio).Los ácidos nucleicos tienen carga negativa y por eso se desplazan hacia el catión (+).2
Alberto Gómez Esteban & Laura del OlmoLos soportes utilizados tienen naturaleza de gel y pueden ser para ácidos nucleicos:• Agarosa • PoliacrilamidaNos permite separar fragmentos de tamaño parecido variando las concentraciones deagarosa o poliacrilamida. Cuanto mayor sea la concentración del gel, mayor será la capacidadde separación, de resolver entre dos fragmentos de tamaño muy similar.Antes los geles de secuenciación que diferenciaban fragmentos con 1 nucleótido de diferenciaeran de poliacrilamida, hoy se hace de otra manera con base electroforética quedescribiremos a continuación en esta misma unidad.Antes de realizar la electroforesis, el DNA irá disuelto en un colorante para cargarsatisfactoriamente los pocillos, pero no tiene afinidad por el DNA, por lo tanto una vez hemosllevado a cabo la electroforesis debemos usar un colorante que sea físicamente afín por elDNA para observar el bandeado.Los más utilizados son:• Poliacrilamida. Utilizamos el nitrato de plata.• Agarosa. Utilizamos bromuro de etidio.Ambos son agentes intercalantes del DNA y por tanto muy citotóxicos por lo que requierennumerosas normas de seguridad, a pesar de ello, aportan una resolución estupenda delbandeado.La electroforesis sirve para: Evaluar la cantidad y calidad (integridad) del DNA extraído de una muestra. Valorar el resultado de una PCR Observar el resultado de una digestión enzimática con enzimas de restricción (técnicadel fingerprinting) Análisis de restricciónEsta técnica aprovecha la capacidad natural de las endonucleasas de restricción presentes deforma natural en células procariotas de escindir los enlaces fosfodiéster de la cadena deácidos nucleicos.Lo más importante de estas enzimas es su gran especificidad a la hora de reconocer unasecuencia concreta diana dentro del DNA bicatenario que nos permiten cortar la molécula deDNA.Esta técnica es precisa entre otras cosas para construir plásmidos artificiales, ya que lasenzimas de restricción dejan extremos cohesivos en el DNA al cortar en zigzag.3
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