Tema 7. TECNICAS BASICAS DE BM.pdf - VeoApuntes.com

Alberto Gómez Esteban & Laura del OlmoPero este intercalante NO será capaz de distinguir cambios en un Nt, y estos cambiosprovocan que la tª o punto de "melting" no sea la misma para un cambio en un Nt, ya que latª a la cual tengo que llegar cuando hay una G es superior a cuando hay una A (por lospuentes de H).El SYBR Green sirve para cuantificar y para ahorrar la electroforesis de después, puesestamos obteniendo temperaturas de “melting” que corresponden con mi fragmento deamplificación, por tanto sé que he obtenido un producto amplificado y sé que es el quequiero, pero NO somos capaces de genotiparlo/obtener su secuencia (esto se hará consondas, ya que los cambios que se producen cuando tengo las sondas unidas al producto dePCR son suficientemente grandes en las temperaturas de "melting" como para ser detectadas).Como ya hemos explicado anteriormente, los valores de fluorescencia van disminuyendo amedida que se aumenta la tª. El producto de PCR se va desnaturalizando poco a poco y lasfluorescencias obtenidas van disminuyendo y se van registrando continuamente, lo que nosda lugar a las curvas.Habrá diferencias en la curva de fluorescencia según la secuencia que tenga nuestroproducto, y al hacer la primera derivada obtendremos unos picos que nos permitirándiferenciar un genotipo salvaje o “wild type” de uno mutado, y si es mutado nos permitirádistinguir entre homocigoto o portador heterocigoto.‣ “HIGH RESOLUTION MELTING” (HRM): ES CAPAZ DE REGISTRAR CAMBIOS DEFLUORESCENCIA CUANDO SOLO CAMBIA UN NT.Haciendo la HRM con sondas somos capaces de genotipar, de separardistintas temperaturas de “melting” debidas a cambios en nucleótidos.Hay una nueva técnica, la High Resolution Melting (HRM), que consiste en utilizar un agenteintercalante fluorescente equivalente al SYBR Green pero a modo de saturación, es decir, seintercala en cada pb, a diferencia del SYBR Green que se intercala a saltos.Al hacer la HRM SÍ seremos capaces de genotipar, pues obtendremos en función de lasecuencia de Nt que tenga el fragmento amplificado, distintos cambios de fluorescencia.13