Tema 7. TECNICAS BASICAS DE BM.pdf - VeoApuntes.com

Alberto Gómez Esteban & Laura del Olmo‣ Procedimiento:1) Añadimos un didesoxi terminador diferente a cada tubo:- T1: didesoxi con A (dd-A)- T2: didesoxi con T (dd-T)- T3: didesoxi con C (dd-C)- T4: didesoxi con G (dd-G)2) Comienza la reacción, se une el cebador y la polimerasa comienza la elongación.Con esa mezcla de nucleótidos la adenina con didesoxi compite con la adenina normal ycuando se mete en la cadena hace que pare la reacción. Según la dd-A se meta antes odespués obtenemos fragmentos de distinto tamaño, todos terminados en A. En cada uno delos otros tubos ocurrirá lo mismo.3) A continuación marcamos con un color diferente cada didesoxi, es decir, esenucleótido terminador didesoxi va tener un color diferente según sea dd-A, dd-T, dd-Co dd-G.4) Hacemos una electroforesis capilar y obtendremos fragmentos de distinto tamañoque llegaran a una determinada distancia (los más pequeños llegan antes al final delcapilar y los de tamaño mayor se quedarán al final). Juntamos los resultados de los 4tubos y como tienen distinta longitud nos van a dar un patrón de bandeo para asípoder descifrar el orden de nucleótidos que hay en la secuencia.La electroforesis que vamos a realizar ahora es a través de un capilar (no de un gel). El tubocon todo lo que necesitamos (incluidos los 4 didesoxiterminadores marcados con fluoróforosdistintos) van a generar fragmentos de distintos tamaño. Con la electroforesis los fragmentosse ordenan en tamaño y al salir del capilar hay un láser de argón que excita a los fluoróforoscon los que he marcado los didesoxi, dándonos un cromatograma, es decir, picos de coloressegún en qué didesoxiterminador acabe el fragmento (dd-A = color rojos, dd-T = color azul…).Con este procedimiento podremos identificar el cambio en un nucleótido, es decir, podemosdistinguir una mutación en el “wildtype”.Solo podemos secuenciar unos 1000 nucleótidos seguidos, porque habrá unmomento en el que el cromatograma no podrá resolverlo.15