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3. Cubrir los pocillos e incubar 30 minutos a temperatura ambiente en una superficie plana . El tiempo deincubación empieza después de la adición de la última muestra.4. Lavado: Aspirar el contenido de cada pocillo. Agregar 200-300µl de solución de lavado a todos pocillos yaspirar. Repetir esta secuencia dos veces más para un total de tres lavados. Invertir la placa y golpearlasuavemente en material absorbente para eliminar cualquier fluido residual tras el último lavado. Es importanteque cada pocillo esté completamente vacío después de cada paso de lavado. Mantener la misma secuenciapara la aspiración que la usada para la adición de muestras.5. Agregar 100µl de Conjugado IgG β 2 HRP a cada pocillo. El conjugado debe pipetearse en las condiciones másasépticas posibles y siguiendo buenas técnicas de laboratorio. Aspirar solamente la cantidad de conjugadonecesaria para el ensayo. PARA EVITAR CUALQUIER CONTAMINACIÓN POTENCIAL MICROBIANA Y/OQUÍMICA, NUNCA DEVOLVER EL CONJUGADO SIN USAR A SU RECIPIENTE ORIGINAL. Incubar lospocillos 30 minutos como en el paso 3.6. Lavado: Repetir el paso 4.7. Agregar 100µl de Cromógeno TMB a cada pocillo e incubar 30 minutos en oscuridad a temperatura ambiente.8. Agregar 100µl de Solución de parada a cada pocillo. Mantener la misma secuencia y temporalización que laefectuada en la adición de Cromógeno. Agitar suavemente la placa para mezclar bien los pocillos.9. Leer la absorbancia (DO) de cada pocillo a 450nm en un plazo máximo de una hora. Si se desea seguir elmétodo de lectura bicromática puede utilizarse 620 nm como longitud de onda de referencia.Control de Calidad1. Los controles Control β 2 GPI IgG ELISA, Calibrador A β 2 GPI IgG ELISA y Control Negativo ELISA debenprocesarse con cada lote de muestras para asegurar que todos reactivos y procedimientos funcionancorrectamente.2. El usuario debe notar que debido a que los controles Control β 2 GPI IgG ELISA, Calibrador A β 2 GPI IgG ELISAy ELISA Negativo son prediluidos, no controlan procedimientos asociados con dilución de especímenes.3. Pueden añadirse controles adicionales según las directivas o requisitos del laboratorio. Pueden prepararsecontroles válidos haciendo alícuotas de un “pool” de suero humano que debe almacenarse a < -20°C.4. Para considerar válidos los resultados deben considerarse satisfechos todos los criterios especificados acontinuación, si alguno de ellos no se cumple la prueba debe considerarse inválida y repetirse.a. La absorbancia del control Calibrador A β 2 GPI IgG ELISA debe ser superior a la del Control β 2 GPI IgGELISA y la de este debe ser superior a la del control negativo.b. El control Calibrador A β 2 GPI IgG ELISA debe tener una absorbancia mayor que 1.0 mientras que ladel control negativo no debe exceder de 0.2.c. La absorbancia del Control β 2 GPI IgG ELISA debe ser superior al doble del control negativo, u oscilarentre 0.25.d. La concentración del Control β 2 GPI IgG ELISA debe estar dentro del rango especificado en la etiqueta.e. El usuario puede referirse al documento CLSI (Anteriormente NCCLS) C24-A2 para una guía adicionalacerca de buenas prácticas de laboratorio.Cálculo de Resultados1. Determinar el promedio de todos los resultados duplicados.2. Marque la absorbancia media de la curva del Calibrador para los ensayos de IgG sobre sus gráficas deconcentraciones. Utilice papel de registro de curva de mejor ajuste. Como alternativa, también puede utilizarpapel log/log. Las unidades SGU asignadas a los calibradores figuran impresas en los viales.3. Determine la concentración desconocida de β 2 GPI IgG en unidades estándar de β 2 GPI IgG (SGU) a partir deleje "X" leyendo la absorbancia correspondiente en el eje "Y". El Calibrador y el Control para este kit se basanen los estándares de referencia de β 2 -Glicoproteína I de tipo IgG.4. Los valores negativos van desde 0 a 20 unidades. Los valores se consideran positivos a partir de 20 SGU.Interpretación de los ResultadosLa técnica ELISA es muy sensible y es capaz de detectar pequeñas diferencias entre poblaciones de pacientes. Losvalores presentados a continuación son sólo valores sugeridos. Cada laboratorio debe establecer su propio rangonormal basado en su propia metodología, controles, equipo y población de pacientes.1. Un resultado positivo indica la presencia de anticuerpos anti-β 2 GPI IgG y sugiere la posibilidad de lupuseritematoso sistémico (LES) u otras afecciones similares al lupus.2. Un resultado negativo indica la ausencia de anticuerpos anti-β 2 GPI IgG o niveles inferiores al punto de cortedel ensayo.3. Se sugiere que los resultados informados por el laboratorio incluyan la afirmación “Los siguientes resultados seobtuvieron con el kit INOVA QUANTA Lite® β 2 GPI IgG ELISA. Los valores obtenidos con kits de diferentesfabricantes pueden variar y no pueden intercambiarse entre ellos. La magnitud de los niveles informados de IgGno puede correlacionarse con un punto final”.Limitaciones del Procedimiento1. Actualmente, se está estudiando la relevancia clínica de los anticuerpos anti-β 2 GPI en lo que se refiere a otrasenfermedades distintas del LES.2. Cuando los resultados de los tests de anticuerpos anti-β 2 GPI resultan negativos en presencia de evidenciasclínicas, se aconseja la realización de tests de anticoagulante lúpico, de anticardiolipina o de cualquier otro tipoque se considere conveniente.3. El diagnóstico no debería basarse únicamente en los resultados del test de anticuerpos anti-β 2 GPI. Losresultados deben interpretarse en combinación con pruebas físicas.4. El tratamiento no debería basarse únicamente en un resultado positivo del test de anticuerpos anti-β 2 GPI.Debe contarse también con otras evidencias clínicas.5. Existe la posibilidad de que algunas muestras den positivo para los tests de anticardiolipina pero negativo paralos de anticuerpos anti-β 2 GPI. El test de anticuerpos anti-β 2 GPI resulta más específico para determinar laexistencia de un riesgo de trombosis. El test de anticardiolipina puede proporcionar resultados positivos falsosdebido a la interacción con el ADN de doble cadena o los anticuerpos de ciertas enfermedades infecciosas.6. La funcionalidad del ensayo no ha sido establecida para matrices diferentes del suero.4
Valores EsperadosMuestras de taller – 7º Simposio Internacional sobre Anticuerpos Antifosfolípidos – Nueva OrleansComo parte del 7º simposio sobre Antifosfolípidos celebrado del 9 al 13 de octubre de 1996, se realizó un taller deestandarización con el objetivo de evaluar el comportamiento de varios tests de anticardiolipina basados eninvestigaciones y otros tests de uso comercial. Con las muestras disponibles se probó el kit QUANTA Lite® β 2 GPI IgGELISA. Se incluyeron 10 muestras de pacientes con evidencias documentadas de síndrome antifosfolípidos (SAFL), 7muestras de pacientes con enfermedades infecciosas como la sífilis y la fiebre Q, 2 muestras de pacientes conenfermedades autoinmunes de carácter reumático y 11 muestras normales. Las muestras también se probaron con unensayo tradicional de anticardiolipina. Los resultados se muestran a continuación.Grupo Núm. Núm. + Núm. +Muestras β 2 GPI CardiolipinaSAFL 10 10 10Enfermedades infecciosas 7 0 4Enfermedades reumáticas 2 1 2Normales 11 0 1Los 10 pacientes con SAFL dieron positivo tanto para el test de β 2 GPI como para el de cardiolipina. De los otros tresgrupos de pacientes, todas las muestras dieron negativo para el test de β 2 GPI excepto las de 1 paciente conenfermedades reumáticas. Cuatro muestras del grupo de pacientes con enfermedades infecciosas, las dos de pacientescon enfermedades reumáticas y 1 de las muestras de pacientes normales dieron positivo con el test tradicional deanticuerpos anticardiolipina.Características específicas de rendimientoResumen de los estudios clínicosEl rendimiento del test QUANTA Lite® β 2 GPI IgG ELISA fue evaluado mediante 1 estudio clínico interno y 4 estudiosexternos. Los resultados se muestran en la siguiente tabla.Grupo de pacientes Número Núm. de positivos (%)SAFL* causada por LES 37 36 (97.2)SAFL primario 15 14 (93.3)LES 34 2 (5.8)Artritis reumatoide 17 0 (0)Polihipergammaglobulinemia 7 0 (0)Enfermedades infecciosas** 81 0 (0)Normales 256 1 (0.4)*SAFL = Síndrome antifosfolípidos** La mayoría de ellos dieron positivo en las pruebas serológicas para el diagnóstico de la sífilisTomando como base los resultados anteriores, el test de β 2 GPI tiene una sensibilidad clínica del 96.2% y unaespecificidad clínica del 99.6%.Sensibilidad y Especificidad RelativasConcordancia con el ensayo de anticardiolipinaDe entre las muestras de suero presentadas a un importante laboratorio de referencia para el diagnóstico deanticuerpos anticardiolipina, 40 fueron seleccionadas aleatoriamente y sometidas a tests de anticuerpos IgGanticardiolipina y anti-β 2 GPI. Los resultados se resumen a continuación.β 2 GPI+ -+ 5 19 Sensibilidad relativa 20.8%Cardiolipina Especificidad relativa 100.0%- 0 16 Eficiencia relativa 52.5%Cinco de las muestras dieron positivo con ambos métodos y 16 dieron negativo también con ambos métodos. No seencontró ninguna muestra que diera positivo en los tests de anticuerpos anti-β 2 GPI y negativo en los de anticuerposanticardiolipina. Diecinueve muestras dieron positivo en los tests de anticuerpos anticardiolipina y negativo en los deanticuerpos IgG anti-β 2 GPI. En este sencillo estudio comparativo, en el que se trataron muestras de pacientes sinantecedentes clínicos seleccionadas aleatoriamente, la sensibilidad relativa de los resultados de anticuerpos IgG anti-β 2GPI fueron menores en comparación con los del ensayo de anticuerpos IgG anticardiolipina. Sin embargo, estosresultados eran esperados. Los ensayos tradicionales de anticardiolipina detectan los anticuerpos anti-β 2 GPI, así comoaquellos anticuerpos que reaccionan con los propios fosfolípidos. Como se demostró en el citado taller realizado enNueva Orleans y en el Resumen de los Estudios Clínicos, el ensayo de β 2 GPI muestra una sensibilidad similar y unaespecificidad mayor en comparación con los resultados de anticardiolipina de pacientes con antecedentesdocumentados de SAFL.5
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